авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 || 3 |

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ» РАМН На правах рукописи ...»

-- [ Страница 2 ] --

Для оценки степени фрагментации ДНК и расчета индекса апоптоза был использован метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (ДНК комет) [11, 136]. Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель: в постоянном электрическом поле ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода состоит из следующих этапов: выделения клеток, получения гель-слайдов (подложки), получения микропрепаратов, лизиса, щелочной денатурации, электрофореза, фиксации, окрашивания и микроскопического анализа.

Получение микропрепаратов. Клетки выделяли методом механической дезагрегации тканей, для этого 150-200 мг ткани измельчали на льду, переносили в стеклянные пробирки, содержащие буфер для суспензии клеток (0,1 М ФСБ, мМ ЭДТА, 10% ДМСО, рН 7,4), дважды отмывали от клеток крови, и раздавливали стеклянной палочкой в свежем буфере. Гель-слайды получали путем нанесения 1%-го агарозного геля (агароза, тип 4, tпл. 60 С) на стандартные предметные стекла (Menzel-Glaser®, 7626 мм). Для подготовки микропрепаратов 60 мкл клеточной суспензии переносили в микроцентрифужные пробирки, содержащие 240 мкл 1%-ого агарозного геля (агароза, тип 1, tпл. 42 С), тщательно перемешивали, наносили на гель-слайды при температуре 42 С и оставляли на мин при 4 С на льду. После затвердевания геля микропрепараты подвергали лизису в буфере (2,5 M NaСl, 100 мМ ЭДТА, 10мМ Трис, 0,14 М ДМСО, 1% Тритон Х-100, рН 10) в течение 1 ч при температуре 4 С, в процессе которого происходила диссоциация клеточных структур и выпетливание хроматина в поры агарозы. Далее микропрепараты обрабатывали щелочным денатурирующим буфером (1 мМ ЭДТА, 300 мМ NаОН, рН 13) в течении 20 мин при температуре 4 С, реализирующим щелочно-лабильные сайты в ДНК в однонитевые разрывы. Для электрофореза также использовали щелочной денатурирующий буфер, электрофорез проводили в электрофорезной камере (Bio-Rad 192) в течение 40 мин (4 С, напряжение 32 В, сила тока 300 мА). Под влиянием электрического поля, ДНК (в виде фрагментов и петель сверхполимерных молекул) мигрирует к аноду, формируя хвост кометы, ядром которой является полость, заполненная ДНК. После завершения электрофореза слайды фиксировали в 70% растворе этанола.





Микроскопический анализ проводили на микроскопе Zeiss Axio Imager Z при увеличении 400х. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system, «Metasystems GmbH» (рис. 3). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте).

Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы 30%.

С каждого микропрепарата анализировали не менее 200 клеток и рассчитывали индекс апоптоза (ИА) по формуле:

А+ ИА = % клеток где А+ – количество апоптоз-положительных клеток.

Рисунок 3. Клетки печени крысы с различной степенью поврежденности ДНК.

a-клетка без повреждений (до 1% поврежденной ДНК), b-клетка с некоторыми повреждениями (до 10% поврежденной ДНК ), c-клетка со значительными повреждениями (до 30% поврежденной ДНК), d-апоптоз-положительная клетка (более 30% поврежденной ДНК).

2.6. Статистическая обработка результатов исследований Обработка результатов исследования выполнена с использованием пакета программ прикладного статистического анализа StatSoft STATISTICA 8.0. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью 2-критерия.

Проверка гипотезы о равенстве дисперсий проводилась с помощью критерия Левена. Вычисляли среднее значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (m). Данные представлены как M±m.

Сравнение количественных признаков двух независимых выборок, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий критерия ANOVA. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (p) принимали равным 0, [26].

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Сравнительная характеристика методов определения активности апоптоза у крыс на экспериментальных моделях токсического воздействия 3.1.1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона Изучены изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза – содержание белков Bcl-2, Bax и p53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.

После введения АКТГ у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо патологических проявлений. На вскрытии также не было выявлено каких-либо макроскопических изменений внутренних органов, массы внутренних органов крыс контрольной и опытных групп не имели статистически значимых различий на всех сроках отбора материала (табл. 10).

Результаты исследований уровня апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг представлены в табл. 11-13.

Как видно из табл. 11, после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг, содержание белков Bcl-2, Bax и p53 в печени крыс опытной группы не отличалось от контрольных значений на всех сроках отбора материала.





Через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг отмечено повышение содержания белка Bcl-2 на 61% (p0,05) по сравнению с контрольным уровнем, содержание данного белка через 6 и 12 часов не имело различий с контролем.

Содержание белков Bax и p53 не отличалось от контрольных величин на всех сроках отбора материала.

Таблица Масса внутренних органов крыс после введения АКТГ Доза АКТГ Контроль Показатели 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч абс.1 10,18±0,15 9,95±0,26 10,38±0,31 10,99±0,36 10,50±0,26 10,32±0,37 11,71±0, Min-Max 9,41-10,79 8,32-11,01 8,90-12,34 9,11-12,93 9,36-12,20 8,92-12,97 9,68-13, Печень отн.2 2,49±0,03 2,48±0,05 2,49±0,05 2,53±0,06 2,62±0,06 2,53±0,04 2,99±0, Min-Max 2,29-2,59 2,25-2,76 2,30-2,85 2,20-2,93 2,27-2,89 2,40-2,75 2,64-3, 2,86±0,07 2,79±0,09 2,78±0,18 2,84±0,10 2,80±0,03 2,72±0,08 2,96±0, абс.

Min-Max 2,48-3,28 2,38-3,26 1,10-3,01 2,50-3,32 2,62-2,90 2,36-3,09 2,75-3, Почки 0,71±0,02 0,69±0,02 0,65±0,05 0,65±0,02 0,69±0,01 0,67±0,01 0,69±0, отн.

Min-Max 0,60-0,82 0,60-0,77 0,45-0,75 0,56-0,73 0,61-0,80 0,60-0,70 0,61-0, 0,61±0,02 0,56±0,04 0,53±0,04 0,51±0,04 0,54±0,02 0,50±0,02 0,61±0, абс Min-Max 0,35-0,50 0,41-0,88 0,36-0,80 0,36-0,68 0,43-0,62 0,37-0,62 0,30-0, Тимус 0,10±0,01 0,14±0,02 0,13±0,02 0,12±0,01 0,13±0,01 0,12±0,02 0,14±0, отн.

Min-Max 0,06-0,12 0,10-0,21 0,10-0,21 0,09-0,15 0,12-0,17 0,10-0,14 0,07-0, 2,01±0,03 2,01±0,04 1,98±0,04 1,92±0,04 2,00±0,05 1,95±0,06 1,89±0, абс.

Min-Max 1,86-2,17 1,85-2,25 1,82-2,33 1,71-2,21 1,73-2,17 1,61-2,22 1,75-2, Мозг 0,49±0,01 0,50±0,01 0,50±0,01 0,49±0,01 0,54±0,01 0,47±0,01 0,48±0, отн.

Min-Max 0,44-0,53 0,47-0,53 0,47-0,56 0,39-0,56 0,46-0,60 0,01-0,02 0,39-0, Абсолютная масса внутренних органов, М±m, г;

Относительная масса внутренних органов, М±m, г/100 г массы тела * отличия от контроля достоверны при p0,05 (n=10).

Таблица Содержание Bcl-2, Bax и p53 белков в печени крыс после введения АКТГ Доза АКТГ Содержание Контроль 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела белков, % 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 2,34±0,47 2,19±0,54 2,55±0,73 2,17±0,56 2,55±0,79 2,04±0,65 3,77±0,49* M±m Bcl- Min-Max 1,25-3,54 1,55-4,06 1,48-3,99 1,13-4,05 1,62-3,39 1,09-3,57 3,16-4, 1,89±0,57 1,83±0,38 1,78±0,47 2,04±0,71 2,28±0,48 2,01±0,36 1,90±0, M±m Bax Min-Max 1,14-3,87 0,98-2,47 1,15-3,05 1,47-3,04 1,18-3,15 1,55-3,67 1,14-3, 2,20±0,53 1,89±0,67 1,97±0,48 2,16±0,45 2,27±0,44 2,45±0,71 2,13±0, M±m p Min-Max 1,47-3,18 1,07-3,51 1,27-3,55 1,43-3,24 1,69-4,05 1,55-3,47 1,24-2, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, После введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела не наблюдалось изменений активности каспазы-3 в печени, почках, головном мозге и костном мозге крыс на всех сроках отбора материала. Достоверное возрастание активности каспазы- отмечено в тимусе (на 31%) через 24 часа после введения АКТГ.

После введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг было отмечено достоверное увеличение активности каспазы-3 в почках (через 12 часов – на 45%, через 24 часа – на 29%) и тимусе (через 24 часа – на 19%). Изменений активности каспазы-3 в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.

Таблица Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения АКТГ Доза АКТГ Активность Контроль 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела каспазы-3, пмоль/мин/мг белка 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 23,07±1,02 22,91±1,08 22,04±1,21 23,83±1,01 22,57±0,91 23,78±0,73 22,08±0, M±m Печень 19,15-27,43 18,54-27,91 18,14-26,78 19,47-27,01 17,54-26,55 18,31-26,55 17,34-29, Min-Max 8,89±0,27 8,97±0,31 9,13±0,21 8,80±0,19 8,94±0,41 12,87±0,48*11,47±0,37* M±m Почки 7,24-10,08 7,55-10,76 8,14-10,53 8,02-10,15 8,34-11,04- 9,07-14,57 9,22-13, Min-Max 5,31±0,19 5,21±0,17 5,73±0,29 6,97±0,14* 5,35±0,14 5,34±0,12 6,34±0,27* M±m Тимус 4,65-6,14 4,87-5,97 5,23-6,27 5,65-8,13 4,48-6,91 4,77-6,52 5,21-7, Min-Max 0,07±0,01 0,08±0,01 0,09±0,02 0,09±0,02 0,10±0,02 0,09±0,01 0,07±0, M±m Мозг 0,06-0,08 0,06-0,09 0,06-0,11 0,08-0,12 0,08-0,12 0,08-0,09 0,07-0, Min-Max 2,41±0,12 2,38±0,16 2,43±0,24 2,27±0,29 2,63±0,13 2,57±0,15 2,68±0, M±m Костный мозг 2,12-2,87 2,10-2,71 2,18-2,85 2,05-2,78 2,33-2,98 2,29-3,06 2,45-3, Min-Max Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Таблица Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения АКТГ Доза АКТГ Степень Контроль фрагментации 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела ДНК, % ДНК 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 7,08±0,15 7,33±0,11 7,12±0,09 7,31±0,14 6,95±0,09 7,10±0,13 7,14±0, M±m Печень Min-Max 6,28-7,78 6,55-8,04 6,23-7,61 7,04-8,07 6,31-7,55 6,83-7,39 6,77-7, 7,32±0,29 7,15±0,21 7,35±0,31 8,18±0,21* 7,68±0,21 8,15±0,21* 8,27±0,17* M±m Почки Min-Max 7,02-7,91 6,83-7,79 6,51-8,05 7,75-8,43 7,19-8,09 7,39-8,61 8,01-8, 8,83±0,21 8,77±0,17 8,66±0,18 8,69±0,20 9,02±0,14 9,58±0,19* 9,87±0,21* M±m Тимус Min-Max 8,45-9,22 8,47-9,14 8,34-9,08 8,41-8,95 8,68-9,35 9,05-9,84 9,56-10, 5,34±0,11 5,14±0,13 5,27±0,09 5,18±0,12 5,27±0,08 5,39±0,10 5,19±0, M±m Мозг Min-Max 5,06-5,61 4,98-5,42 5,01-5,58 4,87-5,69 5,04-5,62 5,11-5,74 4,93-5, 8,31±0,24 8,19±0,24 8,26±0,17 8,51±0,23 8,21±0,16 8,33±0,20 8,41±0, M±m Костный мозг Min-Max 7,89-8,73 7,02-8,68 7,95-8,59 8,03-9,06 7,88-8,69 8,08-8,71 8,07-8, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Как видно из табл. 13-14, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг в целом соответствовал характеру изменений активности каспазы-3 (табл. 11): достоверное повышение уровня фрагментации ДНК отмечено в почках (через 12 часов – на 11%, через 24 часа – на 13%) и тимусе (через 12 часов – на 8%, через 24 часа – на 12%);

достоверное повышение индекса апоптоза отмечено в почках (через 12 часов – на 46%, через 24 часа – на 38%) и тимусе (через 12 часов – на 28%, через 24 часа – на 27%). Изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.

Характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг несколько отличался от изменений активности каспазы-3: достоверное возрастание уровня фрагментации ДНК отмечено в почках (на 12%) через 24 часа после введения АКТГ, индекса апоптоза на 35%, тогда как изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе не выявлено на всех сроках отбора материала. Также не наблюдалось изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс на протяжении всего периода исследований.

Таблица Индекс апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ Доза АКТГ Индекс апоптоза, Контроль 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела % ДНК 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 0,88±0,03 0,84±0,03 0,88±0,03 0,81±0,04 0,84±0,04 0,85±0, 0,84±0, M±m Печень 0,73-1,05 0,74-0,94 0,71-0,99 0,67-0,98 0,70-1,02 0,72-1, Min-Max 0,75-1, 1,07±0,04 1,13±0,11 1,51±0,13* 1,10±0,09 1,64±0,14* 1,54±0,10* 1,12±0, M±m Почки 0,87-1,28 1,02-1,29 1,35-1,79 0,89-1,25 1,34-1,89 1,28-1, Min-Max 0,92-1, 1,29±0,15 1,28±0,16 1,33±0,14 1,35±0,09 1,72±0,14* 1,71±0,13* 1,34±0, M±m Тимус 1,08-1,47 1,10-1,59 1,15-1,63 1,21-1,72 1,52-2,09 1,42-1, Min-Max 1,15-1, 0,54±0,05 0,61±0,05 0,58±0,03 0,62±0,04 0,63±0,05 0,60±0, 0,59±0, M±m Мозг 0,42-0,65 0,48-0,74 0,40-0,71 0,51-0,73 0,50-0,77 0,48-0, Min-Max 0,48-0, 1,09±0,12 1,14±0,14 1,09±0,11 1,15±0,08 1,09±0,13 1,11±0, 1,18±0, M±m Костный мозг 0,93-1,22 1,01-1,37 0,98-1,27 1,04-1,35 0,97-1,29 0,92-1, Min-Max 1,02-1, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Известно, что адренокортикотропный гормон (АКТГ), оказывает стимулирующее действие на кору надпочечников.

В большей степени его влияние выражено на пучковую зону, что приводит к увеличению образования глюкокортикоидов. Так, в работах Kerr и Willey, 1969-1972, посвященных изучению механизма гибели клетки путем апоптоза было показано значительное увеличение числа апоптотических клеток в тимоцитах при экзогенном введении АКТГ. В исследованиях [79] показано, что АКТГ-индуцированный апоптоз тимоцитов сопровождается увеличением уровня проапоптозного белка Вах;

АКТГ также способен увеличивать уровень мРНК некоторых каспаз, в том числе и каспазы- [57], однако в данном случае механизм индукции экспрессии генов неясен.

Моделирование токсического воздействия в эксперименте путем внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг массы тела приводит к увеличению активности апоптоза в тимусе и почках крыс, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе имеет сходный характер: значения этих показателей возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения АКТГ. Определение содержание белков Bcl-2, Bax и p53 не выявили какой-либо динамики: на всех сроках отбора проб содержание белков Bax и p53 оставалось в пределах контрольных значений, некоторое повышение содержания белка Bcl-2 через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг не позволяет расценивать этот факт, как свидетельство усиления процессов апоптоза: поскольку реализация апоптоза – комплексное явление, только комплексная реакция всех рассмотренных ключевых белков эффекторного этапа может быть принята как доказательство активации апоптоза.

Введение АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела через 24 часа приводит к повышению активности каспазы-3 в тимусе крыс и повышению уровня фрагментации ДНК и апоптозного индекса в почках крыс. Поскольку реакция изученных показателей на введение 4 МЕ/кг находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась от фонового уровня апоптоза, такая доза АКТГ не является предпочтительным индуктором апоптоза для постановки модельных экспериментов.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что показатели, характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24 часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптозауровень фрагментации ДНКактивность каспазы.

3.1.2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия CCl В исследованиях оценивали изменения показателей апоптоза через 6, 12, часа после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза – содержание белков Bcl-2, Bax и p53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.

После введения CCl4 у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено каких-либо макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований уровня апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,08 и 0,48 мг/кг представлены в табл. 16-19.

Таблица Масса внутренних органов крыс после введения CCl Доза CCl Контроль Показатели 0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч абс. 10,18±0,15 9,95±0,26 10,38±0,31 10,99±0,36 10,50±0,26 10,32±0,37 11,71±0,39* Min-Max 9,41-10,79 8,32-11,01 8,90-12,34 9,11-12,93 9,36-12,20 8,92-12,97 9,68-13, Печень отн.2 2,49±0,03 2,48±0,05 2,49±0,05 2,53±0,06 2,62±0,06 2,53±0,04 2,99±0,07* Min-Max 2,29-2,59 2,25-2,76 2,30-2,85 2,20-2,93 2,27-2,89 2,40-2,75 2,64-3, абс. 2,86±0,07 2,79±0,09 2,78±0,18 2,84±0,10 2,80±0,03 2,72±0,08 2,96±0, Min-Max 2,48-3,28 2,38-3,26 1,10-3,01 2,50-3,32 2,62-2,90 2,36-3,09 2,75-3, Почки отн. 0,71±0,02 0,69±0,02 0,65±0,05 0,65±0,02 0,69±0,01 0,67±0,01 0,69±0, Min-Max 0,60-0,82 0,60-0,77 0,45-0,75 0,56-0,73 0,61-0,80 0,60-0,70 0,61-0, абс 0,61±0,02 0,56±0,04 0,53±0,04 0,51±0,04 0,54±0,02 0,50±0,02 0,61±0, Min-Max 0,35-0,50 0,41-0,88 0,36-0,80 0,36-0,68 0,43-0,62 0,37-0,62 0,30-0, Тимус отн. 0,10±0,01 0,14±0,02 0,13±0,02 0,12±0,01 0,13±0,01 0,12±0,02 0,14±0, Min-Max 0,06-0,12 0,10-0,21 0,10-0,21 0,09-0,15 0,12-0,17 0,10-0,14 0,07-0, абс. 2,01±0,03 2,01±0,04 1,98±0,04 1,92±0,04 2,00±0,05 1,95±0,06 1,89±0, Min-Max 1,86-2,17 1,85-2,25 1,82-2,33 1,71-2,21 1,73-2,17 1,61-2,22 1,75-2, Мозг отн. 0,49±0,01 0,50±0,01 0,50±0,01 0,49±0,01 0,54±0,01 0,47±0,01 0,48±0, Min-Max 0,44-0,53 0,47-0,53 0,47-0,56 0,39-0,56 0,46-0,60 0,01-0,02 0,39-0, Абсолютная масса внутренних органов, М±m, г;

Относительная масса внутренних органов, М±m, г/100 г массы тела * отличия от контроля достоверны при p0,05 (n=10).

Как видно из табл. 15, при введении CCl4 в дозе 0,08 мг/кг, массы внутренних органов крыс опытной групп не отличались от аналогичных показателей у крыс контрольной группы на всех сроках отбора материала. При введении CCl4 в дозе 0, мг/кг, через 24 часа после введения CCl4 отмечено повышение массы печени у крыс опытной группы: абсолютной – на 15%, относительной – на 20%;

при этом массы почек, тимуса и головного мозга не имели значимых различий между группами.

Таблица Содержание Bcl-2, Bax и p53 белков в печени крыс после введения CCl Доза CCl Содержание Контроль 0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела белков, % 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 2,34±0,27 2,01±0,55 3,12±0,21* 3,03±1,05 4,74±0,62* 5,07±0,33* 4,18±0,76* M±m Bcl- Min-Max 1,86-2,68 1,53-2,88 2,68-3,87 2,75-3,79 4,08-5,62 4,13-6,08 3,67-6, 1,89±0,57 1,78±0,31 2,73±1,34 2,11±0,79 4,07±0,38* 4,70±0,64* 3,17±0,59* M±m Bax Min-Max 1,58-4,02 1,48-2,87 2,09-3,77 1,65-3,11 3,15-4,85 4,36-5,51 2,18-6, 2,20±0,53 2,43±0,67 2,19±0,66 2,15±0,44 3,07±0,52 4,15±0,27* 3,44±0,21* M±m p Min-Max 1,55-2,68 2,14-3,86 1,63-3,47 1,18-3,18 1,54-4,09 3,12-5,22 3,15-4, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Как видно из табл. 16, через 6 часов после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг не отмечалось повышения содержания белков Bcl-2, Bax и p53, через 12 часов зарегистрировано повышение содержания белков Bcl-2 (на 33%, p0,05) и Bax (на 44%, p0,05), содержание белка p53 не отличалось от контрольного уровня.

После введения CCl4 в дозе 0,48 мг/кг, повышение содержания белков Bcl-2, Bax и p53 отмечено на всех сроках отбора образцов: через 6 часов – на 103% (p0,05), 115% (p0,05) и 40% (p0,05);

через 12 часов – на 117% (p0,05), 149% (p0,05) и 89% (p0,05);

через 24 часа – на 79% (p0,05), 68% (p0,05) и 56% (p0,05), соответственно.

После введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела не наблюдалось изменений активности каспазы-3 в тимусе, мозге и костном мозге крыс на всех сроках отбора материала. Достоверное возрастание активности каспазы-3 отмечено в печени (на 48%) и почках (на 15%) крыс через 24 часа после введения CCl4.

После введения CCl4 в дозе 0,48 мг/кг было отмечено достоверное увеличение активности каспазы-3 в печени (через 6 часов – на 21%, через 12 часов – на 17%, через 24 часа – на 99%), почках (через 24 часа – на 27%) и костном мозге (через часа – на 60%). Изменений активности каспазы-3 в тимусе и головном мозге крыс не выявлено.

Таблица Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения CCl Доза CCl Активность Контроль 0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела каспазы-3, пмоль/мин/мг белка 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч M±m 23,07±1,02 22,9±1,08 24,38±1,12 34,12±1,27* 28,07±0,92* 27,01±1,09* 45,98±0,87* Печень Min-Max 19,15-27,43 17,0-25,0 22,0-29,0 26,0-39,0 24,0-33,0 24,0-34,0 37,0-51, 8,89±0,27 9,07±0,41 9,31±0,28 10,17±0,49* 9,53±0,44 9,89±0,61 12,09±0,34* M±m Почки Min-Max 7,24-10,08 8,13-10,15 8,15-10,85 9,22-10,67 9,03-10,83 8,78-10,78 11,06-12, 5,31±0,19 5,21±0,17 5,73±0,29 5,87±0, M±m 4,83±0,25 5,01±0,26 5,68±0, Тимус Min-Max 4,65-6,14 4,87-5,69 5,34-6,13 5,386,87- 4,07-6,00 4,14-5,89 4,78-6, 0,07±0,01 0,08±0,01 0,09±0,02 0,09±0, M±m 0,09±0,01 0,07±0,02 0,10±0, Мозг Min-Max 0,06-0,08 0,07-0,09 0,07-0,10 0,07-0,12 0,07-00,9 0,06,-0,09 0,09-0, 2,41±0,12 2,38±0,16 2,47±0,24 2,51±0,13 2,35±0,24 2,28±0,18 3,77±0,29* M±m Костный мозг Min-Max 2,12-2,87 1,87-2,67 2,19-2,88 2,31-2,79 2,15-2,69 2,08-2,67 2,95-4, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Как видно из табл. 18-19, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс в целом соответствовал характеру изменений активности каспазы-3 (табл. 17), однако изменения уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза проявлялись на более ранней стадии: после введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела достоверное возрастание уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза отмечено в печени через 12 и 24 часа: на 28 и 29%, и на 81 и 155%, соответственно. Также отмечено возрастание индекса апоптоза в почках – на 87 и 60% через 12 и 24 часа, соответственно. Не выявлено изменений уровня фрагментации ДНК в тимусе, почках, мозге и костном мозге, изменений индекса апоптоза – в тимусе, мозге и костном мозге.

Таблица Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения CCl Доза CCl Степень Контроль фрагментации 0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела ДНК, % ДНК 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 7,08±0,15 7,34±0,18 9,07±0,23* 9,14±0,14* 12,34±0,28*14,37±0,23*18,19±0,44* M±m Печень Min-Max 6,28-7,78 6,58-7,91 8,51-9,77 8,44-9,67 11,83-12,69 13,48-14,98 17,25-19, 7,32±0,29 7,43±0,21 7,29±0,16 7,38±0,21 7,69±0,12 8,42±0,24* 9,54±0,25* M±m Почки Min-Max 7,02-7,91 7,08-7,99 6,87-7,73 6,91-7,85 7,03-8,09 8,04-8,93 9,01-10, 8,83±0,21 8,71±0,18 8,64±0,15 8,89±0,22 8,71±0,18 8,64±0,15 8,89±0, M±m Тимус Min-Max 8,45-9,22 8,15-9,31 8,08-9,12 8,13-9,44 8,30-9,26 8,14-8,97 8,33-9, 5,34±0,11 5,14±0,09 5,21±0,12 5,17±0,08 5,14±0,09 5,21±0,12 5,17±0, M±m Мозг Min-Max 5,06-5,61 4,87-5,35 4,85-5,89 5,07-5,59 4,87-5,47 4,73-5,81 4,71-5, 8,31±0,24 8,24±0,31 8,09±0,18 8,16±0,15 8,05±0,17 9,24±0,21* 9,88±0,26* M±m Костный мозг Min-Max 7,89-8,73 7,73-8,69 7,59-8,67 7,73-8,71 7,13-8,61 8,75-10,08 9,12-10, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Таблица Индекс апоптоза в тканях крыс после введения CCl Доза CCl Индекс апоптоза, Контроль 0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела % ДНК 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч 0,84±0,05 0,98±0,18 1,52±0,23 * 2,15±0,31 * 1,53±0,24* 2,44±0,54 * 2,43±0,19 * M±m Печень Min-Max 0,75-1,03 0,78-1,24 1,14-1,87 1,69-2,54 1,28-1,79 2,04-3,19 1,98-2, 1,12±0,12 1,23±0,14 2,09±0,17 * 1,79±0,26 * 1,19±0,15 1,83±0,11 * 2,23±0,12 * M±m Почки Min-Max 0,92-1,34 1,07-1,43 1,78-2,34 1,51-2,13 0,98-1,44 1,48-2,08 2,01-2, 1,34±0,14 1,23±0,11 1,44±0,17 1,34±0,27 1,27±0,15 1,33±0,18 1,48±0, M±m Тимус Min-Max 1,15-1,54 1,08-1,48 1,21-1,68 1,14-1,57 1,09-1,67 1,17-1,67 1,28-1, 0,59±0,06 0,55±0,04 0,65±0,05 0,60±0,10 0,61±0,04 0,58±0,03 0,64±0, M±m Мозг Min-Max 0,48-0,67 0,42-0,64 0,53-0,78 0,51-0,74 0,48-0,72 0,46-0,71 0,53-0, 1,18±0,15 1,09±0,09 1,20±0,12 1,15±0,12 1,19±0,15 1,34±0,06* 1,48±0,04* M±m Костный мозг Min-Max 1,02-1,31 0,91-1,21 1,08-1,39 1,04-1,33 1,05-1,39 1,14-1,48 1,35-1, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, После введения CCl4 в дозе 0,48 мг/кг было отмечено достоверное повышение уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени (через 6 часов – на 74% и 82%, через 12 часов – на 102% и 190%, через 24 часа – на 156% и 189%), почках (через 12 часов – на 15% и 63%, через 24 часа – на 30% и 99%) и костном мозге (через 12 часов – на 11% и 14%, через 24 часа – на 19% и 22%). Изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе и мозге крыс не выявлено.

В проведенном исследовании изменение активности апотоза было выявлено преимущественно в печени и почках. Поскольку CCl4 является классическим гепатотропным агентом, то даже его непродолжительное поступление в организм животного способствует развитию жировой дистрофии печени, апотозу и некрозу [132]. В реализации молекулярных механизмов повреждения гепатоцитов ведущая роль принадлежит активным метаболитам и интермедиатам CCl4, образующимся в процессе его биотрансформации с участием цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ [13].

Как известно, одним из ранних проявлений патологического процесса при отравлении CCl4 является ядерное повреждение хроматина [10]. Установлено, что токсическое действие CCl4 связано в первую очередь с прооксидантным действием образующихся в процессе его метаболизма свободных радикалов – трихлорметильного CCl3* и высокореактивного трихлорметилпероксильного CCl3ОО*[13, 132]. Свободнорадикальные производные CCl4 способны инициировать процессы аутокаталитического липопереокисления, что приводит к нарушению физико-химических свойств мембран клеток печени. Взаимодействие образующихся радикалов CCl4 с ПНЖК фосфолипидов мембран инициируют перекисное окисление липидов (ПОЛ) с последующим развитием цепной реакции свободнорадикального окисления, что приводит к глубоким нарушениям функциональных свойств мембран – подавлению активности мембраносвязанных ферментов, выходу цитозольных ферментов в кровь, декомпартментализации кальция, и, в конечном итоге – к апоптозу и некрозу [13, 111]. Повреждение мембранных структур в свою очередь сопровождается модификацией активности большинства внутриклеточных ферментов, ослаблением антитоксической функции печени, нарушением синтетических процессов, разобщением тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования, снижением синтеза АТФ, развитием гипоксии, что в итоге на ранних этапах развития токсического действия может приводить к апоптозу гепатоцитов [88].

В настоящее время нет достоверных свидетельств действия четыреххлористого углерода на токсическое повреждение костного мозга, однако в работах [130, 160] отмечено, что моделирование токсического поражения печени в отдельных случаях может характеризоваться внепеченочными проявлениями такими как: эозинофилия, миалгия, поражение почек, легких и костного мозга. Поскольку печень представляет собой орган факультативного кроветворения и играет ведущую роль в межуточном обмене, токсическое поражение этого органа в большинстве случаев также вызывает поражение костного мозга в виде апластической анемии [81, 160].

Таким образом, моделирование токсического воздействия путем внутрибрюшинного введения тетрахлорметана приводит к увеличению активности апоптоза в печени, почках и костном мозге лабораторных животных, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза имеет сходный характер: значения этих показателей возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения CCl4. Динамика изменения содержания белков Bcl-2, Bax и p53 имеет иной характер, их содержание в печени начинает увеличиваться через 6 часов после введения CCl4, достигая максимальных значений через 12 часов и снижаясь через 24 часа. Следует отметить, что время реализации каждой стадии апоптоза не зависело от использованных доз воздействующего фактора: начало эффекторного этапа отмечено через 6 часов, максимальное развитие эффекторного этапа – через 12 часов, завершение эффекторного этапа и этап деструкции – через 24 часа. Полученные данные соответствуют современным представлениям о молекулярных механизмах регуляции апоптоза и времени реализации стадий апоптоза.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что показатели, характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24 часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптозауровень фрагментации ДНКактивность каспазы. Показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза (содержание белков Bcl-2, Bax и p53), по чувствительности сопоставимы с показателем индекса апоптоза, однако оптимальное время отбора образцов тканей для регистрации содержания данных белков составляет 12 часов после однократного воздействия.

3.2. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз CCl4 лабораторным животным В данной серии исследований оценивали динамику изменений показателей апоптоза через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозах 0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза – активность каспазы-3, а также этап деструкции – уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза.

После введения CCl4 у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено каких-либо макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований активности каспазы, уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тканях и органах крыс после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 представлены в табл. 20-22.

Таблица Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения CCl Доза CCl Активность каспазы-3, Контроль 0,04 мг/кг 0,02 мг/кг 0,01 мг/кг пмоль/мин/мг белка массы тела массы тела массы тела M±m 23,07±1,02 25,12±0,78 23,04±0,51 22,04±0, Печень Min-Max 19,15-27,43 24,08-26,55 22,13-23,87 21,37-22, M±m 8,89±0,27 9,47±0,37 8,94±0,26 8,88±0, Почки Min-Max 7,24-10,08 9,01-9,88 8,57-9,71 8,34-9, M±m 5,31±0,19 5,34±0,12 5,07±0,13 5,01±0, Тимус Min-Max 4,65-6,14 5,08-5,78 4,76-5,59 4,67-5, M±m 0,07±0,01 0,07±0,02 0,08±0,01 0,07±0, Мозг Min-Max 0,06-0,08 0,06-0,09 0,07-0,09 0,06-0, M±m 2,41±0,12 2,59±0,15 2,68±0,13 2,51±0, Костный мозг Min-Max 2,12-2,87 2,08-3,01 2,37-2,95 2,21-2, Представлены средние данные (М±m) от n = Как видно из табл. 20, активность каспазы-3 во всех исследованных органах крыс после введения CCl4 в дозах 0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела, не отличалась от контрольного уровня. Сравнение этих результатов с ранее представленными данными в табл. 17 указывают на то, что внутрибрюшинное введение CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела является минимально действующей дозой, вызывающей изменение активности каспазы-3 в печени крыс.

Достоверное повышение уровня фрагментации ДНК было выявлено в печени крыс после введения CCl4 в дозе 0,04 мг/100 г массы тела – на 6 и 16% (p0,05), соответственно. Других достоверных изменений степени фрагментации ДНК по результатам исследования, как это следует из таблиц 21 и 22 выявлено не было.

Таблица Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения CCl Доза CCl Степень фрагментации Контроль 0,04 мг/кг 0,02 мг/кг 0,01 мг/кг ДНК (% ДНК) массы тела массы тела массы тела M±m 7,08±0,15 7,51±0,11* 6,94±0,08 7,06±0, Печень Min-Max 6,28-7,78 7,21-7,87 6,65-7,29 6,74-7, 7,32±0, M±m 7,58±0,13 7,39±0,09 7,23±0, Почки Min-Max 7,02-7,91 7,18-7,89 7,21-7,95 7,11-7, 8,83±0, M±m 8,09±0,12 8,15±0,13 8,08±0, Тимус Min-Max 8,45-9,22 7,67-8,31 7,68-8,41 7,57-8, M±m 5,34±0,11 5,13±0,09 4,98±0,10 5,09±0, Мозг Min-Max 5,06-5,61 4,87-5,31 4,74-5,21 4,88-5, M±m 8,31±0,24 8,51±0,09 8,43±0,11 8,44±0, Костный мозг Min-Max 7,89-8,73 8,11-8,93 8,08-8,79 8,11-8, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Таблица Индекс апоптоза в тканях крыс после введения CCl Доза CCl Индекс апоптоза, Контроль 0,04 мг/кг 0,02 мг/кг 0,01 мг/кг % ДНК массы тела массы тела массы тела 0,98±0,04* 0,88±0,06 0,86±0, M±m 0,84±0, Печень 0,87-1,15 0,80-1,01 0,79-1, Min-Max 0,75-1, 1,08±0,13 1,10±0,11 1,14±0, M±m 1,12±0, Почки 0,85-1,26 0,92-1,27 0,89-1, Min-Max 0,92-1, 1,29±0,14 1,30±0,09 1,32±0, M±m 1,34±0, Тимус 1,09-1,48 1,12-1,50 1,14-1, Min-Max 1,15-1, 0,62±0,03 0,64±0,03 0,61±0, M±m 0,59±0, Мозг 0,51-0,70 0,48-0,74 0,49-0, Min-Max 0,48-0, 1,15±0,13 1,21±0,14 1,17±0, M±m 1,18±0, Костный мозг 1,04-1,29 1,07-1,41 1,06-1, Min-Max 1,02-1, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, В проведенном исследовании изменение активности апотоза было выявлено в печени, что соответствовало ожидаемому эффекту, так как CCl4 является классическим гепатотропным агентом [13, 132], однако реакция изученных показателей на введение CCl4 в дозе 0,04 мг/кг массы тела находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась от фонового уровня апоптоза.

Дозы 0,02 и 0,01 мг/кг не вызывали изменений изученных показателей, поэтому в дальнейших экспериментах в качестве минимальной действующей дозы CCl следует использовать 0,04 мг/кг массы тела.

Чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптозауровень фрагментации ДНКактивность каспазы, поэтому использование методов оценки уровня фрагментации ДНК оптимально для выявления токсических воздействий малой интенсивности.

Следует отметить, что, помимо метода ДНК-комет, для выявления специфической фрагментации ДНК при апоптозе может также быть использован метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). Однако, метод TUNEL не может считаться строго специфичным для апоптоза, так как обнаружено, что TUNEL-позитивное окрашивание может быть ассоциировано с репарацией ДНК и некротическими процессами и, следовательно, приводить к ложноположительным результатам [16]. В некоторых случаях также возникает определенная неясность относительно биологического значения повреждений ДНК, выявляемых методом ДНК-комет. Известно, что значительная часть таких повреждений может быть элиминирована системами репарации ДНК и не зафиксирована в геноме. Несмотря на эти обстоятельства, метод ДНК-комет дает адекватную информацию об общем уровне повреждений ДНК клеток, при этом исследования через определенные временные интервалы позволяют судить об эффективности процессов репарации или повреждений ДНК.

Таким образом, метод «ДНК-комет» показал более высокую чувствительность относительно биохимического метода определения активности каспазы-3 в печени.

Фрагментация ДНК является конечным этапом апоптоза, что позволяет эффективно применять метод ДНК-комет для оценки активности апоптоза при исследовании токсического действия различных химических агентов, когда низкие дозы сочетаются с различной длительностью воздействия неблагоприятного фактора.

3.3. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз CCl В третьей серии исследований оценивали активность апоптоза в печени, почках, тимусе, костном мозге, головном мозге, сердце, селезенке, семенниках, тонком и толстом кишечнике методом ДНК-комет. Образцы для исследований отбирали через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в низкой и минимально действующей дозах – 0,08 и 0,04 мг/кг массы тела. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие этап деструкции – уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.

После введения CCl4 у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено каких-либо макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в органах крыс представлены в табл. 23, 24.

Таблица Уровень фрагментации ДНК в органах крыс после введения низких и минимально действующих доз CCl Доза CCl Индекс апоптоза, Контроль 0,08 мг/кг 0,04 мг/кг % ДНК массы тела массы тела M±m 7,12±0,21 8,03±0,16* 7,84±0,17* Печень Min-Max 6,77-7,42 7,54-8,39 7,44-8, M±m 7,35±0,17 7,22±0,11 7,41±0, Почки Min-Max 7,01-7,79 6,87-7,64 7,08-7, M±m 7,68±0,19 7,53±0,14 7,72±0, Тимус Min-Max 7,31-7,98 7,11-7,92 7,36-8, M±m 4,89±0,13 5,01±0,16 4,95±0, Головной мозг Min-Max 4,42-5,24 4,51-5,38 4,44-5, M±m 7,36±0,19 7,22±0,16 7,51±0, Костный мозг Min-Max 7,09-7,89 6,97-7,54 7,11-7, M±m 8,14±0,16 8,03±0,11 7,98±0, Селезенка Min-Max 7,45-8,61 7,56-8,39 7,65-8, M±m 8,57±0,28 8,23±0,17 8,69±0, Семенники Min-Max 8,12-8,93 7,89-8,65 8,39-9, M±m 9,27±0,32 11,07±0,17* 9,38±0, Тонкий кишечник Min-Max 8,79-9,56 10,49-11,57 9,03-9, M±m 8,63±0,28 8,39±0,21 8,57±0, Толстый кишечник Min-Max 8,15-8,93 8,11-8,83 8,14-9, Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Как видно из табл. 23, 24, после однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в низкой (0,08 мг/кг) и минимально действующей (0,04 мг/кг) дозах не было выявлено изменений изученных показателей в почках, тимусе, головном мозге, костном мозге, селезенке, семенниках, толстом кишечнике.

Повышение уровня фрагментации ДНК на 13% (p0,05) и 10% (p0,05), индекса апоптоза – на 28% (p0,05) и 22% (p0,05) было выявлено в печени крыс при введении CCl4 в дозах 0,08 и 0,04 мг/кг массы тела, соответственно.

Повышение уровня фрагментации ДНК на 19% (p0,05), индекса апоптоза – на 14% (p0,05) было выявлено в тонком кишечнике крыс при введении CCl4 в дозе 0,08 мг/кг;

при введении CCl4 в дозе 0,04 мг/кг уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тонком кишечнике не отличались от фонового уровня.

Таблица Индекс апоптоза в органах крыс после введения низких и минимально действующих дозCCl Доза CCl Индекс апоптоза, Контроль 0,08 мг/кг 0,04 мг/кг % ДНК массы тела массы тела 1,14±0,06* 1,09±0,05* M±m 0,89±0, Печень 0,95-1,32 0,92-1, Min-Max 0,74-1, 1,08±0,05 1,05±0, M±m 1,07±0, Почки 0,91-1,20 0,87-1, Min-Max 0,84-1, 1,13±0,05 1,15±0, M±m 1,18±0, Тимус 0,97-1,27 1,00-1, Min-Max 1,03-1, 0,60±0,04 0,61±0, M±m 0,57±0, Головной мозг 0,47-0,73 0,45-0, Min-Max 0,43-0, 1,19±0,09 1,24±0, M±m 1,28±0, Костный мозг 1,01-1,44 1,07-1, Min-Max 1,04-1, 1,24±0,06 1,19±0,05 1,23±0, M±m Селезенка 1,08-1,43 1,05-1,35 1,14-1, Min-Max 0,98±0,05 1,02±0,06 1,05±0, M±m Семенники 0,83-1,13 0,88-1,18 0,93-1, Min-Max 1,04±0,05 1,19±0,05* 1,09±0, M±m Тонкий кишечник 0,82-1,24 1,04-1,39 0,85-1, Min-Max 1,15±0,11 1,12±0,09 1,19±0, M±m Толстый кишечник 0,91-1,37 0,90-1,29- 1,03-1, Min-Max Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Эпителиальные клетки кишечника находятся в постоянном контакте с множеством различных соединений, поступающих с пищей. Необходимая для этого целостность эпителия обеспечивается интенсивными процессами клеточной регенерации, о чем свидетельствуют показатели митотического и апоптотического индексов эпителия тонкой кишки. Нарушение контроля над соотношением пролиферации и клеточной гибели ведет к сдвигам гомеостаза, изменению гистоархитектоники и развитию целого ряда различных патологических состояний [4, 12, 16]. В начальный период токсического воздействия изменяются состав и функции клеток слизистой оболочки тонкой кишки, что вероятнее всего связано с изменением регуляторных связей в клеточном цикле.

В ряде экспериментов было показано, что в условиях острого токсического воздействия различных загрязняющих веществ, интенсивность апоптоза эпителиоцитов тонкой кишки крыс нарастает, а пролиферации снижается, происходит нарушение межклеточных взаимодействий. Кроме того, показана качественная и количественная трансформация соединительнотканных компонентов стенки тонкой кишки крыс. Также при токсическое поражении тонкой кишки выявляют минимальные изменения слизистой оболочки: незначительный отек, увеличение диаметра капилляров, укорочение и расширение крипт, повышенное содержание в них слизи, небольшое увеличение бокаловидных клеток и незначительную клеточную инфильтрацию. Наличие таких минимальных изменений ассоциируется со снижением пролиферативной активности, увеличением апоптоза эпителиоцитов [4, 12, 16].

В проведенном исследовании чувствительность внутренних органов крысы к воздействию низкой и минимально действующей доз CCl4 снижается в ряду печень тонкий кишечникпрочие органы, поэтому использование печени для оценки уровня апоптоза оптимально для выявления токсических воздействий малой интенсивности.

3.4. Определение активности апоптоза у крыс как биомаркер при оценке влияния алиментарных факторов.

3.4.1. Влияние дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия CCl4 и витаминной недостаточности Одним из наиболее простых и эффективных способов снижения адаптационного потенциала организма лабораторных животных является использование рациона, дефицитного по содержанию витаминов [9]. Нами было выбрана модель дефицита пантотената кальция, биологическая роль которого к настоящему времени хорошо изучена: пантотеновая кислота, как составляющая кофермента А, участвует в метаболизме жирных кислот, стеролов и других компонентов, синтезируемых из изотерпеноидов, в реакциях синтеза и посттрансляционных модификациях (терминальное ацетилирование, ацилирование) белковых молекул и др. [29]. Дефицит пантотеновой кислоты (витамин B5) и связанные с ним метаболические нарушения приводят к снижению адаптационных возможностей организма [35], и, как следствие, повышают чувствительность к токсическому воздействию.

В качестве токсического фактора индуцирующего апоптоз был выбран тетрахлорметан, чье действие на изменение активности апоптоза в тканях крыс было подробно охарактеризовано в предыдущих исследованиях.

Эксперимент длительностью 30 дней проведен на 30 половозрелых крысах самцах линии Вистар с исходной массой тела 325,0±11,3 г. Животные были разделены на 2 опытные и 1 контрольную группу по 10 животных в каждой из них.

Животные первой и второй опытной группы получали полусинтетический казеиновый рацион дефицитный по пантотеновой кислоте, животные контрольной группы получали полноценный полусинтетический рацион (табл. 5) Состав витаминной смеси представлен в табл. 25. Витаминная смесь являлась единственным источником пантотеновой кислоты, остальные компоненты рациона не содержали не содержали данный витамин.

Таблица Смеси водорастворимых витаминов мг/г витаминной смеси Наименования № мг/г витаминной смеси (без пантотеновой витаминов кислоты) 1 Тиамин (В1) 0,4 0, 2 Рибофлавин (В2) 0,6 0, 3 Пиридоксин (В6) 0,4 0, 4 Никотиновая кислота 3,0 3, Пантотененовая кислота 5 1,5 (В5) 6 Фолиевая кислота 0,2 0, 7 Цианкобаламин (В12) 0,003 0, 8 Викасол 0,1 0, 9 L-метионин 50,0 50, 10 Глюкоза 943,797 945, Второй опытной группе за 24 часа до эвтаназии вводили раствор CCl4 в жидком парафине в минимально действующей дозе 0,08 мг на кг массы тела. После выведения животных всех трех групп из эксперимента у них отбирали для исследований образцы внутренних органов: печень, почки, тимус, костный мозг, мозг, сердце, селезенка, семенники. Активность апоптоза определяли методом ДНК-комет по степени фрагментации ДНК и индексу апоптоза.

Результаты определения степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза методом ДНК-комет в различных органах крыс представлены в таблице 26-27.

Таблица Влияние дефицита пантотеновой кислоты, и сочетанного действия дефицита пантотеновой кислоты и внутрибрюшинного введения CCl на фрагментацию ДНК в органах крыс Степень фрагментации ДНК, % ДНК Органы Деф. вит. B5 + Контроль Деф. вит. B CCl Печень M±m 7,54±0,14 6,24±0,16* 8,75±0,14* Почки M±m 7,08±0,11 7,15±0,13 7,89±0,12* Тимус M±m 8,13±0,14 8,05±0,13 7,98±0, Головной мозг M±m 4,43±0,05 4,21±0,06 4,67±0, Костный мозг M±m 7,14±0,16 7,58±0,12 7,27±0, Селезенка M±m 7,32±0,19 7,55±0,21 7,27±0, Семенники M±m 8,18±0,23 8,32±0,21 8,15±0, Тонкая кишка M±m 9,84±0,14 9,89±0,16 11,35±0,17* Толстая кишка M±m 8,34±0,17 8,16±0,14 8,51±0, кишечник Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Как видно из данных, представленных в табл. 26-27, достоверные изменения степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза, были выявлены в печени крыс обеих опытных групп. При этом в печени крыс, получавших дефицитный по пантотеновой кислоте рацион, наблюдалось достоверное снижение фрагментации ДНК и индекса апоптоза, в то время как у крыс, испытывающих сочетанное воздействие дефицита пантотеновой кислоты и однократного внутрибрюшинного введения CCl4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела, было выявлено достоверное увеличение фрагментации ДНК индекса апоптоза в печени и тонкой кишке.

Таблица Влияние дефицита пантотеновой кислоты, и сочетанного действия дефицита пантотеновой кислоты и внутрибрюшинного введения CCl4 на индекс апоптоза в органах крыс Индекс апоптоза, % Органы Деф. вит. B5 + Контроль Деф. вит. B CCl Печень M±m 0,89±0,03 0,74±0,06* 1,09±0,05* Почки M±m 1,07±0,09 1,08±0,05 1,05±0, Тимус M±m 1,18±0,09 1,13±0,05 1,15±0, Головной мозг M±m 0,57±0,03 0,60±0,04 0,61±0, Костный мозг M±m 1,28±0,10 1,19±0,09 1,24±0, Селезенка M±m 1,24±0,06 1,19±0,05 1,23±0, Семенники M±m 0,98±0,05 1,02±0,06 1,05±0, Тонкая кишка M±m 1,04±0,05 1,19±0,05* 1,09±0, Толстая кишка 1,15±0,11 1,12±0,09 1,19±0, M±m кишечник Представлены средние данные (М±m) от n = * отличия от контроля достоверны при p0, Как известно, производные пантотеновой кислоты – предшественники кофермента А (КоА), в первую очередь D-пантенол, оказывают цитопротективное действие на мембрану гепатоцитов и холангиоцитов, а также подавляют апоптоз, обусловленный токсичными желчными кислотами. Сочетание предшественника КоА (пантенола) и сукцината, который также обладает способностью по поддержанию энергетического метаболизма при различных патологических ситуациях, обладает выраженным защитным эффектом при токсическом повреждении печении [113]. Тем самым поддержание гомеостаза, путем регуляции процессов пролиферации и гибели клеток печени, препятствуют развитию патологических состояний, в том числе увеличению активности апоптоза. В тоже время недостаточное обеспечение пантотеновой кислотой снижает интенсивность синтеза специализированных белков апоптоза (TNFR1,TNF, sTNFR1, каспаза-8)., необходимых для реализации рецептор-зависимого сигнального пути апоптоза, что в свою очередь приводит к снижению активности апоптоза. Однако дефицит пантотеновой кислоты не оказывает влияния на биосинтез белков, участвующих в митохондриальном (внемембранном) пути апотоза.

Снижение активности апоптоза в печени крыс, получавших дефицитный по пантотеновой кислоте, может быть объяснено «нехваткой» ряда белков участвующих в рецептор-зависимом пути апоптоза. Поскольку CCl4 вызывает апоптоз, преимущественно запуская митохондриальный путь апоптоза в клетках печени крыс, то полученные результаты повышения активности апоптоза свидетельствуют о раннем токсическом действии данного соединения, усиленном на фоне дефицита пантотеновой кислоты.

3.4.2. Влияние фитостероидов на активность апоптоза у крыс Как известно, общий адаптационный синдром в условиях неблагоприятного стрессорного воздействия может сопровождаться выраженными изменениями интенсивности процессов апоптоза и некроза в различных органах, и, в первую очередь в тимусе [106, 140]. Соответственно, представляется перспективным определение активности апоптоза в качестве биомаркера для оценки возможного влияния алиментарного фактора на дисстресс. У крыс, получавших фитостероид содержащий экстракт соответственно из расчета 5,0 и 15,0 мг фитостероидов на кг массы тела, определяли фрагментацию ДНК и индекс апоптоза в тимусе, мозге и сердце. Концентрация суммы фитостероидов в экстракте, который получали лабораторные животные опытных групп вместе с водой составляла 6,15%, из которых 66% приходилось на 20 гидроксиэкдизон (20Е) и 23% на 25S-инокостерон, являющиеся мажорными экдистероидами дикорастущего растения Серпухи венценосной (Serratula coronata) [1]. Результаты исследований представлены в табл.

28-29.

Таблица Влияние фитостероидов на степень фрагментации ДНК в органах крыс Степень фрагментации ДНК(% ДНК) Орган Контроль 5 мг/кг 15мг/кг M±m 7,58±0,34 7,63±0,24 7,49±0, Тимус Min-Max 6,21-8,55 6,03-8,91 6,34-9, M±m 4,28±0,14 4,03±0,18 4,15±0, Мозг Min-Max 3,58-5,39 3,12-4,91 3,52-4, M±m 7,38±0,22 7,24±0,16 7,34±0, Сердце Min-Max 6,03-8,92 6,14-7,87 6,00-8, Представлены средние данные (М±m) от n = Таблица Влияние фитостероидов на индекс апоптоза в органах крыс Индекс апоптоза, % Орган Контроль 5 мг/кг 15мг/кг M±m 1,02±0,09 1,10±0,08 1,09±0, Тимус Min-Max 0,64-1,27 0,68-1,28 0,72-1, M±m 0,38±0,06 0,40±0,05 0,37±0, Мозг Min-Max 0,21-0,59 0,30-0,48 0,32-0, M±m 0,91±0,12 1,02±0,14 0,98±0, Сердце Min-Max 0,72-1,14 0,75-1,16 0,81-1, Представлены средние данные (М±m) от n = У животных, получавших фитостероид-содержащий экстракт, не выявлено достоверных различий степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза в сравнении животными контрольной группы. Полученные результаты свидетельствуют, что ежедневное получение крысами в течение 30 дней фитостероидов в дозах 5,0 и 15, мг на кг массы тела, не влияло на активность апоптоза.

В следующей серии исследований, оценивали влияние фитостероидов на активность апоптоза у животных, подвергнутых, стрессорному воздействию электрическим током. Результаты эксперимента представлены в таблицах 30, 31.

Таблица Влияние фитостероидов на степень фрагментации ДНК в органах крыс, подвергнутых стрессорному воздействию Степень фрагментации ДНК(% ДНК) Орган Контроль 5 мг/кг 15мг/кг M±m 7,58±0,34 8,14±0,16 7,61±0,14* Тимус Min-Max 6,21-8,55 6,87-9,17 6,35-8, M±m 4,28±0,14 4,08±0,14 4,12±0, Мозг Min-Max 3,58-5,39 3,02-4,83 3,15-4, M±m 7,38±0,22 7,53±0,15 7,23±0, Сердце Min-Max 7,58±0,34 8,14±0,16 7,61±0,14* Представлены средние данные (М±m) от n = * – отличия между опытными группами достоверны при p0, Таблица Влияние фитостероидов на индекс апоптоза в органах крыс, подвергнутых стрессорному воздействию Индекс апоптоза, % Орган Контроль 5 мг/кг 15мг/кг M±m 1,02±0,09 1,34±0,07 1,08±0,10* Тимус Min-Max 0,64-1,27 1,06-1,59 0,78-1, M±m 0,38±0,06 0,41±0,07 0,42±0, Мозг Min-Max 0,21-0,59 0,31-0,66 0,32-0, M±m 0,91±0,12 1,23±0,10 1,02±0, Сердце Min-Max 1,02±0,09 1,34±0,07 1,08±0,10* Представлены средние данные (М±m) от n = * – отличия между опытными группами достоверны при p0, Степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тимусе у животных, подвергавшихся стрессорному воздействию, были достоверно выше по сравнению с животными подвергшихся стрессу и получавшими фитостероид-содержащий экстракт в дозе 2,0 мг/кг массы тела. В других органах не выявлено каких-либо достоверных изменений степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза у этих двух групп животных Полученные результаты показывают, что степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тимусе у животных, подвергавшихся стрессороному воздействию достоверно выше (на 29%) от аналогичных показателей в тимусе животных, которые подвергались этому же воздействию и получали с водой фитостероидсодержащий экстракт из листьев Серпухи Венценосной. По другим исследованным органам (мозг и сердце) не было выявлено каких-либо статистически достоверных изменений степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза у этих двух групп животных (таблицы 30, 31).

Как известно экдистероиды - это полигидроксилированные стерины, являющиеся структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоз членистоногих [2]. 20-гидрокcиэкдизон (20Е) является наиболее широко изученным представителем фитостероидов и может быть выделен из различных растений и в первую очередь таких, как левзея сафлоровидная (Leusea carthamoides), серпуха венценосная и шпинат. 20-гидроксиэкдизон низко токсичен;

так, например, при внутрибрюшинном и пероральном ведении 20E в опытах на мышах LD50 составляла 6.4 и 9.0 г/кг соответственно [8]. Адаптогенные свойства 20-гидроксиэкдизона как основного компонента экстракта из листьев Серпухи Венценосной представляют определенные перспективы для использования в составе БАД, повышающих устойчивость организма к стрессорным воздействиям. Такого рода использование априори предполагает отсутствие неблагоприятного влияния на организм потребления этой субстанции в нормальных условиях, что подтверждается полученными в нашем исследовании данными об отсутствии изменений степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза в исследованных органах животных, потреблявших относительно высокие дозы фитостероидов на протяжении 30 суток (табл. 28, 29). Стресс-лимитирующее действие экстракта из листьев Серпухи Венценосной подтверждают результаты, свидетельствующие об относительном снижении активности апоптоза в клетках тимуса стрессированных крыс, получавших этот фитосодержащий экстракт (табл. 30, 31). Возможный реализуемый PI3K/Akt-сигнальным путем механизм установленного нами снижения активности апоптоза у стрессировнных крыс, получавших фитостероиды, будет обсужден в разделе « Заключение».

Результаты, представленные в данном разделе, подтверждают высокую информативность показателя активности апоптоза как биомаркера влияния алиментарного фактора на тяжесть проявления стрессорного воздействия.

3.4.3. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa На протяжении всего эксперимента не было отмечено гибели крыс контрольной и опытной групп. Общее состояние животных обеих групп было удовлетворительным. По внешнему виду, состоянию шерстного покрова, поведению и скорости роста животные опытной группы не отличались от животных контрольной группы. Поедаемость корма составляла 22-24 г/крысу/сут.

Измерение массы тела крыс проводили еженедельно на протяжении всего срока эксперимента. Динамика изменения массы тела представлена в табл. 32.

Таблица Масса тела крыс при включении в рацион ГМ кукурузы и ее традиционного аналога Контрольная группа Опытная группа Срок эксперимента, дни Масса, г Прирост, Масса, г Прирост, % % 1 2 3 4 M±m 93,5±1,6 93,1±2, 0 - Min-Max 67-113 68- M±m 136,4±1,9 138,0±2, 7 45,9 48, Min-Max 113-161 97- M±m 191,3±3,7 190,4±3, 14 40,2 38, Min-Max 162-299 147- M±m 232,3±2,8 235,8±3, 21 21,4 23, Min-Max 197-262 174- M±m 271,9±2,8 274,4±3, 28 17,1 16, Min-Max 235-302 208- M±m 288,5±3,2 288,4±4, 35 6,1 5, Min-Max 251-328 222- M±m 299,9±3,1 302,4±4, 42 4,0 4, Min-Max 260-342 232- M±m 332,5±3,4 335,8±4, 49 10,9 11, Min-Max 290-364 261- M±m 360,0±3,7 364,5±4, 56 8,3 8, Min-Max 317-393 283- M±m 377,6±4,1 381,0±5, 63 4,9 4, Min-Max 325-420 297- M±m 398,0±4,5 401,5±5, 70 5,4 5, Min-Max 339-453 315- M±m 414,4±4,8 421,1±5, 77 4,1 4, Min-Max 352-480 335- M±m 430,1±5,8 438,0±6, 84 3,8 4, Min-Max 350-509 347- M±m 445,0±6,3 453,1±6, 91 3,5 3, Min-Max 358-535 352- M±m 464,7±6,5 472,7±7, 98 4,4 4, Min-Max 397-566 367- 1 2 3 4 M±m 477,8±6,6 484,8±7, 105 2,8 2, Min-Max 410-581 372- M±m 490,8±6,8 495,9±8, 112 2,7 2, Min-Max 421-596 374- M±m 499,1±7,1 504,0±8, 119 1,7 1, Min-Max 429-611 377- M±m 501,9±7,6 509,2±9, 126 0,6 1, Min-Max 430-625 373- M±m 511,2±7,9 518,1±9, 133 1,8 1, Min-Max 439-642 379- M±m 519,8±8,2 528,4±10, 140 1,7 2, Min-Max 440-656 390- M±m 524,2±8,6 535,0±10, 147 0,8 1, Min-Max 442-668 395- M±m 527,0±8,9 538,6±10, 154 0,5 0, Min-Max 449-676 395- M±m 533,0±9,8 550,5±10, 161 1,1 2, Min-Max 441-698 401- M±m 539,9±9,8 554,4±11, 168 1,3 0, Min-Max 453-704 400- M±m 548,9±9,9 564,5±11, 175 1,7 1, Min-Max 460-714 408- M±m 548,3±10,1 565,4±11, 182 -0,1 0, Min-Max 456-724 416- Представлены средние данные от n = Как видно из табл. 32, масса тела крыс контрольной и опытной групп не имела достоверных различий на протяжении всего эксперимента. Еженедельный прирост массы тела животных обеих групп соответствовал уровню прироста массы тела, характерному для данного вида и возраста животных [80, 100].

Абсолютную и относительную массу внутренних органов определяли через 182 дня от начала эксперимента. Данные измерения массы внутренних органов крыс представлены в табл. 33.

Таблица Масса внутренних органов крыс при включении в рацион ГМ кукурузы и ее традиционного аналога Показатели Контроль Опыт 1 2 3 абс.1 14,90±0,36 15,937±0, Min-Max 10,71-16,94 12,94-19, Печень, г отн.2 2,976±0,192 2,917±0, Min-Max 2,195-5,864 2,561-3, абс. 2,721±0,073 2,821±0, Почки, г Min-Max 2,091-3,507 2,020-3, отн. 0,544±0,037 0,516±0, Min-Max 0,428-1,103 0,388-0, 1 2 3 абс. 1,468±0,085 1,590±0, Селезенка, г Min-Max 0,882-2,012 0,948-1, отн. 0,302±0,037 0,291±0, Min-Max 0,167-0,831 0,187-0, абс. 1,424±0,036 1,458±0, Сердце, г Min-Max 1,241-1,726 1,203-1, отн. 0,287±0,022 0,268±0, Min-Max 0,222-0,606 0,231-0, абс. 3,121±0,206 2,869±0, Min-Max 2,231-5,912 2,213-3, Легкие, г отн. 0,625±0,055 0,527±0, Min-Max 0,400-1,183 0,411-0, абс. 0,454±0,026 0,477±0, Min-Max 0,317-0,720 0,308-0, Тимус, г отн. 0,090±0,006 0,087±0, Min-Max 0,055-0,146 0,051-0, абс. 1,891±0,035 1,869±0, Min-Max 1,682-2,174 1,304-2, Мозг, г отн. 0,380±0,027 0,342±0, Min-Max 0,304-0,796 0,258-0, абс. 3,542±0,091 3,531±0, Семенники, г Min-Max 2,701-3,977 2,521-4, отн. 0,702±0,036 0,635±0, Min-Max 0,467-1,228 0,442-0, абс. 0,0071±0,0006 0,0091±0, Гипофиз, г Min-Max 0,0030-0,0112 0,0038-0, отн. 0,0014±0,0002 0,0017±0, Min-Max 0,0005-0,0034 0,0006-0, абс. 0,065±0,004 0,060±0, Надпочечники, г Min-Max 0,025-0,106 0,036-0, отн. 0,0132±0,0015 0,0111±, Min-Max 0,005-0,035 0,007-0, абс. 0,338±0,031 0,286±0, Простата, г Min-Max 0,104-0,581 0,101-0, отн. 0,067±0,006 0,053±0, Min-Max 0,020-0,110 0,019-0, 1 Абсолютная масса внутренних органов, г;

Относительная масса внутренних органов (на 100 г массы тела) Представлены средние данные от n = Как показано в табл. 33, массы внутренних органов у крыс контрольной и опытной групп на протяжении всего эксперимента находились в пределах физиологических колебаний, характерных для животных данного вида, статистически значимых различий между группами не выявлено.

Макроскопические морфологические исследования внутренних органов проводили во время отбора материала. Исследования внутренних органов не выявили различий между группами: органы грудной и брюшной полостей, головной мозг у крыс опытной группы не имели визуальных отличий от аналогичных показателей у крыс контрольной группы.

Сравнительная оценка системных биомаркеров, характеризующих состояние адаптационного потенциала организма, не выявила диагностически значимых различий между группами. Значения всех изученных показателей находились в пределах физиологических колебаний, характерных для крыс.

В данном исследовании перечень системных биомаркеров был дополнен критериями, характеризующими активность процессов апоптоза во внутренних органах крыс. В предыдущих исследованиях было показано, что показатели, характеризующие этап деструкции (уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза) являются наиболее репрезентативными для определения уровня реализованного апоптоза, поэтому для целей настоящего исследования эти показатели являются оптимальными. Как видно из табл. 34, 35, уровень апоптоза в обследованных внутренних органах крыс контрольной и опытной групп не имел статистически значимых различий.

Таблица Степень фрагментации ДНК в органах крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa Степень фрагментции ДНК, % ДНК Исследуемый орган Контрольная Опытная группа группа M±m 7,22±0,11 7,11±0, Печень Min-Max 6,39-7,91 6,43-8, M±m 7,23±0,14 7,14±0, Почки Min-Max 6,51-8,02 6,31-7, M±m 7,53±0,11 7,68±0, Тимус Min-Max 6,97-8,07 6,44-8, M±m 4,08±0,03 4,01±0, Мозг Min-Max 3,87-4,25 3,80-4, M±m 7,59±0,15 7,68±0, Костный мозг Min-Max 6,78-8,24 6,89-8, M±m 6,14±0,12 6,31±0, Селезенка Min-Max 5,28-6,78 6,05-7, M±m 7,21±0,20 7,33±0, Тестис Min-Max 5,98-8,17 6,08-8, M±m 8,91±0,25 9,07±0, Тонкий киш.

Min-Max 7,88-10,14 8,00-10, M±m 8,97±0,18 9,11±0, Толстый киш.

Min-Max 7,95-10,37 8,14-10, Таблица Индекс апоптоза в органах крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vip3Aa Индекс апоптоза Исследуемый орган Контрольная Опытная группа группа M±m 0,80±0,03 0,78±0, Печень Min-Max 0,69-0,95 0,63-0, M±m 1,08±0,09 1,04±0, Почки Min-Max 0,73-1,21 0,70-1, M±m 1,18±0,10 1,10±0, Тимус Min-Max 1,02-1,33 0,90-1, M±m 0,60±0,05 0,54±0, Мозг Min-Max 0,41-0,75 0,39-0, M±m 1,07±0,07 1,02±0, Костный мозг Min-Max 0,83-1,29 0,84-1, M±m 1,11±0,08 1,04±0, Селезенка Min-Max 0,91-1,24 0,84-1, M±m 1,15±0,15 1,07±0, Тестис Min-Max 0,80-1,35 0,92-1, M±m 1,21±0,13 1,30±0, Тонкий киш.

Min-Max 1,02-1,47 1,01-1, M±m 1,33±0,17 1,27±0, Толстый киш.

Min-Max 1,08-1,64 0,94-1, В совокупности результаты 182-дневного токсикологического эксперимента на крысах, получавших с рационом агравированные количества ГМ кукурузы, содержащей кассету экспрессии гена vip3Aa20, свидетельствуют об отсутствии какого-либо токсического действия.

На основании результатов комплексных токсиколого-гигиенических исследований и доказательств безопасности, ГМ кукуруза, содержащая кассету экспрессии гена vip3Aa20, прошла государственную регистрацию, внесена в государственный реестр и разрешена для использования на территории Российской Федерации (свидетельство № 77.99.26.011.Е.022882.06.11 от 29 июня 2011 года).

Глава 4. З А К Л Ю Ч Е Н И Е Программируемая гибель клеток путем апоптоза является фундаментальным биологическим процессом, используемым организмом для ликвидации невостребованных, закончивших свой жизненный цикл и потенциально опасных клеток.

Апоптоз является неотъемлемой частью процессов развития и гомеостаза зрелой ткани. В норме организм использует этот генетически запрограммированный механизм в эмбриогенезе для уничтожения избытка клеточного материала на ранней стадии развития ткани, в частности в нейронах, не установивших контакта с клетками-мишенями и лишенных таким образом трофической поддержки из этих клеток [20, 27, 124]. В зрелом возрасте интенсивность апоптоза существенно снижается, хотя остается высокой в других тканях [103]. Исследование молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток стало в настоящее время одной из самых актуальных проблем биологических наук, поскольку сбои в реализации программы апоптоза в клетках лежат в основе патогенеза и прогрессии ряда заболеваний.

Индукция апоптоза, то есть повышение его активности осуществляется многими стрессовыми факторами, включающими токсические, ишемию, вирусную инфекцию и другие неблагоприятные воздействия [67, 101, 154]. Соответственно, активность апоптоза может рассматриваться как системный биомаркер, отражающий уровень адаптации организма к окружающей среде и обладающим высокой неспецифической чувствительностью к разнообразным воздействиям.

Следовательно, определение этого показателя можно эффективно использовать при нутрициологических исследованиях для характеристики влияния воздействий различной степени интенсивности.

Комплексное изучение апоптоза под влиянием разнообразных средовых или онтогенетических факторов широко представлено в научных публикациях [58, 103, 125, 147, 161], однако влияние алиментарных факторов на предрасположенность клетки к апоптозу остается до настоящего времени наименее изученным аспектом проблемы. Таким образом, очевидна актуальность исследования, характеризующего применимость использования современных методов для определения активности апоптоза при воздействии токсических факторов с последующим изучением влияния алиментарных факторов на этот процесс.

К настоящему времени выявлен ряд веществ, способных активировать или замедлять развитие апоптоза при этом гибель клетки зависит от соотношения факторов, вызывающих и предотвращающих апоптоз, а также от регуляторных внутриклеточных механизмов. Индукция апоптоза может осуществляться при воздействии как внешних, так и внутренних факторов, запускающих многочисленных каскады биохимических реакций, приводящих к гибели клетки [44, 49, 113].

Морфологические изменения при апоптозе характеризуется уменьшением объема цитоплазмы, конденсацией ядра и нарушением плазматической мембраны.

Эти первоначальные изменения сопровождаются фрагментацией ядерного содержимого и последовательной инкапсуляцией этих фрагментов в связанные с мембранами «апоптозные тельца», которые фагоцитируются соседними клетками.

Биохимические изменения включают специфическое расщепление ДНК, рибосомальной РНК и белков, повышение внутриклеточного уровня ионов кальция, потерю митохондриального трансмембранного потенциала и высвобождение из митохондрий цитохрома С, активацию каскада каспаз и другие изменения.

Основываясь на этих морфологических и биохимических изменениях, разработаны различные методы для определения и подсчета апоптотических клеток.

Как это уже было отмечено в обзоре литературы основными методами являются:

определение активности каспаз, морфологические методы подсчета апоптозных клеток, иммуногистохимические методы обнаружения специфических белков, участвующих в апотозе, а также электрофоретическое определение фрагментации ДНК.

С этой целью на первом этапе исследования нами проведена сравнительная оценка биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения гибели клетки в различных органах крыс при токсическом воздействии, моделируемым внутрибрюшинным введением тетрахлорметана.

Поскольку CCl4 является классическим гепатотропным агентом, то даже его непродолжительное поступление в организм животного способствует развитию жировой дистрофии печени, апотозу и некрозу [13]. Четыреххлористый углерод также вызывает токсическое поражение почек, одним из ранних проявлений которого является возрастание активности апоптоза преимущественно в клетках эпителия проксимального и дистальных отделов канальцев. В отдельных случаях действие CCl4 может характеризоваться внепеченочными проявлениями такими как:

эозинофилия, миалгия, поражение почек, легких и костного мозга.

В проведенном нами исследовании изменение активности апотоза преимущественно было выявлено в печени и почках. Наибольшая активность апоптоза в печени, почках и костном мозге, регистрировалось через 24 часа после введения CCl4 в дозе 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела. Полученные данные согласуются с рядом работ по изучению токсического действия четыреххлористого углерода [13, 132]. Чувствительность методов определения активности каспазы-3 и метода ДНК комет при данном уровне токсического воздействия CCl4 практически идентична, и позволяет регистрировать незначительное усиление апоптоза при дозе CCl4 – 0, мг/кг массы тела. Ряд изменений уровня белков апоптоза – Bcl-2, Bax и p53 в печени крыс был отмечен с помощью иммуногистохимического метода может рассматриваться только как дополнительный критерий апотоза ввиду высокой специфичности метода.

Дальнейшее сравнение методов определения активности каспазы-3 и метода ДНК-комет проведено при токсическом поражении животных четыреххлористым углеродом в дозе менее в дозе 0,08 мг/кг массы тела. Метод ДНК-комет, фиксирующий конечный этап апоптоза, был более чувствительным по сравнению с биохимическим методом определения активности каспазы-3. Таким образом, нами было установлена эффективность использования метода ДНК-комет для оценки активности апоптоза при исследовании динамики токсического действия различных химических агентов, когда низкие дозы сочетаются с различной длительностью воздействия неблагоприятного фактора.

Как было отмечено в литературном обзоре выделяются два основных пути передачи сигнала апоптоза: рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь. При развитии апоптоза активируются каскады протеолитических ферментов, специфичные для первичного стимула, что обеспечивает усиление сигналов от рецепторов и взаимодействие с другими сигнальными путями апоптоза. Наряду с охарактеризованным в данной работе действием токсического агента (CCl4) для которого характерен митохондриальный путь инициации апоптоза нами проведено дальнейшее сравнение различных методов определения активности апоптоза у крыс при инициации апоптоза через рецептор-зависимый сигнальный путь апоптоза.

Широко известно апоптогенное действие глюкокортикоидных гормонов на лимфоидные клетки. Чувствительность незрелых тимоцитов к глюкокортикоид индуцированному апоптозу характерна для многих биологических видов. Действие гормонов опосредовано внутриклеточными специфическими рецепторами.

Рецептор, связывая лиганд, регулирует транскрипцию гормоночувствительных генов. Это могут быть гены, продукты которых регулируют продвижение клетки по клеточному циклу или апоптоз- специфические гены.

С этой целью на следующем этапе исследований было охарактеризовано действие адренокортикотропного гормона (АКТГ) при внутрибрюшинном введении, на изменение активности апоптоза в некоторых органах лабораторных животных (крыс).

Полученные нами результаты свидетельствуют, что однократное внутрибрюшинное введение АКТГ в дозе 4 и 75 МЕ/кг массы тела приводит в наибольшей степени к достоверным изменениям активности апоптоза в почках и тимусе половозрелых крыс. Известно, что адренокортикотропный гормон (АКТГ), оказывает стимулирующее действие на кору надпочечников. В большей степени его влияние выражено на пучковую зону, что приводит к увеличению образования глюкокортикоидов. Так, в работах Kerr и Willey, 1969-1972, посвященных изучению механизма гибели клетки путем апоптоза морфологическими методами было показано значительное увеличение числа апоптоз-положительных клеток в тимоцитах при экзогенном введение АКТГ.

В то же время АКТГ-индуцированный апоптоз тимоцитов сопровождается увеличением уровня проапоптозного белка Вах [79]. АКТГ также способен увеличивать уровень мРНК некоторых каспаз, в том числе и каспазы-3 [57] (, однако в данном случае механизм индукции экспрессии генов неясен.

Таким образом, чувствительность метода определения активности каспазы- и метода ДНК-комет сопоставимо, однако комбинированное использование этих методов не повышает диагностическую ценность исследования и представляется излишним. Соответственно, в дальнейших наших исследованиях влияния различных алиментарных факторов на изменение активности апоптоза был применен метод ДНК-комет.

Как известно из научных публикаций использование рационов со сниженным содержанием витаминов может быть эффективно применено при моделировании воздействий, снижающих адаптационный потенциал и как следствие повышает чувствительность организма животных к токсическому воздействию [9, 29]. Нами было проведено исследование активности апоптоза в различных органах крыс в условиях сочетанного воздействия четыреххлористого углерода и недостаточности пантотеновой кислоты. По результатам исследования установлено достоверное изменение степени фрагментации ДНК в печени крыс получавших дефицитный по пантотеновой кислоте рацион (1-ая опытная группа), а также получавших рацион, дефицитный по пантотеновой кислоте, сочетавшийся с однократным введением CCl в дозе 0,08 мг/кг массы тела (2-ая опытная группа). В печени крыс 1-ой опытной группы, было выявлено снижение (на 20%) степени фрагментации ДНК, в то время как у крыс 2-ой опытной группы было выявлено достоверное увеличение степени фрагментации ДНК на 16%.

Уменьшение активности апоптоза в печени крыс, получавших полусинтетический казеиновый рацион дефицитный по пантотеновой кислоте может быть объяснено сниженным синтезом ряда белков, участвующих в рецептор зависимом пути апоптоза. Так согласно работам [135, 155], недостаточное обеспечение пантотеновой кислотой снижает интенсивность синтеза специализированных белков апоптоза (TNFR1,TNF, sTNFR1, каспаза-8), необходимых для реализации рецептор-зависимого сигнального пути апоптоза, что в свою очередь приводит к снижению активности апоптоза. Однако дефицит пантотеновой кислоты не оказывает влияния на биосинтез белков, участвующих в митохондриальном (внемембранном) пути апотоза. А поскольку четыреххлористый углерод вызывает апоптоз, преимущественно запуская митохондриальный путь апоптоза в клетках печени крыс, то полученные нами результаты увеличения активности апотоза свидетельствуют о раннем токсическом действии данного соединения, усиленном на фоне дефицита пантотеновой кислоты.

Для оценки безопасности использования в питании фитостероидсодержащего водного экстракта и его возможного стресс-лимитирующего влияния нами было проведено двухэтапное исследование, направленное на определение активности апоптоза в некоторых органах лабораторных животных (крыс) в нормальных условиях и в условиях стрессорного воздействия электрическим током (0,4 мА, сек).

Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии негативных эффектов фитостероидов на степень повреждений ДНК и изменение активности апотоза в клетках исследованных органов при нормальных условиях. Степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тимусе у животных, подвергавшихся стрессороному воздействию достоверно выше аналогичных показателей в тимусе животных, которые подвергались стрессорному воздействию, что подтверждает протекторное действие исследуемой субстанции.

Как известно толерантность организма к неблагоприятным воздействиям, определяемая как состояние неспецифически повышенной сопротивляемости (СНПС), может быть достигнута поступлением в организм минорных соединений растительного, животного или искусственного происхождения, получивших в отечественной научной литературе общее название адаптогенов: веществ, обладающих широким спектром терапевтического действия, но при этом безвредных и вызывающих минимальные сдвиги в организме в норме [3, 7, 8, 14, 25, 37, 38]. Определяющей характеристикой адаптогенов являются их стресс лимитирующие свойства, позволяющие достигать СНПС без отрицательного последействия.

Можно предположить определенное сходство адаптации на уровне клетки под действием глюкокортикостероидов и этого же процесса под влиянием структурно сходного с ними 20-гидроксиэкдизона. Действительно, как известно, стресс– гормоны, взаимодействуя с мембранными рецепторами, стимулируют через вторичные мессенджеры (инозитолтрифосфат, диацилглицерол) высвобождение ионов кальция из саркоплазматического ретикулума, а также увеличивают концентрацию этих ионов в цитоплазме путем открытия Ca2+-каналов, что приводит в результате к активации генетического аппарата клетки: экспрессии генов и синтеза соответствующих белков. Можно предположить определенное сходство адаптации на уровне клетки под действием глюкокортикостероидов и этого же процесса под влиянием структурно- сходного с ними 20-гидроксиэкдизона.

Как известно, в ответ на действие стрессорных факторов головной мозг стимулирует выработку кортиколиберина гипоталамусом, который, в свою очередь, вызывает секрецию в кровь адренокортикотропного гормона гипофизом (АКТГ), который стимулирует секрецию корой надпочечников кортикостерона.

Глюкокортикоиды могут влиять на молекулярные компоненты клетки, отвечающие за детекцию анти- и проапоптозных стимулов, поскольку эти гормоны способны регулировать экспрессию ряда цитокиновых рецепторов [79, 158]. Помимо этого, глюкокортикоиды могут непосредственно влиять на экспрессию генов анти- и проапоптозных белков (Вс1-2, Вах). Неоднозначность наблюдаемых эффектов глюкокортикоидных гормонов, по-видимому, связана с их способностью влиять на различные компоненты метаболома, реализующего программу клеточной гибели [79, 140, 158].

В некоторых ситуациях проапоптозное действие глюкокортикоидов реализуется посредством негеномных взаимодействий, так например, дексаметазон способен подавлять антиапоптозную активность Akt/PI3K каскада киназ благодаря прямому межбелковому взаимодействию молекулы лиганд-активированного глюкокортикоидного рецептора с одной из регуляторных субъединиц фосфатидилинозитол-3-киназы [65, 85].

PI3K/Akt-сигнальный путь является одним из основных внутриклеточных путей, интегрирующий митогенные и антиапоптотические стимулы. В настоящее время фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K – phosphatidylinositol-3-kinase) рассматривается как один из важнейших регуляторных белков, находящихся на пересечении разных сигнальных путей и контролирующих ключевые функции клетки.

Одним из основных эффекторов PI3K является протеинкиназа В (РКВ, другое название – Akt, или PKB/Akt), активация которой инициируется образованием комплекса между липидными продуктами PI3K и Akt [65, 85]. Akt ингибирует процессы апоптоза, принимая участие в клеточных циклах.

Система оценки безопасности генетически модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения, принятая в Российской Федерации, наряду с общетоксикологическими исследованиями предусматривает изучение специфических видов токсичности, таких как генотоксичность, иммунотоксичность, аллергенность, репродуктивная токсичность. В настоящие время на мировой рынок пищевых продуктов поступают ГМО растительного происхождения, геном которых содержит генетические конструкции с несколькими заданными признаками. Однако следует отметить, что пропорционально изменению генома возрастает возможность проявления незаданных эффектов генетической модификации. Существующие на сегодняшний момент способы оценки безопасности ГМО не всегда способны точно определить подобные эффекты. В этой связи изучение активности апоптоза в качестве чувствительного неспецифического биомаркера является одним из новых высокоинформативных критериев оценки качества и безопасности новых источников пищевых веществ.

Результаты определения активности апоптоза методом ДНК-комет в органах крыс свидетельствуют об отсутствии различий изученных показателей у животных, получавших в составе полусинтетического рациона ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. На основании результатов комплексных токсиколого-гигиенических исследований и доказательств безопасности, ГМ кукуруза, содержащая кассету экспрессии гена vip3Aa20, прошла государственную регистрацию, внесена в государственный реестр и разрешена для использования на территории Российской Федерации (свидетельство № 77.99.26.011.Е.022882.06.11 от 29 июня 2011 года).

ВЫВОДЫ 1. Сравнительная оценка биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на различных экспериментальных моделях свидетельствует, что метод ДНК-комет является наиболее чувствительным для определения активности апоптоза при воздействии низких и минимально низких доз токсических факторов.

2. На модели активации апоптоза путем внутрибрюшинного введения крысам тетрахлорметана в дозах 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела выявлено дозозависимое повышение активности апоптоза в печени, почках и костном мозге. Динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза имеет сходный характер – постепенное возрастание с максимумом через 24 часа. Содержание белков Bcl-2, Bax и p53 в печени достигает максимальных значений через 12 часов.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.