авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ

УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ТАРАСОВА Екатерина Владимировна

БИОТРАНСФОРМАЦИЯ БЕТУЛИНА АКТИНОБАКТЕРИЯМИ

РОДА RHODOCOCCUS

03.02.03. Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Ившина Ирина Борисовна кандидат химических наук, доцент Гришко Виктория Викторовна Пермь 2014 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ концентрация вещества в плазме, при которой его ED терапевтический эффект составляет 50% от максимально возможного для данного вещества АСМ атомно-силовая микроскопия – ГХ-МС газовая хромато-масс-спектрометрия ДМСО диметилсульфоксид ИК инфракрасная спектроскопия МПА мясопептонный агар ПВС поливиниловый спирт ТСХ тонкослойная хроматография ЯМР спектроскопия ядерно-магнитного резонанса ОГЛАВЛЕНИЕ Введение ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов 1.1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов олеананового, урсанового и лупанового типа 1.2. Использование актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биоконверсии терпеноидных соединений ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Рабочая коллекция бактериальных культур 2.2. Условия культивирования 2.3. Контрольные эксперименты 2.4. Иммобилизация бактериальных клеток в полимерном носителе 2.5. Подготовка суспензий нерастущих клеток 2.6. Получение клеточных фракций из родококков 2.7. Определение дыхательной активности 2.8. Определение жизнеспособности нерастущих клеток родококков 2.9. Количественный и качественный анализ продуктов биотрансформации бетулина 2.10. Препаративное получение бетулона 2.11. Химическая модификация бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина 2.12. Атомно-силовая микроскопия 2.13. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина 2.14. Статистическая обработка результатов Глава 3. Исследование бетулинтрансформирующей активности коллекционных культур родококков, поиск активных биотрансформаторов бетулина Глава 4. Подбор оптимальных условий процесса биотрансформации бетулина Глава 5. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина Глава 6. Химико-ферментативный синтез фармакологически перспективных секопроизводных бетулина Заключение Выводы Список литературы ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы. Полициклические тритерпеноиды растительного происхождения представляют интерес в качестве исходных соединений в синтезе новых фармакологически активных веществ. Бетулин (луп-20(29)-ен-3,28-диол, C30H50O2, CAS: 473-98-3) – пентациклический тритерпеноид лупанового ряда, содержание которого во внешнем слое коры березы достигает 35%, активно используется для получения противовоспалительных, гепапротекторных, противоопухолевых, противовирусных, антималярийных, антибактериальных соединений (Tolstikov et al., 2005;





Alakurtti et al., 2006;

Santos et al., 2009). Помимо химических модификаций предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов, так как биокатализ открывает возможность получать целевые продукты с высокой степенью регио- и стереоселективности в одну технологическую стадию при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды и экологически безопасных условиях.

Примеры биотрансформации бетулина пока немногочисленны (Parra et al., 2009;

Muffler et al., 2011) и связаны преимущественно с использованием эукариотов, в частности представителей грибов Armillaria, Aspergillus, Chaetomium, Dothideomycetes, Rhodotorula. Описаны процессы окислительного расщепления бетулина до 4,28-дигидрокси-3,4-секолуп-20(29)-ен-3-овой кислоты при участии Chaetomium longirostre IFO 9873 (Akihisa et al., 2002) и окисления бетулина до бетулиновой кислоты с участием Armillaria luteo-virens Sacc QH, Aspergillus foetidus Zu-G1, Aspergillus oryzae Sacc QH (Chen et al., 2009;

Liu et al., 2010).

Недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина до бетулона с использованием Rhodotorula mucilaginosa F10 (Mao et al., 2012) и Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013). В качестве одного из перспективных интермедиатов в синтезе биологически активных соединений особый интерес представляет 3-оксопроизводное бетулина – бетулон (Koohang et al., 2009;

Mar et al., 2009;

Mar et al., 2010;

Orlov et al., 2011). Описаны процессы химического синтеза цитотоксичных циано- и азапроизводных бетулина на основе бетулона (Koohang et al., 2009;

Mar et al., 2009;

Mar et al., 2010). В отличие от трехстадийного химического синтеза бетулона использование микроорганизмов позволяет осуществлять одностадийное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина в оксогруппу при сохранении нативной С(28) гидроксильной группы. Однако описанные процессы биотрансформации бетулина до бетулона с использованием условно-патогенных дрожжей Rhodotorula mucilaginosa F10 (Mao et al., 2012) и грибов Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013) имеют значительные недостатки, поскольку осуществляются в условиях использования сложных питательных сред, характеризуются высокой продолжительностью, невысоким уровнем биоконверсии субстрата при внесении низких концентраций исходного соединения. Кроме того, использование грибов в качестве биокатализаторов потенциально опасно вследствие характера их посевного материала (споры) и способности к синтезу микотоксинов, обладающих мутагенным и канцерогенным действием. В связи с этим актуальным является поиск непатогенных микроорганизмов, способных эффективно катализировать окислительные трансформации бетулина.





Одной из активно используемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus. Не мицелиальный характер роста, политрофность и лабильность метаболических систем, синтез биосурфактантов, способность расти на минимальных средах, высокая каталитическая активность и отсутствие выраженных патогенных свойств (Ившина и др., 1987;

Ivshina et al., 1998;

Larkin et al., 2006;

Martnkov et al., 2009;

Kuyukina, Ivshina, 2010) обусловливают перспективность реализации уникальных метаболических систем родококков для окислительной биотрансформации бетулина.

Цель настоящей работы исследование возможности использования актинобактерий рода для селективной биотрансформации Rhodococcus пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина.

Основные задачи исследования Исследовать каталитическую активность коллекционных культур 1.

родококков разных видов в отношении бетулина. Отобрать штаммы наиболее активные биотрансформаторы бетулина и определить условия его эффективной биоконверсии.

Сравнить бетулинтрансформирующую активность нерастущих и 2.

иммобилизованных актинобактериальных клеток. Изучить механизм взаимодействия актинобактериальных клеток с тритерпеновым субстратом и возможные пути его трансформации.

Разработать прогнозную модель процесса биотрансформации 3.

бетулина в высоких концентрациях с использованием методов математического моделирования.

Оценить возможность использования продуктов бактериального 4.

окисления бетулина для последующего синтеза биологически активных соединений химическими методами.

Научная новизна. Впервые показана способность актинобактерий рода Rhodococcus к биотрансформации пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина. В качестве основного метаболита биоконверсии бетулина идентифицирован бетулон продукт региоселективного окисления вторичной гидроксильной группы бетулина. Установлено, что уровень бетулинтрансформирующей активности родококков зависит от концентрации н-гексадекана в среде культивирования. Подобраны оптимальные условия биоконверсии бетулина с использованием суспензий нерастущих клеток.

Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату. Экспериментально подтверждено, что нерастущие клетки характеризуются высоким уровнем каталитической активности в отношении бетулина в повышенных (до 3,0 г/л) концентрациях. Определены основные кинетические закономерности процесса биотранформации бетулина нерастущими клетками, предложена математическая модель, адекватно описывающая процесс биотрансформации. В результате сравнительного анализа трансформирующей активности родококков разных видов установлено, что наиболее высокая степень биоконверсии бетулина до бетулона достигается при использовании нерастущих клеток R. rhodochrous и R. erythropolis. На основе бетулона, полученного в результате бактериальной трансформации бетулина, путем последующей химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о биотрансформирующих свойствах родококков.

Экспериментально обоснована способность родококков разных видов к региоселективному окислению пентациклического тритерпеноида растительного происхождения бетулина в бетулон. Сравнительный анализ каталитической активности растущих и нерастущих клеток выявил высокий биотехнологический потенциал нерастущих клеток, применение которых позволяет существенно сократить (с 240 до 24 ч) продолжительность процесса биотрансформации и получить целевой продукт с высоким (60%) выходом. Использование простых (буферных) растворов в качестве трансформационной среды способствует упрощению выделения бетулона как исходного соединения для синтеза биологически активных соединений. На способ получения бетулона путем бактериальной трансформации бетулина нерастущими клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66, депонированного во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ АС-1898, составлена Заявка № от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ. Полученные данные могут быть использованы для разработки технологии эффективного получения бетулона с использованием родококков. Результаты диссертационных исследований используются в лекционных курсах “Биоразнообразие и систематика микроорганизмов” для магистрантов Пермского государственного национального исследовательского университета. Информация о наиболее активных штаммах биотрансформаторах бетулина включена в компьютеризированную базу данных Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов для использования в сети Интернет (http://www.iegm.ru/iegmcol/strains/index.html).

Основные положения, выносимые на защиту 1. Актинобактерии рода Rhodococcus в присутствии ростовых субстратов н-гексадекана, глюкозы, глицерина катализируют региоселективное окисление бетулина с образованием бетулона. При использовании растущей культуры родококков максимальный выход целевого продукта (72,2%) достигается в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана через 240 ч.

2. Использование суспензий нерастущих клеток родококков позволяет сократить продолжительность процесса биотрансформации бетулина (0,5 г/л) до 24 ч. При этом нерастущие клетки наиболее активно трансформируют бетулин при слабощелочных условиях среды (рН 8,0–9,0) и оптимуме клеточной биомассы в количестве 10 г/л. Биотрансформация бетулина протекает за счет адгезии бактериальных клеток к тритерпеновому субстрату.

3. В условиях использования повышенных концентраций бетулина (от 1, до 3,0 г/л) нерастущие клетки в течение 24 ч катализируют образование бетулона с выходом от 40 до 57% соответственно. Наиболее высокой бетулинтрансформирующей активностью характеризуются представители R. erythropolis и R. rhodochrous.

4. На основе бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, путем химической модификации синтезирован 3,4-секобетулин, перспективный в качестве противоопухолевого агента.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов “Симбиоз Россия 2011”, Воронеж, 2011;

VII Молодежной школе-конференции с международным участием “Актуальные аспекты современной микробиологии”, Москва, 2011;

4th Annual Russian-Korean Conference “Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology”, Новосибирск, 2012;

XVII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века”, Пущино, 2013;

Региональной конференции “Конкурс РФФИ – Пермский край. лет: итоги и перспективы”, Пермь, 2013;

5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Leipzig, 2013.

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе в изданиях, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий (“Вестник Уральской медицинской академической науки”, “Российский журнал биомеханики”) и изданиях, входящих в международную систему научного цитирования Scopus (“Process Biochemistry”). Подана заявка № “Способ получения бетулона” от 08.08.2013 на выдачу патента на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 наименований работ, в том числе отечественных и 190 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме “Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека” (номер госрегистрации 01201353247). Работа поддержана ФЦП “Научные и научно педагогические кадры инновационной России” (Соглашение № 8793), а также грантами Президента РФ “Ведущие научные школы” (НШ-5589.2012.4), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН (проект № 12-П-4 1044, номер госрегистрации 01201256869), Российского фонда фундаментальных исследований и Министерства промышленности, инноваций и науки Пермского края (проект № 11-04-96012-р_урал_а).

Научные положения и выводы диссертации базируются на результатах собственных исследований автора. Химическую модификацию бетулона, полученного в результате актинобактериальной трансформации бетулина, проводили на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь (лаборатория биологически активных соединений, зав. лабораторией к.х.н. Гришко В.В.).

Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина выполнено на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав. кафедрой д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям и учителям чл.-корр. РАН Ирине Борисовне Ившиной, к.х.н.

Виктории Викторовне Гришко, а также коллективу лаборатории алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН за помощь на всех этапах диссертационной работы.

Глава 1. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ПЕНТАЦИКЛИЧЕСКИХ ТРИТЕРПЕНОИДОВ 1.1. Биотрансформация пентациклических тритерпеноидов олеананового, урсанового и лупанового типа Пентациклические тритерпеноиды метаболиты растений и животных, представлены более чем двумя десятками структурных типов, среди которых наиболее распространены тритерпеноиды типа лупана, гопана, фриделана, урсана и олеанана (рис. 1). Данные соединения построены из пяти одинаково сочлененных колец и различаются положением метильных групп. Тритерпеноиды в свободном состоянии – это нелетучие липофильные вещества, растворимые в органических растворителях и нерастворимые в воде (Семенов, Карцев, 2000).

а б в г д е ж Рис. 1. Основные структурные типы пентациклических тритерпеноидов:

лупан (а), олеанан (б), урсан (в), гопан (г), тараксеран (д), бауран (е), фриделан (ж).

Типичными представителями тритерпеноидов лупанового ряда является бетулин (1, луп-20(29)-ен-3,28-диол) и бетулиновая кислота (2, 3-гидроксилуп 20(29)-ен-28-овая кислота), обнаруживаемые во многих видах листопадных деревьев рода Betula (Береза). В тонкой внешней коре (бересте) Betula alba (Береза белая) содержание бетулина достигает 10 35%, при этом большая часть его находится в микрокристаллической форме, что обусловливает белый цвет березовой коры. Бетулин активно используется для получения противовирусных, противовоспалительных, противоопухолевых соединений (Tolstikov et al., 2005).

Бетулиновая кислота и ее производные проявляют высокую противораковую, анти-ВИЧ, противовирусную, противовоспалительную, антисептическую, антимикробную, противомалярийную, антилейшманиозную, антигельминтную, фунгицидную активность (Yogeeswari, Sriram, 2005;

Moghaddam et al., 2012).

Вследствие селективной цитотоксичности против раковых клеток и удовлетворительного терапевтического индекса, бетулиновая кислота рассматривается как перспективный химиотерапевтический агент против рака (Cichewicz, Kouzi, 2004). 3-Оксопроизводное бетулиновой кислоты бетулоновая кислота (3) также встречается во многих растениях и обладает выраженным противовоспалительным, антимеланомным и противовирусным действием (Yogeeswari, Sriram, 2005).

CH2OH COOH 1 COOH 3 Наряду с химическими методами модификации предпринимаются попытки биологической трансформации лупановых тритерпеноидов (бетулина, 1;

бетулиновой кислоты, 2;

бетулоновой кислоты, 3;

лупеола, 4), а также их структурных аналогов – олеанановых (олеаноловой кислоты, 5;

глицирретовой кислоты, 7;

глицирризиновой кислоты, 8;

эхиноцистовой кислоты, 9;

лантадена, 10) и урсановых (урсоловой кислота, 6;

азиатиковой кислоты, 11;

-босвеллиевой кислоты, 12) тритерпеновых спиртов и кислот. Биокатализ позволяет проводить селективные трансформации в позициях молекулы, труднодоступных для химических агентов. При этом используются мягкие условия, нет необходимости в введении защитных групп, а проводимые в одну технологическую стадию реакции биопревращений характеризуются высокой степенью хемо-, регио- и стереоселективности.

COOH COOH 5 COOR COOH O O OH O OH OH OH O O OH OH OH COOH CO C C CH O COOH CH3 H O COOH HO CH2OH HOOC 11 Биотрансформация олеанановых тритерпеноидов. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что наиболее исследованным субстратом среди тритерпеновых кислот является глицирретовая кислота (7). Глицирретовая кислота (7) и ее гликозид (глицирризин) (8) обнаружены в различных видах Данные соединения, как и их многочисленные Glycyrrhza (Солодка).

производные, обладают выраженной фармакологической активностью, в том числе противоязвенной, противовоспалительной (Tolstikov et al., 1997;

Tolstikov et al., 1998;

Chung et al., 2001) и противоопухолевой (Ryu et al., 1994;

Luo et al., 2004). Показано (Mahato et al., 1992), что глицирретовая кислота индуцирует выработку интерферона и обладает противовирусным действием в отношении вируса гепатита, ее активно используют при лечении больных с острым и хроническим гепатитом для предотвращения злокачественного перерождения гепацитов и возникновения гепатоцеллюлярной карциномы (Arase et al., 1997;

van Rossum et al., 1998). Установлено, что глицерретовая кислота способствует снижению множественной лекарственной резистентности раковых клеток при совместном использовании с хемотерапевтическими агентами (Nabekura et al., 2008).

Описаны многочисленные примеры биоконверсии глицирретовой кислоты с использованием культур грибов. Как правило, первым этапом (7) биотрансформации соединения 7 является гидроксилирование, при этом гидроксильные группы могут вводиться в различные положения молекулы. Так, показана способность культур Curvularia lunata ATCC 13432 (Canonica et al., 1966), Curvularia lunata KA-91 (He et al., 2011), Mucor spinosus AS 3.3450 (Ma et al., 2008), Cunninghamella elegans TSY-0865 (Choudhary et al., 2009) к селективному 7-гидроксилированию кислоты 7 с образованием соединения 13.

При использовании представителей аскомицетов Trichotecium roseum ATCC (Canonica et al., 1967) и Absidia pseudocylinderospora ATCC 24169 (Maatooq et al., 2010) достигается возможность гидроксилирования в положения С(7) и/или С(15) с образованием соответствующих моногидрокси- и (13, 14) дигидроксипроизводных (15). При этом показано, что 7,15-глицирретовая кислота (15) проявляет выраженные гепатопротекторные свойства (Maatooq et al., 2010). Среди основных продуктов биотрансформации с использованием бактерий Streptomyces sp. G-20 зарегистрированы 22-гидроксиглицирретовая кислота (16), а также минорные метаболиты и 22,24 – 22,23-дигидрокси- (17) дигидроксиглицирретовая (18) кислоты (Sakano, Ohshima, 1986a). Наряду с реакциями гидроксилирования многие микроорганизмы катализируют реакцию окисления 3-гидроксигруппы. Так, среди продуктов биотрансформации кислоты 7 грибами Mucor polymorphosporus AS 3.3443 наряду с основными (7-гидрокси (13) и 15-гидрокси- (14)) и минорными (7-, 6- и 24-гидроксипроизводные (1921)) метаболитами зарегистрированы 3-оксо-7-гидрокси- (1,1%) (22) и 3 оксо-15-гидроксиглицерретовая (0,9%) (23) кислоты (Xin et al., 2006). Позже показана способность Mucor polymorphosporus AS 3.3443 к гидроксилированию глицирретовой кислоты (7) в 6,7- (26) и 27-положения (27) (Xin et al., 2010). В процессе биотрансформации глицирретовой кислоты (7, 0,3 г/л) культурой грибов Cunninghamella blakesleeana AS 3.970 регистрируется образование двух основных кислот – 3-оксо-7-гидрокси- (22, 30%) и 7 -гидроксиглицерретовой (13, 25%), а также минорных метаболитов (3-оксо-7-гидрокси- (24), 7-гидрокси- (19) и предположительно 3-оксо-7,15-дигидроксипроизводное При этом (25)).

начальный этап трансформации кислоты 7 при использовании штамма Cunninghamella blakesleeana AS 3.970 – гидроксилирование в положение С(7) (в течение первых 24 ч) и через 48 ч окисление 3-гидроксигруппы до карбонильной 2010). Культура (Qin et al., Cunninghamella echinulata ATCC 8688a трансформирует кислоту 7 с образованием уникальных 1-гидрокси- (28), 15 гидрокси-18Н- (29) и 13-гидрокси-7,27-окси-12,13-дигидроглицирретовой кислот (30) (последний метаболит является перспективным гепапротектором).

Следует особо отметить, что Cunninghamella echinulata ATCC 8688a – первый из описанных микроорганизмов, изменяющий стереохимию глицирретовой кислоты.

Предполагается, что стереоинверсия атома Н в положении С(18) происходит за счет образования и последующего восстановления двойной связи С(18)-С(19).

Промежуточными продуктами в процессе образования кислоты 30, вероятнее всего, являются С(7) и С(27) гидроксипроизводные, однако в среде ферментации они не были обнаружены (Maatooq et al., 2010). Способность к селективному окислению гидроксильной группы кислоты 7 с образованием соответствующего 3-оксопроизводного (31) обнаружена у представителей аскомицетов Gliocladium viride ATCC 10097 (Maatooq et al., 2010) и ‘Fusarium lini’ (Fusarium oxysporum) * NRRL-68751 (Choudhary et al., 2009). Показано, что 3-оксоглицирретовая кислота (31) оказывает ингибирующее действие на липоксигеназу, что может быть использовано при лечении бронхиальной астмы, воспаления, рака и аутоиммунных заболеваний.

Высказано предположение (Para et al., 2009), что окисление 3 гидроксильной группы – начальный этап окислительного расщепления кольца А (аналогично химической реакции Байера-Виллигера) и образования тритерпеновых секопроизводных. Способность к трансформации кислоты 7 с образованием секопроизводных обнаружена у некоторых представителей микроорганизмов. Так, бактерии Chainia antibiotica (Streptomyces sclerotialus) IFO 12246 катализируют реакцию окислительного расщепления кольца А глицирретовой кислоты (7) с образованием 4-гидрокси-11-оксо-3,4-секо-18 олеан-12-ен-3,30-диовой (32) и 4,7-дигидрокси-11-оксо-3,4-секо-18-олеан-12 ен-3,30-диовой кислот (33).

В обзоре инвалидные виды или устаревшие названия таксонов бактерий и грибов (согласно существующим * правилам) приведены без курсива и в кавычках. В скобках приведены современные названия таксонов или синонимы к существующим (если таковые имеются).

COOH COOH 22 O O R3 R 3 7 R2 HO R1 HO R 23 R4 R4 R 13: R1 = ОН, R2 = R3 = H, R4 = CH3 18: R1 = R2 = Н, R3 = ОН, R4 = CH2OH 14: R1 = H, R2 = ОН, R3 = Н, R4 = CH3 19: R1 = Н, R2 = ОН, R3 = Н, R4 = CH 15: R1 = R2 = ОН, R3 = Н, R4 = CH3 20: R1 = ОН, R2 = R3 = Н, R4 = CH 16: R1 = R2 = Н, R3 = ОН, R4 = CH3 21: R1 = R2 = R3 = Н, R4 = CH2ОН 17: R1 = R2 = Н, R3 = ОН, R4 = CH2ОН COOH COOH O O R R 3 7 R3 6 O R2 HO R R1 R 22: R1 =H, R2 = OH, R3 = Н 26: R1 = Н, R2 = R3 = OH, R4 = CН 23: R1 = R2 = Н, R3 = OH 27: R1 = R2 = R3 = Н, R4 = СH2ОН 24: R1 = H, R2 = ОН, R3 = Н 28: R1 = OH, R2 = R3 = Н, R4 = CН 25: R1 = Н, R2 = OH, R3 = OH COOH COOH HO H O O OH O HO HO 29 COOH COOH O O R HOOC 3 HO O R 32: R1 = R2 = H 33: R1 = OH, R2 = H 34: R1 = H, R2 = OH COOH 30 COOR O O COOH HOOC O 3 R1O R R3 36: R1 = R2 = Н, R3 = COOH, R4 = Н 37: R1 = R2 = Н, R3 = R4 = CH 38: R1 = COCH3, R2 = ОН, R3 = CH3, R4 = Н 30 COOH COOH R3 H O O 15 3 7 R2 7 R HO R1 HO R 39: R1 = R2 = H, R3 = H 46: R1 = R2 = Н 40: R1 = R2 = H, R3 = H 47: R1 = ОН, R2 = Н 41: R1 = OH, R2 = H, R3 = H 48: R1 = Н, R2 = ОН 42: R1 = H, R2 = OH, R3 = H 49: R1 = R2 = ОН 43: R1 = R2 = OH, R3 = H 44: R1 = OH, R2 = H, R3 = H 45: R1 = R2 = OH, R3 = H Аналогичную активность проявляет Chainia antibiotica (Streptomyces sclerotialus) IFO 12246 в отношении кислоты 16, при этом в качестве метаболита регистрируется соединение 34 (Sakano, Ohshima, 1986b). Способность к окислительному расщеплению кольца А глицирретовой кислоты (7) обнаружена у бактериального штамма катализирующего Sphingomonas paucimobilis G5, образование преимущественно 11-оксо-3,4-секо-4,23,24-тринор-олеан-12-ен 3,28,30-триовой кислоты (35) (Yoshida et al., 2001а), а в присутствии ингибиторов оксигеназ (1-аминобензотриазола и метирапона) промежуточный продукт – 3 гидрокси-11-оксоолеан-12-ен-24,30-диовую кислоту (36) (Yoshida et al., 2001b).

Это свидетельствует об активном участии в расщеплении кольца А глицирретовой кислоты (7) оксигеназных ферментов.

Описаны единичные примеры образования эфиров глицирретовой кислоты (7) с использованием микроорганизмов. Показана способность актинобактерий Nocardia sp. NRRL 5646 к этерификации кислоты 7 с образованием ее 28 метилового эфира (37) (Zhang et al., 2005). Среди продуктов биотрансформации глицирретовой кислоты (7) с участием грибов Mucor polymorphosporus AS 3. обнаружена 3-О-ацетил-7-гидроксиглицирретовая кислота (38) (Xin et al., 2006).

Исследована возможность биотрансформации эпимеров 18Н-кислоты 7: 18Н глицирретовой (46), 18Н-ликвиритовой (39) и 18Н-ликвиритовой (40) кислот представителями грибов Curvularia, Trichothecium, Cunninghamella, Mucor и Показано, что культуры Helicostylum. Curvularia lunata ATCC 13432, Trichothecium roseum ATCC 8685, Cunninghcimella sp. ATCC 3229, Mucor griseocyanus ATCC 1207-а, Helicostylum piriforme ATCC 8992 трансформируют кислоты 39 и 46 в соответствующие 7-гидрокси-(41, 47), 15-гидрокси-(42, 48) и 7,15-дигидроксипроизводные (43, 49). В процессе биотрансформации 18Н кислоты (40) с использованием культур Helicostylum piriforme ATCC 8992 и Cunninghamella sp. ATCC 3229 в качестве основного метаболита регистрируется 7-гидроксипроизводное (44), в то время как Trichothecium roseum ATCC катализирует 7,15-дигидроксилирование кислоты 40 с образованием кислоты 45 (Ferrari et al., 1969).

30 COOR2 OH O OH OH O OH 50: R1 =, R2 = H OH O OH R1 OH OH O O OH OH OH 51: R1 =, R2 = NH В связи с тем, что кислота 7 в растениях чаще всего встречается в растениях в виде гликозида (сапонина) – глицирризиновой кислоты, или глицирризина (8), актуален поиск микроорганизмов, способных катализировать гидролиз гликозидных связей с образованием соответствующих моногликозида или агликона. Так, описан процесс биотрансформации глицирризина (8) дрожжами Cryptococcus magnus MG-27 с образованием до 95% 3-О-моно--D-глюкуронида (50) (Kuramoto et al., 1994). Описаны многочисленные примеры биоконверсии глицирризина (8) с использованием грибов рода Aspergillus. Так, в оптимальных условиях представители Aspergillus terreus, продуцирующие внеклеточные формы -D-глюкоронидазы, катализирует образование 3-О-моно--D-глюкуронида (50) и кислоты 7 с выходом 51,5 и 26,8% соответственно (Amin et al., 2010). В процессе инкубирования Aspergillus parasiticus Speare BGB в присутствии глицирризина (8) через 96 ч выход глицирретовой кислоты (7) составлял 95% (Wang et al., 2010).

Культуры грибов видов Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus tamari трансформируют глицирризин (8) в 3-оксоглицирретовую кислоту (31), при этом в качестве промежуточного продукта регистрируется кислота 7 (Yamada et al., 1994). Использование иммобилизованных клеток Aspergillus terreus в процессе биотрансформации глицирризината аммония (51) позволяет получать глицирретовую (7) и 3-оксоглицирретовую (31) кислоты с выходами 21,7 и 4,1% соответственно (El-Minofi, 2005). Среди метаболитов биоконверсии глицирризина (8) с использованием Aspergillus niger зарегистрированы 15-гидрокси-3,11-диоксо-олеан-12-ен-30-овая (23) и 7,15 дигидрокси-3,11-диоксо-олеан-12-ен-30-овая (25) кислоты продукты – последовательного гидролиза глицирризина (8) до агликона глицирретовой кислоты и ее последующего окисления путем дегидрирования и (7) гидроксилирования (Каng et al., 2008;

Huang et al., 2009).

В настоящее время накоплен сравнительно большой объем экспериментальных данных по биотрансформации олеаноловой кислоты (5) и ее производных. Олеаноловая кислота (5) – один из наиболее распространенных пентациклических тритерпеноидов, который продуцируется кормовыми и лекарственными растениями в свободном виде или в форме тритерпеноидных гликозидов. Олеаноловая кислота и ее производные обладают противоопухолевой (Huang et al., 2006), противовоспалительной (Dharmappa et al., 2009), противовирусной (Horiuchi et al., 2007), гепатопротекторной (Kinjo et al., 1999), анти-ВИЧ (Mengoni et al., 2002), антимикробной (Horiuchi et al., 2007) и др.

активностью (Sultana, Ata, 2008).

Спектр реакций, катализируемых микроорганизмами различных таксономических групп, достаточно широк и включает преимущественно реакции гидроксилирования (в положения 1, 2, 6, 7, 15, 11, 21, 30), а также реакции дегидрирования с образованием двойных связей, окисления нативной и вводимых гидроксильных групп, изомеризации двойной связи, циклизации с образованием лактонов.

Так, среди продуктов биотрансформации олеаноловой кислоты (5) с использованием грибов Cunninghamella blakesleeana зарегистрированы 3,7 дигидроксиолеан-12-ен-28-овая (52), 1,3-дигидроксиолеан-12-ен-28-овая кислоты (53), в то время как ‘Fusarium lini’ (Fusarium oxysporum) IFO катализирует реакцию 15-гидроксилирования с образованием кислоты 54 (Hikino et al., 1969;

Hikino et al., 1972a). В процессе биотрансформации кислоты 5 с использованием Penicillium melinii образуются соответствующие 21-гидрокси (55), 21-гидрокси- (56), 7,21-дигидрокси- (57) производные. Установлено, что кислота 56 обладает выраженной антибактериальной активностью против Staphylococcus aureus и его метициллин-устойчивых форм (Ai et al., 2012).

Показана способность грибов Rhizomucor miehei CECT 2749 к гидроксилированию кислоты 5 в положения С(30) (5%), С(7)/С(30) (6%) или С(1)/С(30) (5%) с образованием 58, 59 и 60 соответственно (Martinez et al., 2013). Y. Fujii с соавт.

(2006) использовали рекомбинантный штамм Escherichia coli c экспрессированными генами цитохрома P450 из бактерий Nonomuraea recticatena IFO 14525 (moxA) и Pseudomonas (camAB) для биотрансформации олеаноловой кислоты (5). При этом в качестве основного метаболита идентифицирована 3,30 дигидроксиолеан-12-ен-28-овой кислота (58) (3,3%), повышение выхода которого до 17% достигнуто за счет использования экстрактов Escherichia coli, полученных в результате разрушения бактериальных клеток. Экспериментально доказано (Kinoshita et al., 1999), что кислота 58 обладает выраженным противоопухолевым действием, в то время как 7-гидроксипроизводное олеаноловой кислоты (5) проявляет выраженную (95%) антимикробную активность (Kuete et al., 2007).

Обнаружена способность ‘Fusarium lini’ (Fusarium oxysporum) NRRL- катализировать 2- и 11-гидроксилирование олеаноловой кислоты (5) с образованием 2,3-дигидроксиолеан-12-ен-28-овой (4%) (61) и 2,3,11 тригидроксиолеан-12-ен-28-овой (62) (3%) кислот. Выявлено (Choudhary et al., 2008), что гидроксилированные производные олеаноловой кислоты (5) оказывают ингибирующее действие на -глюкозидазу потенциальную мишень препаратов при лечении сахарного диабета. При этом их активность сравнима с действием препарата деоксиноджиримицин и превосходит по уровню препарат акарбоза.

Описан процесс биотрансформации олеаноловой кислоты (5) культурой грибов катализирующей реакцию селективного Aspergillus ochraceus NG1203, образования 3,11-дигидроксиолеан-12-ен-28-овой кислоты (63) с выходом 10,1% (Wang et al., 2006).

Процессы гидроксилирования кислоты 5 представителями грибов зачастую сопровождаются реакциями окисления нативной и вводимых гидроксильных групп. Так, среди продуктов биотрансформации олеаноловой кислоты (5) Cunninghamella blakesleeana зарегистрирована 3-гидрокси-11-оксо-12-ен-овая кислота (64) (Hikino et al., 1969), а при инкубировании Penicillium chrysogenum получены 3,21-дигидрокси- (55), 3-гидрокси-21-оксо- (65) и 3-оксо-21 гидрокси- (67) производные (Hikino et al., 1971). Способность к 7/21 гидроксилированию и окислению 3-гидроксильной группы олеаноловой кислоты (5) характерна для культуры Mucor rouxii (Amylomyces rouxii) NRRL 1894, катализирующей образование 3-оксо-7-гидрокси- (68, 1,2%), 3-оксо-21 гидрокси- (67, 3,2%), 3-оксо-7,21-дигидрокси- (69, 6,3%), 3,7,21 тригидрокси- (70, 2,6%) производных. Показано, что кислота 68 проявляет высокую антимикробную активность в отношении Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, болезнетворных микроорганизмов полости рта (Capel et al., 2011). Среди продуктов биотрансформации кислоты 5 с использованием культуры Colletotrichum phomoides (Glomerella cingulata) IFO 5257 получены соответствующие производные 6-гидрокси- (71), 6,21 дигидрокси- (72) и 6-гидрокси,21-оксо- (66) производные (Hikino et al., 1972b).

Известны немногочисленные примеры биокаталитического дегидрирования олеаноловой кислоты (5) с образованием двойных связей. Так, культура катализирует образование 3-гидроксиолеан Cunninghamella blakesleeana 11,13(18)-диен-28-овой (73) и 3,7-дигидроксиолеан-11,13(18)-диен-28-овой (74) кислот (Hikino et al., 1969), в то время как с использованием штамма ‘Fusarium lini’ (Fusarium oxysporum) IFO 5880 получена лишь кислота 73 (Hikino et al., 1972a). Кроме того, культуры Cunninghamella blakesleeana и ‘Fusarium lini’ (Fusarium oxysporum) IFO 5880 характеризуются уникальной способностью к образованию лактонов 75 и 78. Описаны единичные примеры бактериальной трансформации кислоты 5. Так, Nocardia sp. NRRL 5646 трансформирует кислоту 5 с образованием ее 28-метилового эфира (79) (Zhang et al., 2005).

D. Liu c соавт. (2011) исследовали процесс биотрансформации кислоты 5 с использованием культур грибов Alternaria longipes AS 3.2875 и Penicillium adametzii AS 3.447. Показано, что первый этап биоконверсии олеаноловой кислоты (5) Alternaria longipes AS 3.2875 – введение углеводных остатков в положения С(3) и/или С(28) с образованием гликозидов 8082.

30 R R R R R 28COOH 28COOH R 3 7 R3 3 HO R HO R 52: R1 = R3 = R4 = H, R2 = OH, 58: R1 = R2 = R3 = R4 = Н, R5 = CH2OH 53: R1 = OH, R2 = R3 = R4 = Н 59: R1 = R2 = R4 = Н, R3 = OH, R5 = 54: R1 = R2 = R4 = Н, R3 = OH CH2OH 55: R1 = R2 = R3 = Н, R4 = OH 60: R1 = OH, R2 = R3 = R4 = Н, R5 = 56: R1 = R2 = R3 = Н, R4 = OH CH2OH 57: R1 = R3 = H, R2 = OH, R4 = OH 61: R1 = R3 = R4 = Н, R2 = OH, R5 = CH 62: R1 = R3 = H, R2 = OH, R4 = OH, R5 = CH 63: R1 = R2 = R3 = Н, R4 = OH, R5 = CH R5 R 21 R 28COOH 28COOR 3 3 6 R1 R3 HO R R R 64: R1 = OH, R2 = R3 = R5 = H, R4 = O 70: R1 = R4 = H, R2 = R3 = OH 65: R1 = OH, R2 = R3 = R4 = H, R5= O 71: R1 = OH, R2 = R3 = R4 = H 66: R1 = R3 = R4 = H, R2= OH, R5 = O 72: R1 = R3 = OH, R2 = R4 = H 67: R1 = O, R2 = R4 = R3 = H, R5 = OH 68: R1 = O, R2 = R4 = R5 = H, R3 = OH O O 69: R1 = O, R2 = R4 = H, R3 = OH, R5 = OH R1 R 13 R3 R COOH 75: R1 = R2 = H, R3 = OH, R4 = OH 76: R1 = R4 = H, R2 = ОH, R3 = OH 3 77: R1 = OH, R3 = O, R2 = R4 = H HO R 73: R = H 74: R = OH R3 R OH O 19 O 28COOR R 3 HO R 79: R1 = R2 = R3 = H, R4 = CH 80: R1 = R3 = R4 = R5 = H OH O OH OH OH R2 = 81: R1 = R2 = R3 = R4 = H OH O OH OH OH R5 = 82: R1 = R3 = R4 = H OH O OH OH OH R2 = R5 = 83: R1 = R3 = OH, R2 = R4 = H OH O OH OH OH R5 = 84: R1 = R2 = R3 = H, R4 = ОН OH O OH OH OH R5 = 30 COOCH HO O COOR C HO O HO OH O OH HO R1O OH 23 CH2OH OH OH R4 R O 29 OH OH OH 90: R1 = H, R2 = O COOH R1 OH OH 3 OH OO R 23R OH 86: R1 = OH, R2 = OH, R3 = R4 = OH OH СH3, R5 = CH2OH 91: R1 = R2 = H 87: R1 = Н, R2 = CH3COO, R3 = R4 = O OH R5 = CH3 OH 92: R1 = H, R2 = 88: R1 = R2 = OH, R4 = СH3, R3 = СH2OH, R5 = COOCH 89: R1 = R2 = OH, R3 = R4 = CH2OH, R5 = COOCH R3 R R R1 28COOH 28COOR O O R1 93: R1 = R3 = CH3, R2 = H 97: R1 = R2 = OH, R3 = H 94: R1 = CH3, R2 = H, R3 = COOH 98: R1 = R2 = R3 = OH 95: R1 = CH2OH, R2 = H, R3 = COOH 96: R1 = R3 = CH3, R2 = H OH O OH OH OH R2 = R 28COOR COOH HO HOOC HO COOH 100: R1 = CH2Cl, R2 = H 101: R1 = H, R2 = СH R COOH O O CO CH CC H3C H 102: R = O CO H CC H3C CH 103: R = O CO CH CC H CH 104: R = В дальнейшем 3.2875 катализирует реакции Alternaria longipes AS гидроксилирования глюкопиранозида в С(2) и С(19) положения с образованием 83, а в результате миграции метильной группы из положения С(20) в С(19) происходит перегруппировка олеананового углеродного скелета в урсановый с образованием соединения 85. Процесс биотрансформации кислоты Penicillium adametzii AS 3.447 включает реакции 7-/21-гидроксилирования и 28-гликозилирования c образованием 55, 70 и 84. Следует отметить, что реакции гликозилирования не характерны для микробных трансформаций, особенно в водной среде. Способность Alternaria longipes AS 3.2875 и Penicillium adametzii AS 3.447 вводить углеводные остатки в структуру олеаноловой кислоты (5) перспективна для региоселективного синтеза водорастворимых олеанановых гликозидов. Показано, что продукты биоконверсии кислоты 5 Penicillium adametzii AS 3.447, также как и олеанановый 3-О--D-глюкопиранозид обладают выраженным цитотоксичным действием в отношении клеточной линии Hela (карциома шейки матки) по сравнению с исходным соединением. При этом введение гидроксильных групп в С(7)/С(21) положения или углеводного остатка в С(3) способствуют повышению, а С(28) гликозилирование снижению уровня цитотоксичности (Liu et al., 2011).

Наряду с работами по биотрансформации олеаноловой кислоты (5) ведутся исследования по поиску микроорганизмов, способных к биоконверсии ее эфиров, гликозидов, гидроксилированных и 3-оксопроизводных. Так, исследована каталитическая активность грибов Rhizomucor miehei CECT 2749 в отношении 2 гидроксипроизводного олеаноловой кислоты кратеговой кислоты (61).

Показано, что данный микроорганизм катализирует образование лактона и реакцию С(30) гидроксилирования, при этом выход (0,5%) гидроксипроизводного 86 составил 11% (Martinez et al., 2013).

С целью изучения влияния функциональных групп в С(3) положении на эффективность биоконверсии олеанановых тритерпеноидов изучен процесс биотрансформации олеаноловой (5), (93), 3-О 3-оксоолеаноловой ацетилолеаноловой кислот (87) и экскулентозида A (91). Среди 12 исследованных штаммов микроорганизмов отобраны бактерии Streptomyces griseus ATCC 13273 и грибы 40330, проявляющие наибольшую Aspergillus ochraceus CICC каталитическую активность в отношении исследуемых соединений. Установлено, что 13273 катализирует реакцию 24 Streptomyces griseus ATCC гидроксилирования и окисления С(29) метильной группы кислоты 93 с образованием 3-оксоолеан-12-ен-28,29-диовой (94) и 24-гидрокси-3-оксо-олеан 12-ен-28,29-диовой (95) кислот, в то время как Aspergillus ochraceus катализирует введение углеводного остатка в положении С(28) с образованием 96. Подобная реакционная активность наблюдается и при культивировании исследованных штаммов в присутствии кислоты 5. Показано, что Streptomyces griseus ATCC 13273 и Aspergillus ochraceus CICC 40330 катализируют гидролиз гликозидной связи эскулентозида A (91) с образованием эскулентозида В (92) и не активны в отношении оленолового эфира (87). При этом Streptomyces griseus ATCC катализирует полное дегликолизирование и биоконверсию исследуемого субстрата с образованием фитолаккагенина (88) с последующим С(29) гидроксилированием до кислоты В процессе биотрансформации 89.

фитолаккагенина (88) культурой Aspergillus ochraceus CICC 40330 получено его гликолизированное производное что свидетельствует о высокой 90, селективности гликозидаз Aspergillus ochraceus CICC 40330 (Zhu et al., 2011).

Способность к биотрансформации 3-оксоолеаноловой кислоты (93) обнаружена у грибов 3.67, при этом среди метаболитов Absidia glauca CGMCC идентифицированы 1,11-дигидрокси-3-оксо-олеан-12-ен-28-овая (97, 2,3%) и 1,11,21-тригидрокси-3-оксо-олеан-12-ен-28-овая (98, 0,23%) кислоты, а также лактон 77 (0,74%) (Guo et al., 2010). Наряду с реакцией 21-гидроксилирования грибы Chaetomium longirostre RF-1095 катализируют реакцию окислительного расщепления кольца А 3-оксоолеаноловой кислоты (93) с образованием 4 гидрокси-3,4-секо-олеан-12-ен-3,28-диовой кислоты (99) (Shirane et al., 1996).

Описан единственный пример биотрансформации сенегенина (100) с использованием актинобактерий Nocardia sp. NRRL 5646. В результате разрыва С-С связи и реакции С(28) этерификации образуется метиловый эфир сенегениновой кислоты (101) (Zhang et al., 2005).

Лантаден А (10), биологически активный пентациклический тритерпеноид, выделен из вечнозелёного кустарника Lantana camara (Лантана сводчатая) (Hart et al., 1976;

Sharma et al., 1988;

Sharma, Sharma et al., 1989) и проявляет противовирусные, противоопухолевые (Inada et al., 1995;

Inada et al., 1997) и антиоксидантные свойства (Grace-Lynn et al., 2012). Из почвы выделен бактериальный штамм Pseudomonas pickettii (Ralstonia pickettii), способный к использованию лантадена (10) в качестве единственного источника углерода и энергии (Sharma, 1997). Уровень деградации лантадена А (10) представителями базидиомицетов Trametes versicolor MTCC-138, Heterobasidion annosum MTCC 146, Phellinus pini (Porodaedalea pini) RAB-83-19, Pleurotus ostreatus MTCC-142 и Phlebia radiata 2 составил 84–89%, в то время как Pleurotus sajor-caju (Lentinus sajor-caju) и Merulius tremellosus (Phlebia tremellosa) PRL-2845 не способны к утилизации тритерпенового субстрата (Singh et al., 2001). Бактериальный штамм Alcaligenes faecalis MTCC 3134 также не использует лантаден А (10) как ростовой субстрат, но в присутствии сахарозы через 15 сут после начала культивирования катализирует образование изомера лантадена Х (103) на его основе. При этом Alcaligenes faecalis не трансформирует другой изомер – лантаден В (104), что свидетельствует о стереоспецифичности его ферментной системы (Singh et al., 1999).

Описаны единичные примеры биотрансформации -амирина (105) и его производных с использованием микроорганизмов. G.E. Yang с соавт. (2008) исследовали процесс биотрансформации ацетата -амирина (106) (0,1 г/л) с использованием представителей фотосинтетических бактерий Rhodobacter sphaeroides, который катализируют гидролиз ацетата (106) до -амирина (105) и последующее гидроксилирование с образованием 3,23-дигидрокси-олеан-12-ена и 3,28-дигидрокси-олеан-12-ена (эритродиола) (108). При этом (107) экспериментально обосновано, что деацитилаза имеет широкую субстратную специфичность, в то время как 23/28-гидролазы строго специфичны. Описан процесс биотрансформации -амирина (105) с образованием 3-гидроксиолеан 12-ен-11-она (109) и 11,12-окситараксерола (110) при использовании грибов Lecanicillium muscarium (Cephalosporium aphidicola) (Martins, Takahashi, 2010).

Авторы предполагают, что образование эпоксида результат (110) последовательных реакций С(11) гидроксилирования, дегидрирования с образованием двойной связи С(14)-С(15) и миграции С(27) метильной группы в положение С(14).

O R 28R R1 H 23 R 105: R1 = R2 = H, R3 = R4 = CH3 106: R1 =OCCH3, R2 = H, R3 = R4 = CH 107: R1 = R2 = H, R3 = CH2OH, R4 = CH 108: R1 = R2 = H, R3 = CH3, R4 = CH2OH 109: R1 = H, R2 = O, R3 = R4 = CH Биотрансформация урсановых тритерпеноидов. Урсоловая кислота (6) обладает разнообразным спектром биологической активности, включая противоопухолевую (Hsu et al., 2004;

Ma et al., 2005), антибактериальную (Fonranay et al., 2008), антимутагенную (Aparecida Resende et al., 2006), антиаритмическую, гепатопротекторную (Saraswat et al., 2000), гиполипидемическую (Somova et al., 2003;

Min et al., 2008), антиоксидантную (Ramachandran, Prasad, 2008), иммуномодулирующую (Raphael, Kuttan, 2003;

Jang et al., 2009), анти-ВИЧ (Lee et al., 2008a) и анаболическую (Lee et al., 2008b).

Немногочисленные сведения, касающиеся микробиологической трансформации урсоловой кислоты (6) появились относительно недавно. Так, штаммы грибов Syncephalastrum racemosum AS 3.264 (Huang et al., 2012a) и CGMCC 3.2500 (Fu et al., 2013) характеризуются схожей реакционной активностью и катализируют реакции 1,21-гидроксилирования и последующего окисления 21-гидроксильной группы с образованием соединений 111 и соответственно. Установлено, что Syncephalastrum racemosum CGMCC 3. катализирует введение гидроксильных групп в С(7)/С(21) положения с образованием дигидроксипроизводного (113). Среди продуктов биоконверсии кислоты 6 Syncephalastrum racemosum AS 3.264 и CGMCC 3.2500 также регистрируются эпоксид 121 и лактоны 116, 117. Показано, что 1,3-дигидрокси урс-12-ен-21-он-28-овая кислота (112) проявляет умеренную ингибирующую активность в отношении протеин-тирозин-фосфатазы 1В (77,0%), что на 19,3% меньше по сравнению с исходной кислотой 6, при этом активность других метаболитов не превышала 10%. Показано, что введение дополнительных О содержащих групп в молекулу урсоловой кислоты (6) не приводит к повышению противовирусной активности – полученные соединения 112117 проявляли низкую ингибирующую активность в отношении вируса герпеса (Huang et al., 2012;

Fu et al., 2013). Образование лактонов 118120 наблюдается также в процессе биотрансформации кислоты г/л) с использованием 6 (0, представителей эндофитных грибов Umbelopsis isabellina. Предполагается (Fu et 2011а), что данные реакции могут катализироваться ферментами al., трансферазами и эстеразами. Показана способность эндофитных грибов Pestalotiopsis microspora, выделенных из лекарственного растения Huperzia serrata (Плаун пильчатый), к трансформации кислоты 6 (0,077 г/л). При этом наряду с 15/30-гидроксилированными производными среди (114, 115) метаболитов зарегистрированы продукты окисления 3-гидроксильной группы и дальнейшего окислительного расщепления кольца А 15,30 – дигидроксиурсоновая (122) и 4,30-дигидрокси-3,4-секо-урс-12-ен-3,28-диовая (127) кислоты (Fu et al., 2011b). Культура грибов Aspergillus flavus ATCC катализирует селективную окислительную биотрансформацию кислоты 6 с образованием урсоновой кислоты (123) (Ibrahim et al., 2008).

Исследована трансформирующая активность актинобактерий рода Nocardia sp. в отношении кислоты 6. Установлено, что штамм Nocardia sp. 43069 не способен к биотрансформации урсоловой кислоты (6). В то время как нерастущие клетки Nocardia sp. 45077 катализируют образование урсоновой кислоты (123) и 3-оксо-урса-1,12-диен-28-овой кислоты (128), Nocardia sp. 46002 катализирует только реакцию окисления 3-гидроксильной группы. Инкубация Nocardia sp.

44822, Nocardia sp. 44000, Nocardia sp. NRRL 5646 в присутствии кислоты приводит к образованию соответствующего метилового эфира (125), а также кислот 123, 128 и их метиловых эфиров (124, 129) (Leipold et al., 2010). J. Zhang с соавт. (2005) описал процесс биотрансформации кислоты 6 Nocardia sp. NRRL 5646. Показано, что основной метаболит – метиловый эфир олеаноловой кислоты (79) образуется за счет миграции метильной группы из положения С(19) в положение С(20) и последующей этерификации полученной олеаноловой кислоты (5) (Zhang et al., 2005). Таким образом, для представителей Nocardia sp.

характерно несколько метаболических путей трансформации урсоловой кислоты (6): (1) миграция метильной группы с образованием олеананового остова, (2) окисление гидроксильной группы с последующим дегидрированием С(1)-С(2) связи, (3) этерификация урсоловой кислоты с последующием окислением С(3) гидроксильной группы и дегидрированием С(1)-С(2) связи.

R 30 R R R R 28COOH O 15 1 O 7 R R R 111: R1 = OH, R2 = R3 = H, R4 = OH, 116: R1 = R2 = H, R3 = OH R5 = CH3 117: R1 = H, R2 = R3 = OH 112: R1 = OH, R2 = R3 = H, R4 = O, R5 = 118: R1 = R3 = H, R2 = OH CH3 119: R1 = OH, R2 = R3 = H 113: R1 = R3 = H, R2 = OH, R4 = OH, 120: R1 = R2 = R3 = H R5 = CH 114: R1 = R2 = R4 = H, R3 = OH, R5 = CH 115: R1 = R2 = R4 = H, R3 = OH, R5 = CH2OH 30R OH O COOH 28COOR 3 R R 122: R1 = O, R2 = OH, R3 = H, R4 = CH2OH 123: R1 = O, R2 = R3 = H, R4= CH 124: R1 = O, R2 = H, R3 = R4 = CH 125: R1 = OH, R2 = H, R3 = R4 = CH 126: R1 = OH, R2 = H, R4 = CH OH O OH OH OH R3 = CH2OH COOH HOOC HO 28CH2OR COOR R1 R R R 128: R1 = R2 = R4 = H, R3 = CH3 131: R1 = R2 = H 129: R1 = R2 = H, R3 = CH3, R4 = CH3 132: R1 = R2 = CON(CH3) 130: R1 = R2 = OH, R3 = CH2OH, R4 = H 30R OH R 21 R COOCH3 COOH OH R OH H 23 CH2OH 134: R1 = R2 = R3 = H, R4 = CH2OH 135: R1 = R2 = H, R3 = OH, R4 = CH 136: R1 = R2 = H, R3 = OH, R4 = CН2OH 137: R1 = OH, R2 = R3 = H, R4 = CH 138: R1 = R3 = H, R2 = OH, R4 = CH 139: R1 = R2 = R3 = H, R4 =COOH COOH O R H CH2OH 140: R = H 141: R = OH По данным D.

Leipold с соавт. (2010), окислительная биотрансформация урсоловой кислоты (6) нокардиями может быть связана с активностью 3 гидроксистероид- и 3-кетостероид-1-дегидрогеназ, катализирующих окисление 3-гидроксильной группы и введение двойной связи в кольцо А стероидов соответственно.

Описан единичный пример микробиологического гликолизирования кислоты 6 с использованием грибов Alternaria longipes AS3.2875 (Yan et al., 2012).

При этом выход 28-О--D-глюкопиранозила урсоловой кислоты (126) не превышал 5% через 3 сут в условиях внесения субстрата в концентрации 0,3 г/л.

D. Collins с соавт. (2002) исследован процесс биотрансформации производных кислоты 6: метилового эфира урсоловой кислоты (125), 3,28 дигидрокси-урс-12-ена (уваола) (131) и 3,28-бис(диметилкарбамоил)-урс-12-ена (132) с использованием грибов Mucor plumbeus ATCC 4740. При инкубации Mucor plumbeus ATCC 4740 в присутствии соединений 131 и 132 метаболиты не обнаружены. Однако в процессе биотрансформации метилового эфира урсоловой кислоты (125) зарегистрировано образование метил-3,7,21-тригидрокси-урса 9(11),12-диен-28-oата (133) продукта 7,21-гидроксилирования и введения двойной связи в кольцо С. Образование двойной связи С(9)–С(11), вероятно, происходит путем дегидратации 11-гидроксипроизводного – промежуточного метаболита в процессе биоконверсии метилового эфира урсоловой кислоты Mucor plumbeus ATCC 4740.

Азиатикова кислота (11) выделенна из травянистого растения Centella asiatica (Центелла азиатская) (Coldren et al., 2003) и обладает выраженным противовоспалительным (Guo et al., 2004), нейропротекторным (Krishnamurthy et al., 2009) и противоопухолевым (Babu et al., 1995) действием. Известны отдельные примеры по биотрансформации азиатиковой кислоты (11) с использованием культур грибов. При этом начальным этапом биотрансформации кислоты 11, как правило, является реакция гидроксилирования. Культура грибов Alternaria longipes AS 3.2875 катализирует 22- и/или 30-гидроксилирование кислоты 11 с образованием кислот 134136 (He et al., 2010). Способность к гидроксилированию азиатиковой кислоты (11) обнаружена также у грибов Penicillium lilacinum (Purpureocillium lilacinum) ACCC 31890, Fusarium equiseti CGMCC 3.3658 и бактерий Streptomyces griseus CGMCC 4.18. Установлено, что Penicillium lilacinum ACCC 31890 и Fusarium equiseti CGMCC 3. катализируют селективное введение гидроксильной группы в положение С(15), при этом выход 2,3,15,23-тетрагидрогидрокси-урс-12-ен-28-овой кислоты (137) составляет 50,68 и 34,22% соответственно. Образование 21- и 30 гидроксилированных производных (134, 138), а также 2,3,23-тригидроксиурс 12-ен-28,30-диовой кислоты (139) наблюдается в процессе биотрансформации кислоты 11 культурой Streptomyces griseus CGMCC 4.18. В результате исследования цитотоксичности исходного соединения и полученных метаболитов в отношении трех клеточных линий рака установлено, что ED50 исходной кислоты 11 составляла 58,2-83,8 µМ, в то время как ED50 всех метаболитов превышало 110 µМ, что свидетельствует о значительном влиянии заместителей в положениях С(15), С(21) и С(30) на биологическую активность (Guo et al., 2013). Наряду с 15-гидроксилированием кислоты 11 (0,057 г/л) Fusarium avenaceum AS 3. катализирует реакции окисления 2- и 3-гидроксильных групп с образованием продуктов 130, 140, 141 (Huang et al., 2012b).

-Босвеллиевая кислота (12) и ее производные (11-кетобосвеллиевая и 3-О-ацетил-кетобосвеллиевая кислоты в частности) обнаружены в экстрактах смолы тропических деревьев рода Boswellia (босвеллия). Экстракты босвеллии, содержащие до 30% босвеллиевой кислоты, ингибируют синтез лейкотриенов и используются при лечении астмы (Ammon et al., 1993). Показано (Shao et al., 1998;

Jing et al., 1999;

Subba Rao et al., 2008), что босвеллиевые кислоты и ее полусинтетические производные обладают высокой противоопухолевой и противовоспалительной активностью. В 2012 г. появились первые сведения, касающиеся исследований биотрансформации 11-оксо--босвеллевой кислоты (142) до 15-гидроксипроизводного (143) с использованием цитохрома P CYP106A2 из бактерий Bacillus megaterium ATCC 13368. С целью повышения уровня биоконверсии тритерпеновой кислоты (142) был получен рекомбинантный штамм Bacillus megaterium MS941, применение которого позволило сократить продолжительность процесса биотрансформации с 24 ч до 100 мин и увеличить (до 80%) выход целевого продукта в 15 раз (Bleif et al., 2012).

Известны единичные примеры трансформации гликозидов урсановых тритерпеноидов с использованием бактериальных культур. Так, Nocardia sp.

NRRL 5646 катализирует гидролиз гликозидной связи 3-О-квиновозида квиновой кислоты (144) с образованием 40% агликона квиновой кислоты (145) и 20% его биогенетического аналога – цинхолиевой кислоты (147), образующейся в результате перегруппировки углеродного скелета путем миграции С(19) метильной группы в положение С(20) (Cheng et al., 2004) Следует отметить, что аналогичная реакционная активность Nocardia sp. NRRL 5646 отмечена и в процессе биотрансформации урсоловой кислоты (6) (Zhang et al., 2005). Показана способность 13273 к 30-гидроксилированию Streptomyces griseus ATCC квиновозида (144) с образованием соединения 146 (Cheng et al., 2006).

30 R O COOH COOH R R COOH 142: R = H OH 143: R = ОH O OH OH OH 144: R1 = R2 = CH 145: R1 = H, R2 = CH COOH OH O COOH OH OH OH 146: R1 = R2 = CH2OH Биотрансформация лупановых тритерпеноидов. Данные по микробиологической трансформации тритерпеноидов лупанового ряда в основном касаются бетулиновой кислоты (2) и ее производных. В последние годы наблюдается повышенный интерес к поиску микроорганизмов, способных катализировать конверсию более доступных лупановых спиртов лупеола (4) и бетулина (1), в частности.

S. Kouzi с соавт. (2000) использовали бактерии Bacillus megaterium ATCC 14581 и мицелиальные грибы Mucor mucedo UI-4605, Cunninghamella elegans ATCC 9244 в качестве модельных организмов для определения возможных метаболических путей бетулиновой кислоты (2) в организме млекопитающих, имеющих аналогичные ферментные системы, как то: цитохром Р монооксигеназы и Cu-содержащие оксидазы. Известно, что ферментные системы с цитохромом Р450 в качестве терминальной оксидазы осуществляют регио- и стереоселективное гидроксилирование различных субстратов.

R R R1 28COOH 28COOH 3 7 R R O R HO R R 148: R1 = R2 = R4 = H, R3 = OH 152: R1 = R2 = R4 = H, R3 = OH 149: R1 = R4 = H, R2 = R3 = OH 153: R1 = OH, R2 = R3 = R4 = H 150: R1 = R3 = OH, R2 = R4 = H 154: R1 = R3 = H, R2 = R4 = OH 151: R1 = R2 = H, R3 = R4 = OH 155: R1 = R2 = R3 = H, R4 = OH 156: R1 = R3 = R4 = H, R2 = OH COOH OH HOOC HOOC OH HO HO 157 30 R1 R R 28COOR 28COOR2 25 R 3 O R HO 159: R1 = OH, R2 = H 163: R1 = R4 = H, R2 = OH, R3 = CH3, R 160: R1 = H, R2 = CH3 = CH2OH 164: R1 = R2 = R4 = H, R3 = CH2ОН, R 161: R1 = OH, R2 = CH 162: R1 = H = CH 165: R1 = R2 = H, R3 = R4 = R5 = СH OH O 166: R1 = COOCH3, R2 = H, R3 = R4 = OH CH3, R5 = H OH OH R2 = Показано, что нерастущие клетки Bacillus megaterium АТСС 14581, индуцированные фенобарбиталом, катализируют реакцию окисления 3 гидроксильной группы кислоты 2 а также реакцию гидроксилирования в положениях С(7) или С(6)/С(7) с образованием минорных (0,44;

0,085 и 0,45%) количеств соединений 3, 148 и 149 в течение 6 сут. В процессе биотрансформации кислоты 2 с использованием растущей культуры грибов Mucor mucedo UI- также регистрируется 1,3% 7-гидроксипроизводное (148), в то время как грибы Cunninghamella elegans АТСС 9244 катализируют 1,7-дигидроксилирование с образованием 0,37% кислоты Продолжительность процесса 150.

биотрансформации с участием растущих культур грибов в комплексной питательной среде составляла15 сут. Исследования антимеланомной активности (в отношении двух клеточных линий меланомы человека) полученных метаболитов показали, что 1,7-, 7- и 6,7-гидроксипроизводные кислоты обладают меньшей активностью по сравнению с исходным соединением.

Р. Chatterjee с соавт. (2000) использован бактериальный штамм Bacillus megaterium АТСС 13368 в качестве модельного организма для изучения и прогнозирования потенциальных метаболических путей кислоты 2 (0,2 г/л).

Известно, что Bacillus megaterium АТСС 13368 синтезирует стероид-15 монооксигеназу цитохром Р450мег, которая может рассматриваться как микробная модельная система для изучения Р450-зависимых реакций гидроксилирования. Показано, что нерастущие клетки Bacillus megaterium АТСС 13368 в течение 6 сут катализируют образование кислоты 3 с выходом 4,2% и на ее основе производных, гидроксилированных в положения С(11) (152, 0,19%) и С(1) (153, 0,13%), а также продукта окисления исходной кислоты 2 в положения С(7),С(15) (154, 0,54%). При этом первым метаболитом, зарегистрированным в среде биотрансформации, является бетулоновая кислота (3). В дальнейшем происходит 11- или 1-гидроксилирование кислоты 3 с образованием кислот 152, 153. Авторы отмечают, что использование нерастущих клеток Bacillus megaterium АТСС 13368 в процессе биотрансформации бетулиновой кислоты (2) позволяет исключить образование дополнительных метаболитов, которые препятствуют экстракции и хроматографическому анализу целевых продуктов.

При исследовании цитотоксичности полученных производных в отношении клеток меланомы линий Mel-1 (лимфоузла) и Mel-2 (плевральной жидкости) установлено, что введение заместителей напрямую влияет на анимеланомную активность полученных продуктов. Так, гидроксилирование бетулиновой кислоты (2) в положения, близкие к 3-гидроксигруппе, С(7) и С(15) в частности, приводит к утрате биологической активности полученных производных. Окисление 3 гидроксильной группы наряду с ведением гидроксильных групп в положения С(1), С(11) способствует значительному повышению антимеланомной активности в отношении Mel-2, но при этом наблюдается существенное снижение цитотоксичности в отношении Mel-1.

Способность к селективному окислению 3-гидроксильной группы бетулиновой кислоты (2) обнаружена у грибов Chaetophoma DPB125 и Dematium DPB157, при этом выход бетулоновой кислоты (3) составлял 0,94% и 0,62% соответственно. В процессе биотрансформации кислоты 2 с использованием Colletotrichum DPB136 регистрируется до 2,34% 3-оксо-15-гидрокси-луп-20(29) ен-28-овой кислоты (155) – продукта последовательного окисления 3 гидроксильной группы и 15-гидроксилирования. Образование гидроксипроизводных наблюдается в процессе биоконверсии кислоты 3 с использованием представителей аскомицетов Arthrobotrys DPB134, катализирующий введение гидроксильных групп в С(7), С(7)/С(15) или С(7)/С(30) с образованием кислот 156 (1,6%), 154 (0,6%) и 163 (1,3%). Сходной реакционной активностью в отношении бетулоновой кислоты обладает культура грибов Colletotrichum DPB136, катализирующая образование 15-гидрокси- (155) и (154). Обнаружена способность грибов 7,15-дигидроксипроизводных Chaetophoma DPB125 вводить гидроксильную группу в положение С(25) бетулоновой кислоты (3) с образованием соединения 164 (4,22%) (Bastos et al., 2007).

Описан процесс биотрансформации бетулоновой кислоты (3) культурой грибов Chaetomium longirostre IFO 9873, при этом в качестве метаболитов зарегистрированы,15 -дигидроксипроизводное 7 (154, 4%) и продукты окислительного расщепления кольца А 4-гидрокси-3,4-секо-луп-20(29)-ен-3,28 диовая (157, 6%) и 4,7,17-тригидрокси-3,4-секо-28-норлуп-20(29)-ен-3-овая (158, 12%) кислоты, которые обладают выраженным цитотоксичным действием в отношении клеточной линии Raji (Akihisa et al., 2002).

По данным J. Zhang с соавт. (2005), применение культуры Nocardia sp.

NRRL 5646 в процессе биоконверсии бетулиновой (2) и 23-гидроксибетулиновой (159) кислот позволяет получить соответствующие метиловые эфиры (160, 161).

L-W. Qian с соавт. (2009) в процессе биотрансформации кислоты (3) Nocardia sp.

NRRL 5646 наряду с метиловым эфиром (165, 49,8%) идентифицирован новый продукт метил -2-ацетокси-3-оксо-луп-20(29)-ен-28-oат (166, 6,42%), который образуется в результате двух последовательных реакций введения – ассиметричной 2-гидроксильной группы и ее последующего ацетилирования.

Описан единственный пример гликолизирования кислоты 2 до 28-О--D глюкопиранозил 3 -гидрокси-луп-20(29)-ен-28-оата (162, 0,77%) с использованием нерастущих клеток грибов Cunninghamella sp. NRRL 5695.

Исследование цитотоксичности полученного сапонина (162) в отношении различных клеточных линий меланомы показало его низкую активность, что может быть связано с замещением фармакофорной группы в положении С(28), которая определяет антимеланомную активность бетулиновой кислоты (Chatterjee et al., 1999).

HO HO 167 OH HO HO 169 Лупеол (4) тритерпеновый спирт лупанового ряда, обнаружен во многих растениях, в том числе в растениях рода Lupinus (Люпин) и плодовых культур Olea (Олива), Mangifera (Манго), Fcus (Инжир) и Fragаria (Клубника). Показано, что лупеол проявляет седативное, противовоспалительное и противоопухолевое действие in vitro и in vivo (Saleem, 2009). Т. Carvalho с соавт. (2010) изучена возможность использования культур грибов Aspergillus ochraceus, Chaetomium thermophilum, Humicola grisea var. thermoidea, Mucor rouxii (Amylomyces rouxii), Phanerochaete chrysosporium, Scytalidium termophilum и Glomerella cingulata для биоконверсии лупеола (4). Среди исследованных культур наибольшую активность проявили Aspergillus ochraceus и Mucor rouxi (Amylomyces rouxii).

Установлено, что Aspergillus ochraceus катализирует реакцию дегидрирования лупеола (4, 0,3 г/л) с образованием спиртов 167, 168. При инкубировании Mucor rouxii (Amylomyces rouxii) в присутствии лупеола предположительно образуется его 12-гидроксипроизводное (169) (Carvalho et al., 2010). Описан процесс биотрансформации лупеола (4) культурой Penicillium roqueforti. Данные, полученные с использованием ГХ-МС анализа, свидетельствуют о том, что Penicillium roqueforti окисляет боковую изопропильную цепь и последующее декарбоксилирование лупеола с образованием соединения 170 (Severiano et al., 2008).

CH2OH CH2OH HOOC O HO 171 Показана способность представителей базидиомицетов Armillaria luteo virens (Armillaria luteovirens) Sacc QH и аскомицетов Aspergillus foetidus ZU-G1, Aspergillus oryzae AS 3.498, Aspergillus sp. WZ, Mucor sp. ZJUQH, Trichoderma koningii ZJ4, Aspergillus niger, Penicillium cyclopium AS 3.4041 к окислению первичной гидроксильной группы бетулина (1) в концентрации 0,05 г/л с образованием до 10% бетулиновой кислоты (2). С целью увеличения количественного выхода целевого продукта процесс биотрансформации с использованием грибов Aspergillus foetidus ZU-G1, Aspergillus oryzae AS 3.498 и Armillaria luteo-virens (Armillaria luteovirens) Sacc QH проводили в ростовых условиях или в микроэмульсиях. Повышение уровня конверсии бетулина (1) регистрировалось при использовании эмульсии бетулина в смеси этанол:Твин80:этилацетат:ДМСО. Максимальный (28%) выход бетулиновой кислоты (2) достигался через 6 сут при использовании растущей культуры Armillaria luteo-virens (Armillaria luteovirens) Sacc QH, при этом бетулин вносили через 3 сут после начала культивирования (Chen et al., 2009). С целью оптимизации процесса биотрансформации бетулина (1) Armillaria luteo-virens использовали методы математического (Armillaria luteovirens) Sacc QH моделирования. В оптимальных условиях (pH 6,0, 0,57% Твин 80, 0,015 г/л бетулина) количественный выход бетулиновой кислоты (2) увеличился на 74,53% и составил 9,32%. Авторы отмечают, что образование кислоты (2) может быть связано с активностью бетулин-28-монооксигеназы, принадлежащей к классу Р450 цитохромов (Liu et al., 2010). С целью повышения биодоступности гидрофобного субстрата для микробных клеток, а также решения проблемы ингибирования каталитической активности субстратом и/или продуктами его биотрансформации используются ионные жидкости. Так, их применение в процессе биотрансформации бетулина (1, 0,075 г/л) нерастущими клетками Armillaria luteo-virens (Armillaria luteovirens) Sacc в концентрации 300 г/л по сухому весу в двухфазных системах позволило незначительно увеличить выход кислоты 2. При этом максимальный (11,14%) выход достигался в течение 18 ч при использовании двуфазной системы, включающей 1-этил-3-метилимидазолиум тетрафторборат ([EMIM][BF4]) и гексан в соотношении 50%, v/v. В качестве индуктора синтеза бетулин-28-монооксигеназы в среду ферментации вносили бутанол (0,1 моль/л), гексан использовали как сорастворитель (Fu et al., 2011).

Показана способность грибов 3.910 к Cunninghamella blakesleeana AS биотрансформации 0,05 г/л бетулина (1) с образованием бетулиновой кислоты (2) и еще четырех неидентифицированных метаболитов. При этом наибольший уровень образования кислоты 2 достигался при использовании растущих клеток грибов, что связано с более выраженной бетулин-28-монооксигеназной активностью растущих клеток Cunninghamella blakesleeana AS 3.910. В результате масштабирования процесса биотрансформации бетулина (1) с использованием Cunninghamella blakesleeana AS 3.910 в ферментере объемом 5 л выход кислоты составлял около 4% через 120 часов (Feng et al., 2013). Образование бетулиновой кислоты (2) в качестве основного метаболита наблюдалось в процессе биотрансформации бетулина (1) культурами мицелиальных грибов Microsporum canis (Arthroderma otae), Trichophyton tonsurans, Aspergillus niger и Penicillium spp.

При этом наибольший уровень конверсии бетулина (1) достигался при использовании культур Microsporum canis и Trichophyton tonsurans (Qazi et al., 2013). Описан пример бактериальной трансформации бетулина до (1) бетулиновой кислоты (2) с использованием Pseudomonas sp. H-43, Mycobacterium sp. 1-4-1 и неидентифифцированных штаммов Т-12, УЗ-26. При этом уровень конверсии бетулина Mycobacterium sp. 1-4-1 составлял 45–50% (Митрофанов и др., 2006).

В 20122013 гг. появились первые сведения о региоселективном окислении вторичной гидроксильной группы бетулина с образованием бетулона (171) при использовании растущих клеток грибов и дрожжей. При этом Dothideomycete sp.

HQ 316564 катализирует образование продукта 171 с выходом 43,4% в течение 144 ч в условиях внесения бетулина (1) в концентрации 0,1 г/л (Liu et al., 2013). В процессе биотрансформации бетулина (1, 0,057 г/л) представителями дрожжей условно патогенного вида Rhodotorula mucilaginosa F10 наряду с бетулоном (171) регистрировалось образование дополнительного метаболита – метилового эфира 11,14-октадекадиеновой кислоты (Mao et al., 2012).

Описан единственный пример окислительного расщепления кольца А бетулина (1) с образованием секопроизводных с использованием микроорганизмов. Показано, что нерастущие клетки грибов Chaetomium longirostre IFO 9873 катализируют образование 4,28-дигидрокси-3,4-секо-луп кислоты (172, 3%), обладающей противоопухолевой 20(29)-ен-3-овой активностью, в условиях внесения бетулина (1) в концентрации 0,067 г/л (Akihisa et al., 2002).

Как видно из представленных данных литературы, в качестве биокатализаторов в процессах трансформации пентациклическх тритерпеноидов преимущественно используются культуры грибов. Однако описанные процессы биотрансформации имеют значительные недостатки (использование сложных питательных сред, высокая продолжительность, невысокий уровень конверсии, потенциально опасный посевной материал и др.). В связи с этим актуальным является поиск непатогенных микроорганизмов, способных эффективно катализировать окислительные трансформации пентациклических тритерпеноидов (бетулина, в частности).

1.2. Использование актинобактерий рода Rhodococcus для направленной биоконверсии терпеноидных соединений Одной из активно используемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Rhodococcus. Не мицелиальный характер роста, политрофность и лабильность метаболических систем, синтез биосурфактантов, способность расти на минимальных средах, высокая каталитическая активность и отсутствие выраженных патогенных свойств (Ившина и др., 1987;

Ivshina et al., 1998;

Larkin et al., 2006;

Martnkov et al., 2009;

Kuyukina, Ivshina, 2010) обусловливают эффективность использования родококков для биотрансформации органических соединений различной структуры. Известно, что родококки характеризуются широким спектром каталитических возможностей и способны утилизировать короткоцепочечные, длинноцепочечные, галогензамещенные, ароматические и др. углеводороды, озокериты, ароматические соединения, смолы, компоненты гумуса, лигнин и его производные, а также различные ксенобиотики. Толерантность родококков к голоданию, отсутствие катаболической репрессии и резистентность к неблагоприятным факторам окружающей среды обусловливают перспективность их использования в процессах биоремедиации. Перспективные области применения родококков – процессы десульфуризации дизельных и топливных фракций нефти, биовыщелачивания, использование поверхностно-активных веществ для повышения нефтеотдачи пластов и в качестве промышленных диспергирующих агентов. Родококки широко используются в качестве катализаторов в процессах биотрансформации нитрилов, терпеноидов, стероидов, стеролов и их структурных аналогов (Warhurst, Fewson, 1994;

Bunch, 1998;

de Carvalho, da Fonseca, 2006;

Донова, 2010).

Среди активно разрабатываемых биотехнологических направлений особое место занимают исследования в области биотрансформации терпеноидов.

Повышенный интерес к данной группе природных органических соединений обусловлен высокой биологической активностью их полусинтетических производных (de Carvalho, da Fonseca, 2006). В настоящее время накоплен сравнительно большой объем экспериментальных данных по трансформации терпеноидов различной структуры с использованием актинобактерий рода Rhodococcus.

На примере мирцена, составляющего до 70% эфирных масел Humulus lupulus (Хмель вьющийся), и его окисленных производных показана способность родококков к окислительной трансформации ациклических монотерпеноидов.

M. Thompson с соавт. (2010) выделили штамм R. erythropolis MLT1, использующий -мирцен (173) в качестве единственного источника углерода и энергии. Показано, что данный штамм обладает уникальной реакционной активностью в отношении мирцена. При этом в процессе его биотрансформации в качестве основного продукта обнаружен монотерпеновый спирт – гераниол (Grogan et al., 2012). В процессе биотрансформации гераниола (174) с помощью Rhodococcus sp. GR3 получено его окисленное производное – гераниевая кислота с выходом свыше 50% (Chatterjee, 2004).

CH2OH 173 Среди моноциклических монотерпеноидов в качестве субстрата бактериальной трансформации активно используется лимонен (175), окисленные производные которого представляют интерес для парфюмерной промышленности и в качестве перспективных терапевтических агентов. Показана способность нерастущих клеток R. opacus PWD4 и PW4, предварительно выращенных в присутствии этанола и/или толуола, к селективному гидроксилированию лимонена (175) с образованием (более 90%) карвеола (Duetz et al., 2001;

de Carvalho, da Fonseca, 2003).

Описаны пути метаболизма лимонена (175) и его производных дигидрокарвеола (178), карвеола (179) штаммом R. erythropolis DCL14, а также ферменты, катализирующие основные этапы их биодеструкции (van der Werf et al., 1998;

van der Werf et al., 1999a;

van der Werf et al., 1999b;

van der Werf, Boot, 2000;

van der Werf, 2000;

Arand et al., 2003). K. Choi с соавт. (2004) в результате генетического анализа участка генома размером 8,842 п.н. определили гены, отвечающие за лимонен-деструктирующую активность штамма Rhodococcus sp.

T104.

OH O OH 175 176 HO HO O O 178 179 180 Показана способность R. erythropolis DCL14 к селективной конверсии лимонен-1,2-эпоксида (176) до лимонен-1,2-диола (177). В условиях использования двухфазной системы (циклогексан/буфер в соотношении 1:5) и реактора с механическим перемешиванием, уровень биоковерсии эпоксида (178) составил 97,5% (de Carvalho et al., 2000). При этом установлено, что в процессе гидролиза смесей (1R,2S,4S)-/(1S,2R,4S)- или (1R,2S,4R)-/(1S,2R,4R) стереоизомерных эпоксидов селективно образуются (1R,2R,4S)- или (1R,2R,4R) лимонен-1,2-диолы соответственно (Hopmann et al., 2005).

Цикл работ C. de Carvalho с соавт. (2002а, b;

2005) был направлен на детальное исследование и оптимизацию процесса биотрансформации карвеола (179) до карвона (180) с использованием R. erythropolis DCL14. В результате применения двухфазной системы (н-додекан/минеральная среда), предварительной адаптации бактериальных клеток к повышенным концентрациям субстрата и продукта, сравнительного исследования эффективности процесса в различных типах реактора подобраны оптимальные условия процесса, при которых уровень конверсии карвеола составил 96%. Использование двухфазной системы (1-додекан/вода) и силиконового масла в качестве диспергирующего агента в процессе биотрансформации карвеола (179) позволило получить целевой продукт с выходом более 50% (Morrish et al., 2008). Подобная реакционная активность обнаружена также у штамма R. globerulus PWD8, катализирующего окислительную конверсию карвеола (179) до карвона (180) (Duetz et al., 2001).

Цинеол – моноциклический монотерпеноид, который широко применяется при получении различных фармацевтических препаратов. Известны немногочисленные примеры биотрансформации цинеола с использованием родококков. Описан (Williams et al., 1989) процесс окислительного расщепления 1,8-цинеола (181) с использованием штамма Rhodococcus sp. С1. Среди продуктов метаболизма 1,8-цинеола (181) культурой Rhodococcus sp. определены 2-эндо гидрокси-, и 2-оксо-производные, при этом уровень 2-экзо-гидрокси биоконверсии терпенового субстрата (181) составил 98% (Rodrguez et al., 2006).

На примере камфоры (182) и 2-метилизоборнеола (183) показана способность родококков к биотрансформации бициклических монотерпеноидов.

OH O 182 Так, при инкубировании R. ruber T1 в присутствии камфоры (182) и 2 метилизоборнеола (183) обнаружены их 6-гидрокси- и 3-гидроксипроизводные (90%) соответственно. Среди продуктов биотрансформации 2-метилизоборнеола (183) R. wratislaviensis DLC-cam зарегистрированы 5-гидроксипроизводное (31%) и его более окисленный метаболит -кето-2-метилизоборнеол (69%) (Eaton, Sandusky, 2009). G. Roberts с соавт. (2004) определили нуклеотидную последовательность участка кластера генов и ферменты, предположительно отвечающих за камфора-деградирующую активность Rhodococcus sp. NCIMB 9784. Показана способность Rhodococcus sp. NCIMB 9784 к селективному гидроксилированию камфоры (182) с образованием 6-эндо-гидроксипроизводного (Grogan et al., 2002).

В настоящее время ведется поиск микроорганизмов, способных к деструкции геосмина (184) сесквитерпеноида, обусловливающего землистый запах воды. Показано (Eaton, Sandusky, 2010), что R. wratislaviensis DLC-cam обладает высокой трансформирующей активностью в отношении геосмина (186) и катализирует образование его 2,7-кетопроизводных.

OH Работы по биотрансформации смоляных кислот, представителей трициклических дитерпеноидов, в основном касаются исследований деструктирующей активности микроорганизмов. Следует отметить, что продукты окислительной трансформации данной группы терпеноидов могут быть использованы в качестве интермедиатов в химическом синтезе биологически активных соединений (15-гидроксипроизводные, в частности). Показана способность штаммов и к гидроксилированию R. ruber R. erythropolis дегидроабиетиновой кислоты (185), при этом гидроксильная группа вводится в положение С(7) или С(15) кислоты 185 (Гришко и др., 2000). Описан единственный пример биотрансформации изопимаровой кислоты (186) с использованием представителей R. ruber. Среди метаболитов кислоты зарегистрированы изопимара-8(14),15-диен-7-он-18-оат и изопимара-8(9),15-диен 7-он-18-оат (Vorob’ev et al., 2001).

COOH COOH 185 По данным R. Hanson с соавт. (2006), выделенные из почвы штаммы Rhodococcus sp. АТСС 202191 и АТСС 202192 катализировали гидролиз С(4) сложноэфирной связи 10-деацетилбаккатина (187) с образованием 90% 4 деацетил-10-деацетилбаккатина III, перспективного интермедиата в синтезе соединений с выраженной противоопухолевой активностью.

OH O OH HO H HO O O CH3COO O Описан (Maatooq, 2003) процесс биотрансформации представителя тетрациклических тритерпеноидов аргентатина ( 188), производные которого обладают антифунгицидными свойствами, с использованием ‘Nocardia corallina var. taoka’ (R. ruber) ATCC 31338. В качестве метаболитов определены изоаргентатин и 3,25 -диол продукты восстановления 3-оксогруппы исходного соединения 188 и последующего разрыва СО связи.

OH O O На примере эхиноцистовой кислоты (9) описан единственный случай биотрансформации пентациклических тритерпеноидов с использованием родококков. Эхиноцистовая кислота (9), как и гликозиды на ее основе, обладают выраженным цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток линий:

J774.A1, HEK-293, WEHI-164 (Cioffi et al., 2006), HepG2, HL-60 (Tong et al., 2004a;

Tong et al., 2004b), A375, Hela и L929 (Feng et al., 2001), а также проявляют анти-ВИЧ (Konoshma et al., 1995), фунгицидную (Khan et al., 1997), иммуностимулирующую (Plohmann et al., 1997;



Pages:   || 2 | 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.