авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 || 3 |

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ...»

-- [ Страница 2 ] --

Khajuria et al., 2007) и другие виды активности. Показано, что культура ‘Nocardia carollina’ (R. ruber) катализирует реакции гликолизирования и селективного CGMCC4. окисления 3-гидроксильной группы кислоты (5) (Feng et al., 2010).

Таким образом, в последние годы наблюдается повышенный интерес к биоконверсии терпеноидных соединений с использованием родококков – актинобактерий, обладающих полифункциональной метаболической активностью в отношении широкого спектра органических соединений. Такая пластичность их генома, в том числе и способность родококков трансформировать терпеноиды различной структуры (от ациклических монотерпеноидов до трициклических тритерпеноидов) расширяют сферу их практического применения и обусловливает явные технологические преимущества использования родококков в качестве биокатализаторов процессов трансформации природных соединений.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что в настоящее время наблюдается значительное увеличение количества научных публикаций, касающихся использования микроорганизмов различных таксономических групп в качестве биокатализаторов структурных трансформаций тритерпеноидов (рис.

2). Наиболее исследованы процессы биотрансформации тритерпеновых кислот (глицирретовой, олеаноловой, урсоловой и бетулиновой, в частности). При этом, как правило, начальная стадия превращения тритерпеноидов связана с реакцией 7- и/или 15 -гидроксилирования.

Наряду со способностью вводить гидроксильные группы многие микроорганизмы катализируют реакции окисления нативных и вводимых гидроксильных групп до карбонильных. Предполагается, что окисление С(3) гидроксильной группы – начальный этап расщепления кольца А тритерпеноидов с образованием секопроизводных, которые зарегистрированы в среде ферментации некоторых микроорганизмов в качестве минорных метаболитов. Отдельные представители микроорганизмов катализируют реакции циклизации, введения двойных связей, гликозилирования и этерификации тритерпеновых кислот. Сведения по биотрансформации тритерпеновых спиртов немногочисленны и ограничены лишь единичными примерами биоконверсии лупеола и бетулина.

Необходимо отметить, что в качестве биокатализаторов трансформации тритерпеноидов чаще всего используются представители мицелиальных грибов родов Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cunninghamella, Colletotrichum, Fusarium, Mucor, Penicillium и бактерий Streptomyces (Parra et al, 2009;





Muffler et al., 2011). Однако описанные процессы биотрансформации осуществляется, как правило, в условиях использования сложных питательных сред, характеризуются внесением низких концентраций исходных соединений и высокой продолжительностью процесса. Уровень конверсии тритерпеновых субстратов, обычно, не превышает 10–15%, при этом часто регистрируется образование трудноразделимой смеси продуктов. В связи с этим актуален поиск бактериальных культур, обладающих высокой тритерпеноидтрансформирующей активностью и катализирующих селективные превращения исходных субстратов.

Количество публикаций 1965- 1970- 1975- 1980- 1985- 1990- 1995- 2000- 2005- 2010 1980 1985 1990 1995 2000 2005 2010 1970 Рис. 2. Количество публикаций в области биотрансформации пентациклических тритерпеноидов.

Одной из активно разрабатываемых групп микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода Показана эффективность применения данной группы Rhodococcus.

микроорганизмов в процессах биотрансформации моноциклических монотерпеноидов, описаны пути метаболизма и ферментные системы, катализирующие основные реакции их структурной модификации. При этом катализируемые родококками реакции характеризуются высоким (более 90%) выходом и высокой степенью регио- и стереоселективности. Несмотря на значительные успехи в области биоконверсии монотерпеноидов, в настоящее время практически отсутствуют научные публикации, касающиеся биотрансформации пентацикличексих тритерпеноидов с использованием родококков. Тем не менее, уникальность метаболических систем и высокий биотехнологический потенциал родококков обусловливают перспективность использования данной группы актинобактерий в качестве биокатализаторов процесса окислительной трансформации пентациклических тритерпеноидов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Рабочая коллекция бактериальных культур В работе использовали 104 штамма (табл. 1) родококков, принадлежащих к видам R. erythropolis (33), ‘R. longus’ (10), R. opacus (14), R. rhodochrous (17), R. ruber (30) и поддерживаемых в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер 768 во Всемирной федерации коллекций культур, www.iegm.ru/iegmcol).

Таблица Количество Вид Номер штамма в коллекции ИЭГМ штаммов 7, 14, 16, 17, 21, 23, 24, 25, 26, 180, 181, 182, 185, 186, 190, 191, 192, 194, 199, 200, R. erythropolis 203, 251, 253, 256, 258, 266, 490, 498, 499, 662, 678, 682, ‘R. longus’ 10 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 68, 69, 39, 56, 57, 58, 223, 246, 248, 249, 261, 262, R. opacus 264, 489, 716, 62, 63, 64, 65, 66, 73, 608, 609, 629, 632, R. rhodochrous 633, 639, 646, 647, 653, 655, 78, 79, 81, 82, 85, 86, 87, 89, 91, 93, 219, 220, 226, 228, 239, 262, 337, 338, 340, 371, R. ruber 374, 436, 579, 580, 584, 597, 601, 605, 628, 2.2. Условия культивирования Бактерии выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, в которые вносили 100 мл питательной среды. Культивирование проводили на орбитальной качалке Certomat IS (Sartorius, Германия) при 160 об/мин и 28°С. В опытах по биотрансформации бетулина использовали минеральную среду следующего состава (г/л): K2HPO4 – 1,0;





KH2PO4 – 1,0;

KNO3 – 1,0;

NaCl – 1,0;

MgSO4·7H2O – 0,2;

CaCl2·2H2O – 0,02;

FeCl3 – 0,001 (Каталог штаммов…, 1994). В среду добавляли 0,1% дрожжевого экстракта (Микроген, Россия) и раствор микроэлементов по Постгейту (Романенко, Кузнецов, 1974). До инокуляции значение рН реакционной среды составляло 6,8–7,0. В качестве субстратов роста использовали глюкозу (1,0%), глицерин (1,0%) или н-гексадекан (0,1;

1,0;

3, об.%). В отдельных экспериментах для культивирования родококков использовали мясопептонный бульон (МПБ) производства ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия следующего состава (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки 8,0;

пептон ферментативный 8,0;

NaCl – 4,0;

рН 7,07,4. Ба ктерии, выращенные на мясопептонном агаре (МПА) в течение 48 ч, вносили в среду культивирования до конечной концентрации 6,5х106 клеток/мл. Бетулин (0,5 г/л) в культуральную среду добавляли в виде раствора в диметилсульфоксиде (1:10 мг/мл) через 48 ч с начала культивирования родококков. В данных условиях динамику образования бетулона отслеживали с интервалом 24 ч в течение 240 ч.

Цитоморфологические исследования проводили с помощью системы визуализации микроскопического изображения, включающей световой микроскоп Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия), персональный компьютер, цветную цифровую систему ввода изображения PRO-150ES (Pixera, США).

2.3. Контрольные эксперименты Для определения возможного влияния питательной среды на процесс окисления бетулина, во всех экспериментах использовали бесклеточный (абиотический) контроль. В качестве абиотического контроля в опытах с нерастущими клетками использовали стерильные буферные растворы с добавлением бетулина в аналогичных концентрациях.

2.4. Иммобилизация бактериальных клеток в полимерном криогеле В качестве носителя использовали макропористый гетерофазный криогель на основе поливинилового спирта (ПВС) производства ПО “Азот”, Невинномысск, Россия. Иммобилизацию клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66, предварительно выращенных в минеральной среде с добавлением 3,0 об.% н-гексадекана, осуществляли путём внесения клеточной суспензии в раствор ПВС по методике, описанной в работе (Kuyukina et al., 2006). Клеточную суспензию и раствор ПВС смешивали в соотношении 1:2 v/v. Последующие этапы гранулирования, замораживания и оттаивания осуществляли согласно указанной выше методике. Перед использованием полученный биокатализатор регидратировали в 0,5%-ном растворе NaCl в течение 24 ч и добавляли в минеральную среду из расчета 200 гранул (5,0±0,6х106 клеток/мл) на 100 мл среды.

2.5. Подготовка суспензий нерастущих клеток Под термином “нерастущие клетки” (resting cells) понимаем трижды отмытые от питательной среды жизнеспособные клетки стационарной фазы роста, прекратившие свое деление в силу исчерпания источников питания или в силу каких-либо иных причин (Эль-Регистан, 2005) и перенесенные из питательной среды в буферный раствор.

Клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 предварительно выращивали в МПБ и минеральной среде в присутствии глюкозы (1,0%), глицерина (1,0%) или н-гексадекана (1,0 об.%) в течение 4872 ч. Родококки в стационарной фазе роста осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин и трижды промывали эквивалентным объемом фосфатного буфера (рН 7,0) с последующим центрифугированием. Для получения фосфатного буферного раствора со значением рН 6,0;

7,0;

8,0 или 9,0 к 500 мл 0,1 М KH2PO4 (13,6 г/л) добавляли 56, 291, 461 или 481 мл 0,1 М NaOH (4 г/л) соответственно и доводили дистиллированной водой до 1000 мл (Справочник биохимика, Досон et al., 1991).

Отмытые клетки ресуспендировали в 100 мл фосфатного буфера (рН 6,0;

7,0;

8, или 9,0) и доводили оптическую плотность клеточных суспензий до значений OП600 1,4;

1,6;

1,8;

2,0;

2,2;

2,4;

2,6 или 2,8 с последующим пересчетом на сухой вес клеточной биомассы (рис. 3). Бетулин вносили в подготовленную клеточную суспензию в концентрации 0,5;

1,0;

2,0 или 3,0 г/л. Продолжительность экспериментов по биотрансформации бетулина нерастущими клетками составляла 96 ч, при оценке динамики накопления бетулона пробы отбирали каждые 24 ч. В сравнительных исследованиях бетулинтрансформирующей активности нерастущих клеток использовали подготовленные аналогичным образом клеточные суспензии родококков разных видов.

Рис. 3. Схема получения нерастущих клеток.

2.6. Получение клеточных фракций из родококков Суспензию клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 в 100 мл фосфатном буфере (pH 7,0;

OП600 2,0) обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора Soniprep 150 (MSE, Великобритания) при амплитуде 10 мкм в течение 60 мин. Полученный гомогенат центрифугировали при охлаждении 6000 об/мин в течение 10 мин. Для выделения мембраносвязанных ферментов осадок ресуспендировали в 100 мл 1% раствора Тритона X-100 в фосфатном буфере (рН 7,0), перемешивали на орбитальном шейкере в течение 30 мин и затем центрифугировали при об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок, содержащий неэкстрагируемые ферменты, ресуспендировали в 100 мл фосфатном буфере (рН 7,0).

Подготовленные клеточные фракции: (1) супернатант с внутриклеточными ферментами;

(2) супернатант с мембранносвязанными ферментами, (3) ресуспендированные соникаты с ферментами, не экстрагируемыми детергентами, использовали в сравнительных исследованиях по биотрансформации 0,5 г/л бетулина, -ситостерола или холестерола. В качестве контроля служила суспензия клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 (OП600 2,0) в 100 мл фосфатном буферном растворе (pH 7,0).

2.7. Определение дыхательной активности Определение дыхательной активности родококков проводили с помощью 6 канального респирометра Micro-OxymaxR (Columbus Instruments, США) в стеклянных флаконах Micro-Oxymax вместимостью 300 мл, содержащих 100 мл бактериальной суспензии (OП600 2,6) в фосфатном буфере и бетулин в концентрации 0,5;

1,0;

2,0 или 3,0 г/л. Постоянное перемешивание (300 об/мин) осуществляли с помощью многоместной магнитной мешалки RT 10 (Power IKAMAG, Германия) в течение 96 ч при температуре 28±2°С. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин-1) и количество потребляемого кислорода (мкл). В качестве контроля использовали бактериальную суспензию в фосфатном буфере (OП 2,6) без добавления бетулина.

2.8. Определение жизнеспособности нерастущих клеток Количество жизнеспособных клеток в процессе биотрансформации бетулина определяли методом точечных высевов. Для этого на поверхность МПА автоматической пипеткой наносили 10 отдельных микрокапель исследуемой пробы объемом 5 мкл в 10-кратных разведениях. После инкубации при 28°С в течение 2 сут проводили подсчет выросших колоний.

2.9. Качественный и количественный анализ продуктов биотрансформации бетулина Для выделения продуктов биотрансформации бетулина постферментационную среду подкисляли 10%-ным водным раствором HCl до рН и трижды экстрагировали эквивалентным объемом этилацетата.

3,04, Объединенные экстракты последовательно промывали 1%-ным водным раствором Na2CO3 и дистиллированной водой (до рН 7,0). Полученный этилацетатный экстракт обезвоживали над Na2SO4. Растворитель удаляли с помощью роторного испарителя Heidolph (Германия). Качественный состав метаболитов предварительно контролировали методом ТСХ на высокоэффективных пластинах с силикагелем ПТСХ-П-В (Sorbfil, Россия).

Наличие продуктов окисления бетулина фиксировали при обработке пластин в системе растворителей этилацетат:гексан (1:4) и опрыскивании пластинок 5% H2SO4 с последующим прогреванием в течение 2–3 мин при 95–100С.

Количественный анализ продуктов биотрансформации бетулина осуществляли методом газовой ГХ-МС с использованием хроматографа Agilent 6890N/5975B (Agilent Technologies, США), оборудованного капиллярной колонкой HP-5ms (30 м х 0,25 мм, 0,25 мкм) и работавшего в режиме ионизации электронным ударом (70 эВ). В качестве газа-носителя использовали гелий (1 мл/мин). Вводили 0,2 мкл этилацетатного экстракта с делением потока (от 1:1 до 11:1). Температура колонки программировалась от 100 до 300°С с повышением температуры со скоростью 50°С/мин. Масс-спектры регистрировали в диапазоне m/z от 40 до а.е.м. В экстрактах, содержащих остаточный н-гексадекан, время начала детектирования продуктов биотрансформации выбирали через 5 мин после выхода н-гексадекана. Полученные масс-спектры сравнивали с масс-спектрами библиотеки NIST08 MS Library. Масс-спектры считали идентифицированными при совпадении масс-спектров исследуемого вещества с библиотечным коэффициентом подобия, превышающим 90%.

2.10. Препаративное получение бетулона Эксперименты по препаративному получению бетулона проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл клеточной суспензии (OП 2,6) R. rhodochrous ИЭГМ 66 в фосфатном буфере (рН 8,0) и 0,3 г бетулина, растворенного в 3 мл ДМСО, при постоянном перемешивании (160 об/мин) и температуре 28°С. Через 24 ч продукты биотрансформации трижды экстрагировали эквивалентным объемом этилацетата. Полученные продукты биотрансформации (0,28 г) разделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле 60-200 m (Merck, Германия), соотношение вещества и сорбента 1 : 50, элюент – гексан:этилацетат (9:1). 1Н ЯМР спектр раствора бетулона в CDCl3 записывали на спектрометре Varian Mercury Plus 300 (Varian Inc., США);

300 МГц, внутренний стандарт – гексаметилдисилоксан. Пороговое значение температуры в точке плавления определяли на приборе OptiMelt MPA (Stanford Research Systems Inc., США).

Бетулон (171, луп-20(29)-ен-28-ол-3-он) белый порошок. Тпл 120,5°C (н гексан–этилацетат, 5:1) (лит.: Тпл 94-96°C (н-гексан) (Hata et al., 2002), 175-176°C (Tinto et al., 1992). 1H ЯМР (CDCl3,, м.д.) : 0,92, 0,98, 1,01, 1,05, 1,06 (15Н, 5с, 5СН3);

1,67 (3Н, с, СН3-30);

2,37-2,48 (3H, м, H-19+H2-2);

3,33 и 3,79 (2H, 2д, J = 10,8 Гц, Н2-28);

4,57 и 4,68 (2Н, 2 уш.с, Н2-29). MS, m/z (отн. интенсивность): 440, (9,51, M+).

2.11. Химическая модификация бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина NH2OH HCl, C6H5COCl, C5H6N C2H5OH, C5H6N OH OH OCOC6H 171 O HON HON SOCl2, KOH, CH2Cl2 EtOH OH OCOC6H NC NC Рис 4. Схема синтеза 3,4-секобетулина.

Смесь продуктов 28-Гидрокси-3-гидроксиминолуп-20(29)-ен (189).

биотрансформации бетулина (по данным ХМС, содержание соединения составляло 4 ммоль) и 4,8 ммоль гидрохлорида гидроксиламина растворяли в мл смеси этанол-пиридин (5:1). Реакционную смесь кипятили в течение 2 ч.

Ход реакции контролировали с использованием ТСХ. По окончании реакции растворитель упаривали, остаток разбавляли водой и экстрагировали 50 мл хлороформа, органический слой отделяли, сушили над безводным MgSO4.

Растворитель упаривали, остаток очищали с помощью колоночной хроматографии, элюент – гексан-этилацетат, 5:1. Выход соединения 189 – 61%. Т.

пл. 240,9С. Rf 0,4 (гексан:этилацетат 7:3). [] 22 +6,1 (c 0,5, CHCl3). ИК спектр:

D 1640 (С=N), 3252, 3517 (ОН). Спектр 1Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3,, м.д., J/Гц): 0,92, 0,95, 1,03, 1,04, 1,13 (15Н, 5с, 5СН3);

1,67 (3Н, с, СН3-30);

2,92-3,00 (1Н, м, СН-19);

3,33 и 3,79 (2Н, 2д, J = 11,0, СН2-28);

4,57 и 4,67 (2Н, 2с, СН2-29). Спектр 1Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d6,, м.д., J/Гц): 9,98 (1H, с, NОH).

28-Бензоилокси-3-гидроксиминолуп-20(29)-ен (190). К раствору 2 ммоль соединения 189 в 15 мл пиридина добавляли 4 ммоль бензоилхлорида, реакционную смесь выдерживали в течение 24 ч при комнатной температуре.

Контроль за ходом реакции осуществляли с помощью ТСХ. Реакционную смесь промывали 20%-ным раствором соляной кислоты (3x20 мл) и экстрагировали этилацетатом (3x20 мл). Органический слой последовательно промывали раствором NaHCO3, водой, отделяли и сушили над безводным MgSO4, растворитель упаривали в вакууме водоструйного насоса. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюент гексан:этилацетат 7:1.

Выход соединения 190 – 65%. Т. пл. 225,9 С. Rf 0,40 (гексан:этилацетат 5:1).

[] 22 -2,1 (c 0,5, CHCl3). ИК спектр: 1645 (С=N), 1715 (ОСОR), 3260 (ОН). Спектр D Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3,, м.д., J/Гц): 0,93, 0,98, 1,03, 1,08, 1,12 (15Н, 5с, 5СН3);

1,70 (3Н, с, СН3-30);

2,94-2,99 (1Н, м, СН-19);

4,09 и 4,52 (2Н, 2д, J = 10,8, СН2 28);

4,60 и 4,72 (2Н, 2с, СН2-29);

7,44 (2Н, т, J = 8,1, аром.);

7,53 (1Н, т, J = 7,8, аром.);

8,05 (2Н, д, J = 8,1, аром.).

28-Бензоилокси-2-циано-3-норлуп-4(23),20(29)-диен (191). К раствору 1, ммоль соединения 190 в 10 мл безводного хлористого метилена в атмосфере аргона добавляли 3 ммоль (0,27 мл) тионилхлорида. После перемешивания реакционной смеси в течение 30 мин растворитель отгоняли досуха в вакууме водоструйного насоса. К остатку добавляли 10 мл безводного хлористого метилена, растворитель отгоняли. Процедуру повторяли трижды до полного удаления хлорирующего агента. Остаток хроматографировали на колонке с силикагелем, элюент гексан:этилацетат 7:1. Выход соединения 191 – 74%. Т. пл.

89,4С. Rf 0,6 (гексан:этилацетат 7:3). [] 22 +25,5 (c 0,8, CHCl3). ИК спектр: D (ОСОС6Н5), 2246 (СN). Спектр 1Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3,, м.д., J/Гц): 0,84, 1,01, 1,10 (9Н, 3с, 3СН3);

1,71 (6Н, с, СН3-24, СН3-30);

2,48-2,57 (1Н, м, СН-19);

4,08 и 4,52 (2Н, 2д, J = 11,0, СН2-28);

4,63 (2Н, с, СН-23, СН-29);

4,72 (1Н, с, СН 29);

4,87 (1Н, с, СН-23).

28-Гидрокси-2-циано-3-норлуп-4(23),20(29)-диен (192). Раствор 1,3 ммоль соединения 191 в 30 мл 3% спиртового раствора КОН кипятили в течение 1 ч.

Контроль за ходом реакции вели методом ТСХ. Растворитель отгоняли, к остатку добавляли 30 мл воды, продукт экстрагировали этилацетатом (30 мл х 2), органический слой отделяли, промывали водой и сушили над безводным MgSO4.

Растворитель упаривали, остаток очищали методом флэш-хроматографии.

Элюент – гексан/этилацетат (5:1). Выход соединения 192 – 81%. Т. пл. 96,5С. Rf 0,35 (гексан:этилацетат 7:3). [] 22 +34,7 (c 0,3, CHCl3). ИК спектр: 2248 (СN), D 3452 (ОН). Спектр 1Н-ЯМР (300 МГц, CDCl3,, м.д., J/Гц): 0,83, 0,98, 1,06, 1,68, 1,71 (15Н, 2с, 5СН3);

2,34-2,43 (1Н, м, СН-19);

3,34 и 3,78 (2Н, 2д, J = 11,0, СН2 28);

4,59, 4,63, 4,68 и 4,87 (4Н, 4с, СН2-23, СН2-29). Химическую модификацию бетулона и физико-химический анализ продуктов трансформации бетулина проводили на базе Института технической химии УрО РАН, Пермь (лаборатория биологически активных соединений, зав. лабораторией к.х.н. Гришко В.В.).

2.12. Атомно-силовая микроскопия Визуализацию родококков осуществляли с помощью атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D (Asylum Research, США) на базе Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского университета.

На предметное стекло наносили 15–20 мкл клеточной суспензии, препарат сушили на воздухе в течение 20 мин. Сканирование с помощью АСМ осуществляли в полуконтактном режиме на воздухе с использованием кремниевого кантилевера AC240TS с резонансной частотой 50–90 кГц и константой жесткости 0,5–4,4 Н/м. Обработку полученных изображений проводили с помощью программы Igor Pro 6.22A (WaveMetrics, США).

2.13. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина В математическом анализе экспериментальных данных использовали модифицированный метод наименьших квадратов (Линник с соавт., 1962;

Gill et al., 1981). Для нахождения точки минимума суммы квадратов применяли модифицированный метод Ньютона, основанный на спектральном разложении матрицы Гессе (Gill et al., 1981). Математический анализ экспериментальных данных проводили на базе кафедры теоретической механики Пермского национального исследовательского политехнического университета (зав.

кафедрой д.т.н., профессор Няшин Ю.И.).

2.14. Статистическая обработка результатов Математическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием компьютерных программ Excel 2003 (Microsoft Inc., 2003), Statistica, версия 6.0 (StatSoft Inc., 2001), рассчитывая среднее арифметическое и стандартную ошибку. Достоверность различий между средними величинами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕТУЛИНТРАНСФОРМИРУЮЩЕЙ Глава 3.

АКТИВНОСТИ КОЛЛЕКЦИОННЫХ КУЛЬТУР РОДОКОККОВ. ПОИСК ШТАММОВ АКТИВНЫХ БИОТРАНСФОРМАТОРОВ БЕТУЛИНА Бетулинтрансформирующая активность родококков. По нашим данным, исследованные культуры родококков не способные использовать бетулин в качестве единственного источника углерода и энергии. Однако в присутствии глюкозы, глицерина или н-гексадекана, а также в условиях использования МПБ родококки катализируют региоселективное окисление вторичной гидроксильной группы бетулина (10) с образованием бетулона (171) (рис. 5), структура которого подтверждена ГХ-МС- и ЯМР-спектрами, а также данными рентгеноструктурного анализа (рис. 68).

R. rhodochrous IEGM 28CH2OH CH2OH 3 HO O 10 Рис. 5. Окислительная биотрансформация бетулина родококками Рис. 6. ХМС-хроматограмма продуктов биотрансформации бетулина родококками. Пики на хроматограмме соответствуют бетулону (2) и бетулину (1) Рис. 7. Спектр 1Н-ЯМР бетулона (171).

Рис. 8. Структура бетулона (по данным рентгеноструктурного анализа).

Как видно из табл. 2, наиболее высокий (44,9%) уровень образования бетулона достигается в присутствии 1,0 об.% н-гексадекана.

Таблица Биотрансформация бетулина клетками R. rhodochrous ИЭГМ Содержание в сумме продуктов реакции, % Условия Бетулин Бетулон Абиотический контроль Богатая питательная среда (МПБ) 64,5±2,1 35,5±3, Минеральная среда с добавлением 92,5±4,2 7,5±0, глюкозы (1,0%) Минеральная среда с добавлением 74,6±3,8 25,4±3, глицерина (1,0%) Минеральная среда с добавлением 48,0±4,1 44,9±4, н-гексадекана (1,0 об.%) Исследование особенностей роста культуры в процессе биотрансформации бетулина (0,5 г/л) в присутствии 1,0 об.% н-гексадекана показало, что в течение первых 5 сут культивирования родококков формируется гомогенная эмульсия бактериальных клеток с н-гексадеканом, затем наблюдается формирование клеточных агрегатов, а на 910 сут образуются глобулы диаметром от 0,5 до 3 см.

Установлено, что глобулы формируются за счет агрегации клеток и гидрофобного субстрата, что, по-видимому, обеспечивает их взаимодействие и способствует образованию бетулона. При изучении влияния момента внесения тритерпенового субстрата на выход целевого продукта установлено, что наиболее оптимальный момент внесения бетулина – через 2 сут роста бактериальных клеток в присутствии н-гексадекана, при этом выход бетулона составляет 45% (рис. 9).

При исследовании влияния концентрации н-гексадекана на интенсивность процесса биотрансформации бетулина показана прямая зависимость между уровнем образования бетулона и содержанием н-алкана в среде культивирования.

Максимальный (72,2%) выход бетулона регистрируется в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана через 240 ч (рис. 10).

Бетулон, % 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 Время, ч Рис. 9. Динамика образования бетулона в процессе биотрансформации бетулина в условиях внесения субстрата: 1 одновременно с инокулятом;

через 24 ч с начала роста культуры;

3 через 48 ч с начала роста культуры;

через 72 ч с начала роста культуры.

Бетулон, % 240 Время, ч 72 96 120 144 192 Рис. 10. Биотрансформация бетулина (0,5 г/л) клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66 при различном содержании н-гексадекана (об.%) в среде инкубации: 1 – 0,1;

2 – 1,0;

3 – 3,0.

Бетулин вносили через 48 ч.

В результате сравнительного анализа бетулинтрансформирующей активности родококков разных видов в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана выявлена гетерогенность зависимости между уровнем образования целевого продукта и видовой принадлежностью культур. Как видно из табл. 3, большинство культур катализируют образование бетулона с выходом от 40 до 70%, при этом максимальный выход бетулона достигается при использовании R. rhodochrous ИЭГМ 66.

Таблица Биотрансформация бетулина родококками в присутствии н-гексадекана Вид, штамм Бетулон, % Абиотический контроль 0, R. erythropolis ИЭГМ 199 39,9±3, ИЭГМ 200 45,3±3, ИЭГМ 203 53,5±4, ‘R. longus’ ИЭГМ 30 10,9±3, ИЭГМ 31 34,2±2, ИЭГМ 32 38,5±3, R. opacus ИЭГМ 223 9,8±2, R. rhodochrous ИЭГМ 66 72,2±4, ИЭГМ 73 6,6±0, ИЭГМ 608 37,6±2, R. ruber ИЭГМ 79 42,9±2, ИЭГМ 226 2,9±0, ИЭГМ 228 42,9±2, Ранее было показано (Ivshina et al., 1998), что внесение н-гексадекана в среду культивирования родококков в концентрации 3,0 об.% способствует максимальному образованию Высокая степень Rhodococcus-биосурфактов.

биоконверсии бетулина в присутствии н-гексадекана обусловлена, по-видимому, повышением уровня гидрофобности клеточной стенки родококков и синтезом Rhodococcus-биосурфактантов, что обеспечивает взаимодействию бактериальных клеток с гидрофобным тритерпеновым субстратом. Однако, несмотря на относительно высокий (72,2%) выход целевого продукта, длительность (240 ч) процесса биоконверсии и наличие остаточного (до 0,9 об.%) углеводорода в смеси продуктов биотрансформации (данные ГХ-МС анализа) ограничивают возможность использования культуры, растущей в присутствии н-гексадекана, для препаративного получения бетулона.

Исследование процесса биотрансформации бетулина с использованием иммобилизованных клеток родококков. Для повышения эффективности процесса биотрансформации бетулина исследовали каталитическую активность иммобилизованных бактериальных клеток, а также использовали прием солюбилизации липофильного субстрата с помощью поверхностно-активных веществ неионогенной природы. Среди ПАВ наиболее часто применяются Твины – синтетические сурфактанты, состоящие из сложных эфиров жирных кислот полигидроксиэтиленовых производных сорбита и циклодекстрины, характеризующиеся высокой афинностью в отношении, например нортритерпеновых стеролов. С целью повышения степени эмульгирования тритерпенового субстрата в водной среде нами были использованы ДМСО раствор бетулина с добавлением неионогенного эмульгатора Твин 80 или его комбинацию с -циклодекстрином (ЦД) в присутствии 1,0 об.% н-гексадекана.

По нашим данным, после иммобилизации родококков в ПВС их бетулинтрансформирующая активность значительно снижается, что, очевидно, связано со снижением степени доступности тритерпенового субстрата для клеток, заключенных в матрицу ПВС. Вместе с тем, при использовании иммобилизованных клеток в постферментационной среде регистрируется дополнительный метаболит – бетулиновая кислота, образование которой не наблюдалось в условиях использования свободных клеток родококков (табл. 4).

Следует отметить, что использование дополнительных эмульгаторов (Твин 80 и ЦД) также не способствует повышению выхода целевого продукта.

Таблица Биотрансформация бетулина иммобилизованными клетками R. rhodochrous ИЭГМ Способ внесения субстрата Бетулиновая кислота, % 1) в ДМСО 4, 2) в ДМСО с добавлением 0,1 г/л Твин 80 3, 3) в ДМСО с добавлением 0,1 г/л Твин 80 и 3, 0,5 г/л -циклодекстрина (ЦД) Исследование процесса биотрансформации бетулина в условиях использования двухфазных систем. Липофильная природа терпеноидов обусловливает их низкую растворимость (10-2–10-3 г/л) в условиях водной среды и как следствие низкий уровень биодоступности для микроорганизмов.

Продуцируемые многими бактериями биосурфактанты способствуют суспендированию гидрофобных субстратов в жидкой среде культивирования, что, однако, не препятствует образованию малодоступных для биокатализатора твердых частиц вещества в условиях использования повышенных концентраций субстрата. Применение двухфазных систем в процессах биотрансформации способствует повышению биодоступности гидрофобных соединений для клеток.

При этом экстракция субстрата/продукта в органический слой обеспечивает снижение их токсического эффекта на клетки и сдвиг равновесия реакции в сторону образования целевых продуктов.

Исследована способность родококков, предварительно выращенных в минеральной среде с добавлением 1,0 об.% н-гексадекана, 1,0% глюкозы, 1,0% глицерина или в богатой питательной среде, трансформировать бетулин в условиях двухфазной системы этилацетат/буферный раствор в соотношении 1:9.

Показано, что в данных условиях родококки распределяются в органической фазе, при этом прослеживается тенденция к образованию клеточных агрегаций. По данным ТСХ и ГХ-МС анализа, продуктов биотрансформации бетулина не обнаружено, что может быть связано с инактивацией бетулинтрансформирующей способности клеток в присутствии этилацетата вне зависимости от условий предварительного культивирования.

Биотрансформация бетулина с использованием суспензий нерастущих клеток. В микробиологической практике широко и успешно применяется метод трансформации органических соединений с использованием суспензий нерастущих клеток. Данный подход используется для трансформации органических соединений различной структуры и применяется для микробных культур, биомасса которых может быть без особых технологических затруднений отделена от среды выращивания и ресуспендирована в буферном растворе, в условиях которого осуществляется трансформационная реакция. Процесс биоконверсии исходного соединения не лимитируется скоростью роста микробной культуры, при этом возможность использования оптимального количества клеточной биомассы определенного физиологического состояния способствует повышению эффективности и сокращению продолжительности биокаталитического процесса. Кроме того, отсутствие ростовых факторов ограничивает рост посторонней микрофлоры и снижает риск бактериального загрязнения. В отличие от трансформаций, проводимых с использованием растущей культуры (когда в качестве питательной среды используются очень сложные ингредиенты), простая трансформационная среда облегчает процедуру выделение целевого продукта, снижая его себестоимость, что обеспечивает повышение технологичности процесса (Скрябин, Головлева, 1976;

Wang et al., 2006;

Lang et al., 2011).

По нашим данным, нерастущие клетки сохраняют способность к региоселективному окислению бетулина в бетулон. Установлено, что уровень образования целевого продукта в процессе биотрансформации бетулина с использованием нерастущих клеток определяется условиями предварительного культивирования родококков. Так, при использовании клеток, предварительно выращенных в минеральной среде в присутствии 1,0 об.% н-гексадекана, выход бетулона составляет 25%. При этом при перенесении клеток в буферный раствор наблюдается формирование глобул диаметром 0,51,0 см. Невысокий выход целевого продукта и трудность отделения биомассы от среды предварительного культивирования ограничивают возможность использования бактериальных клеток, выращенных в присутствии н-гексадекана. Биомасса, полученная в минеральной среде в присутствии 1,0% глюкозы или 1,0% глицерина, также характеризуется низким выходом и низкой каталитической активностью в отношении бетулина. Повышение содержания бетулона в составе смеси продуктов биотрансформации до 40% достигается при использовании родококков, предварительно выращенных в богатой питательной среде (МПБ) (рис. 11). Применение нерастущих клеток существенно сокращает продолжительность биотрансформации бетулина, а использование буферного раствора позволяет значительно упростить выделение бетулона из смеси продуктов биотрансформации.

45 2, Количество биомассы, OП Бетулон, % 1, 10 0, 0 1 2 3 Бетулон, % Количество биомассы, ОП Рис. 11. Биотрансформация бетулина (0,5 г/л) нерастущими клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66, предварительно выращенными в минеральной среде с добавлением н-гексадекана, 1,0 об.% (1), глюкозы, 1,0% (2), глицерина, 1,0% (3) или в МПБ (4).

Условия процесса: OП600 2,0;

фосфатный буфер (рН 7,0), продолжительность 48 ч.

В результате исследования влияния физиологического состояния на каталитическую активность родококков установлено, что бетулинтрансформирующая активность бактериальных клеток, выращенных в МПБ и отобранных в экспоненциальной или в начале стационарной фазах роста родококков, практически не отличаются. Однако наиболее оптимальным является использование 2-х суточной бактериальной культуры, когда достигается максимальный выход каталитически активной биомассы (рис. 12).

2, Количество биомассы, ОП Бетулон,% 1, 10 0, 0 24 48 72 96 Время, ч Бетулон, % Количество биомассы, ОП Рис. 12. Кривая роста родококков в МПБ и влияние времени предварительного культивирования на процесс ч) ( биотрансформации бетулина нерастущими клетками.

Условия процесса: OП600 2,0;

фосфатный буфер (рН 7,0), продолжительность 48 ч.

Влияние морфологических особенностей на каталитическую активность клеток в отношении бетулина. По данным Е.С. Милько и Н.С.

Егорова (1991), для родококков характерны диссоциативные переходы клеток из S- в R-формы. Нами с использованием техники истончающего штриха (Егоров, 1983) получены однородные (по колониально-морфологическим признакам) диссоцианты R. rhodochrous ИЭГМ 66 (рис. 14). Так, S-формы R. rhodochrous ИЭГМ 66 формируют плоские, тестообразные, блестящие ярко-розовые колонии.

Колонии R-формы – типично шероховатые, со складчатой поверхностью, более сухой консистенции, бледно-красного цвета. Известно (Коронелли и др., 1995), что для клеток R-формы характерно высокое содержание липидов в клеточной стенке, что обусловливает их повышенную гидрофобность и сродство к липофильным субстратам. В результате анализа бетулинтрансформирующей активности R- и S-диссоциантов родококков установлено, что применение нерастущих клеток в R-форме позволяет трансформировать бетулин в среднем на 1015% эффективнее, по сравнению с клетками, пребывающими в S-форме (рис.

13).

R S 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Бетулон, % Рис. 13. Биотранформация бетулина с использованием R- и S-диссоциантов родококков.

Условия процесса: OП600 2,0;

фосфатный буфер (рН 7,0), продолжительность 48 ч.

а б Рис. 14. Диссоциация штамма R. rhodochrous ИЭГМ 66: а S-форма, б R-форма.

Биотрансформация бетулина с использованием полученных клеточных фракций. По данным отдельных авторов, в реакциях микробного окисления вторичной гидроксильной группы тритерпеновых спиртов и кислот (с использованием мицелиальных грибов, бацилл или нокардий) принимает участие холестеролоксидаза (Bastos et al., 2007) или 3-гидроксистероид дегидрогеназа (Leipold et al., 2010). Оба фермента локализуются преимущественно в цитоплазме или связаны с клеточной мембраной и катализируют реакцию окисления 3 гидроксильной группы стеролов (холестерола, -ситостерола) и стероидов с образованием соответствующих кетонов. Как видно из табл. 5, полученный нами супернатант с мембраносвязанными ферментами родококков катализирует реакцию окисления 3-гидроксигруппы холестерола и -ситостерола с образованием 4-ен-3-оновых производных, в то время как в отношении бетулина данный супернатант не активен. Незначительный (10,6%) уровень конверсии бетулина в бетулон наблюдается при использовании супернатанта с внутриклеточными ферментами родококков. Увеличение (до 22,4%) выхода бетулона регистрируется в процессе биотрансформации бетулина ресуспендированными соникатами родококков, содержащими компоненты клеточных стенок, и возможно, элементы бактериальных мембран с интегральными белками, имеющими гидрофобный якорь и связанными с мембранной за счет более прочных гидрофобных взаимодействий. Полученные данные свидетельствует о прочной связи катализирующего окисление бетулина фермента с клеточной мембраной родококков. Следует отметить, что для Rhodococcus sp. показано наличие каналов, состоящих из стероидсвязывающих или стероидтрансформирующих белков и соединяющих цитоплазму с клеточной поверхностью (Atrat et al., 1991;

Wagner et al., 1992). Суммарная (33%) активность внутриклеточных ферментов и ферментов, прочно связанных с клеточной мембранной родококков, практически сопоставима с бетулинтрансформирующей активностью (40%) целых клеток.

Таблица Окислительная биотрансформация бетулина, холестерола и -ситостерола с использованием клеточных фракций из R. rhodochrous ИЭГМ Клеточная фракция Бетулон Холестенон Стигмаст-4-ен-3-он Целые клетки +++ +++ ++* Супернатант с внутриклеточными + + + ферментами Супернатант с мембранносвязан- +++ ++ ными ферментами Ресуспендированные +++ + + соникаты клеток Примечание. *Обозначена интенсивность образования оксопроизводного, по данным ТСХ и ГХ-МС.

Известно, что значительное влияние на активность ферментов оказывает уровень водородного показателя (рН среды), который определяет степень ионизации функциональных групп и конформацию каталитического центра фермента. При исследовании влияния рН буферного раствора на процесс биотрансформации бетулина (0,5 г/л) нами выявлено, что наиболее высокая степень образования бетулона достигается в условиях слабощелочной реакции среды. При рН 8,0 и 9,0 выход целевого продукта составляет 45%. Полученные результаты согласуются с данными X. Yang с соавт. (2007) о максимальной активности 3 -гидроксистероид дегидрогеназы актинобактерий рода Mycobacterium при рН 8,59,5, в то время как холестеролоксидаза актинобактерий рода Rhodococcus проявляет наибольшую активность при рН 7,0–7,5 (Yazdi et al., 2008;

Lashkarian et al., 2010), что может свидетельствовать об участии дегидрогеназы в окислении бетулина.

Дальнейшие исследования по биотрансформации бетулина нерастущими клетками были направлены на поиск условий, обеспечивающих повышение количественного уровня образования бетулона.

Глава 4. ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ПРОЦЕССА БИОТРАНСФОРМАЦИИ БЕТУЛИНА По нашим данным, внесение в буферный раствор энергетических субстратов (1,0% глюкозы или 1,0% этилового спирта) не приводит к повышению эффективности процесса биотрансформации бетулина нерастущими клетками, при этом выход целевого продукта снижается и составляет 35%.

Влияние количества используемой клеточной биомассы. Для многих биотрансформационных процессов с использованием нерастущих клеток выявлена зависимость между количеством используемой клеточной биомассы и выходом целевого продукта (Wang et al., 2006;

Chen et al., 2008;

Cotter et al., 2009). Нами установлена характерная зависимость между количеством биомассы нерастущих клеток и выходом целевого продукта. Как видно из рис. 15, максимальный (65%) выход бетулона регистрируется при использовании 10 г/л (ОП600 2,6) клеточной биомассы. Дальнейшее повышение (до 25 г/л) количества используемой биомассы приводит к резкому снижению степени биоконверсии бетулина. Наблюдаемый эффект, по-видимому, обусловлен ограничениями процессов массопереноса при увеличении (более 10 г/л) клеточной биомассы.

30 Количество биомассы, г/л Бетулон, % 15 0 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2, Оптическая плотность клеточной суспензии, ОП Количество биомассы, г/л Бетулон, % Рис. 15. Влияние концентрации биомассы R. rhodochrous ИЭГМ 66 на процесс биотрансформации бетулина (0,5 г/л).

Условия процесса: фосфатный буфер (рН 8), продолжительность 48 ч.

Исследование процесса биотрансформации бетулина в условиях внесения высоких концентраций бетулина. Серия последующих экспериментов посвящена изучению возможности биотрансформации бетулина в условиях использования повышенных (в 2–6 раз) концентраций нерастущих клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66. Результаты проведенных исследований свидетельствуют (рис. 16) о том, что для родококков характерна тенденция к агрегации клеток с частицами тритерпенового субстрата и образованию агрегатов размером 1215 мкм (рис. 16б). При этом повышение концентрации вносимого бетулина приводит к увеличению размера агломератов до 25 мкм (рис. 16в).

б а в Рис. 16. Клетки R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в фосфатном буфере с добавлением 0,5 (а), 1,0 (б) или 3,0 (в) г/л бетулина (фазово-контрастная микроскопия, х1000).

В результате исследования жизнеспособности бактериальных клеток установлено, что в течение 48 ч наблюдается незначительное снижение оптической плотности клеточной суспензии в буферном растворе (с 2,6 до 2,56) и количества жизнеспособных клеток (с 6,5x106 до 6,35x106). При исследовании влияния концентрации бетулина на жизнеспособность клеток установлена обратно пропорциональная связь между численностью клеток и концентрацией бетулина (рис. 17). Снижение численности родококков может быть связано с увеличением концентрации растворителя бетулина (ДМСО) до 3,0% (v/v) в буфере, что вызывает частичное разрушение клеточных мембран и, возможно, гибель части клеток (Gurtovenko, Anwar, 2007).

Численность, КОЕ 10 мл/кл 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Концентрация бетулина, г/л Рис. 17. Численность жизнеспособных клеток в процессе биотрансформации бетулина в различных концентрациях.

Условия процесса: OП600 2,6;

фосфатный буфер (рН 8,0), продолжительность 48 ч.

Исследование морфологических особенностей клеток в процессе биотранформации бетулина с помощью атомно-силовой микроскопии.

Известно, что одним из ключевых факторов, обеспечивающих эффективность процессов биотрансформации, является взаимодействие клеток с гидрофобным субстратом. При этом современное представление о взаимодействии гидрофобного субстрата с клетками биокатализатора сводится к двум основным идеям: (1) ассимиляция субстрата осуществляется посредством солюбилизации (молекулярное диспергирование) или псевдосолюбилизации (мицеллообразование), независимо от причины солюбилизации или псевдосолюбизации;

(2) ассимиляция субстрата происходит путем прямого контакта между клеткой и поверхностью микрокристалла субстрата (Cameotra et al., 1983;

Goswami et al., 1994). В действительности процесс взаимодействия клеток с гидрофобным субстратом намного сложнее и требует комплексного подхода к изучению особенностей его механизмов, включая использование современных методов визуализации, как то: электронная микроскопия, атомно силовая микроскопия и др.

Среди различных методов визуализации биологических объектов все более широкое применение находит АСМ один из видов сканирующей зондовой микроскопии, основанный на ван-дер-ваальсовских взаимодействиях зонда с поверхностью образца. АСМ позволяет получить истинно трёхмерный рельеф поверхности, а также исследовать особенности структуры поверхности бактерий.

В результате анализа полученных АСМ-изображений установлено, что бетулин в концентрации 0,5 г/л практически не оказывает влияния на морфологию поверхностных структур бактерий. В то время как в присутствии бетулина в концентрации 3,0 г/л на поверхности клеток визуализированы неровности различного масштаба, представляющие собой, по-видимому, адсорбированные частицы субстрата (рис. 18). Полученные результаты дают основание к предположению о том, что окислительная биотрансформация бетулина родококками протекает благодаря адгезии бактериальной клетки к тритерпеновому субстрату.

а б а б а б в г а б в г д Рис. 18. Атомно-силовая микроскопия родококков в процессе биотрансформации бетулина: 1) бетулин в буферном растворе: а – АСМ изображение, б трехмерная проекция;

2) осажденные на поверхности стекла клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 в буферном растворе (контроль): а – АСМ изображение, б трехмерная проекция;

3) осажденные на поверхности стекла клетки R. rhodochrous ИЭГМ 66 в присутствии бетулина в концентрации 0,5 г/л:

а АСМ-изображение, б трехмерная проекция, в поперечный профиль, г продольный профиль;

4) осажденные на поверхности стекла клетки R.

rhodochrous ИЭГМ 66 в присутствии бетулина в концентрации 3,0 г/л: а АСМ изображение, б трехмерная проекция, в профиль, г АСМ-изображение, д трехмерная проекция.

Сходный механизм взаимодействия клеток с гидрофобными стеролами описан для бактерии M. fortuitum, трансформирующей ситостерол в 9-гидрокси андрост-4-ен-3,17-дион (Atrat et al., 1991). Показано, что клетки микобактерий агрегируют с поверхностью частиц субстрата, образуя стабильные агломераты, то есть происходит так называемая “иммобилизация клеток на частицах субстрата”.

Изучение клеточно-субстратных агломератов методом электронной микроскопии свидетельствует о том, что микобактерии врастают в микрокристаллы субстрата, потребление субстрата идет благодаря непосредственному контакту между клетками и частицами субстрата. На основании полученных результатов предложена модель взаимодействия стерола с микобактериями, согласно которой в зоне контакта частицы стеринового субстрата с клеточной поверхностью микобактерий имеется многокомпонентная подвижная мезофаза. Функция мезофазы состоит в постепенном растворении стерола, запуске механизма его потребления и транспорта в клетку. Предположительно, мезофаза может состоять из гликолипидов, экстраклеточных биолипидов, синтетических детергентов, стерола и воды. По-видимому, для родококков также характерно образование мезофазы в процессе биотрансформации бетулина, что подтверждается данными АСМ при сканировании клеток через 48 ч с начала процесса биотрансформации бетулина (рис. 19).

а б Рис. 19. АСМ-изображение (а) и трехмерная проекция (б) осажденных на поверхности стекла клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 в присутствии бетулина (3,0 г/л). Фотографии сделаны через 48 ч процесса биотрансформации бетулина.

Исследование респираторной активности. В процессе исследования респираторной активности родококков установлено, что бетулин в концентрации от 0,5 до 3,0 г/л не оказывает ингибирующего влияния на дыхание бактериальных клеток (рис. 20). При этом скорость потребления О2 практически не зависит от концентрации вносимого бетулина и достигает максимальных значений в течение первых 24 ч эксперимента, что совпадает с периодом наибольшей каталитической активности родококков в отношении 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 г/л бетулина с образованием 60, 56,8, 51,7 и 40,0% бетулона соответственно. Сравнительно высокий уровень метаболической активности нерастущих родококков на начальном этапе процесса биотрансформации бетулина, по-видимому, может быть связан с запуском адаптационных механизмов при переносе жизнеспособных клеток в среду без источников питания (Эль-Регистан, 2005;

Мулюкин, 2010). В последующие часы наблюдается постепенное снижение и стабилизация интенсивности дыхания и каталитической активности родококков. На рис. 21 представлена характерная зависимость уровня образования бетулона от скорости потребления О2.

1, - 1, Скорость потребления О2, мкл/мин 0, 0, 0, 0 24 36 48 72 Время, ч Рис. 20. Респираторная активность нерастущих клеток R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в процессе биотрансформации бетулина (0,53,0 г/л).

Условия процесса: фосфатный буфер (рН 8,0), OП600 2,6.

80 1, 70 1, - Скорость потребления О2, мкл/мин 60 1, 50 Бетулон, % 40 0, 30 0, 20 0, 10 0, 0 0 24 48 72 Время, ч Рис. 21. Динамика образования бетулона (1) и респираторная активность (2) нерастущих клеток R. rhodoсhrous ИЭГМ 66 в процессе биотрансформации бетулина (0,5 г/л).

Условия процесса: фосфатный буфер (рН 8,0), OП600 2,6.

Несмотря на то, что максимальный (75%) уровень биоконверсии бетулина в бетулон регистрируется при использовании 0,5 г/л бетулина через 96 ч, наиболее подходящими условиями для препаративного получения бетулона (40%) является внесение бетулина в концентрации 3,0 г/л и продолжительность процесса 24 ч (рис. 22).

70 1,4 90 1, 60 1, 1, 50 1, Бетулон, г/л Бетулон, % 1, Бетулон, г/л Бетулон, % 40 0, 30 0, 0, 0, 20 0, 20 0, 10 0, 10 0, 0 0 0 0,5 1,0 2,0 3, 0,5 1,0 2,0 3, Концентрация бетулина, г/л Концентрация бетулина, г/л Бетулон, % Бетулон, г/л а б Бетулон, % Бетулон, г/л Рис. 22. Образование бетулона в процессе биотрансформации бетулина в различных концентрациях с использованием нерастущих клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 в течение (а) 24 ч, (б) 96 ч.

Условия процесса: фосфатный буферный раствор (рН 8,0);

OП600 2,6.

Биотрансформация бетулина с использованием нерастущих клеток родококков разных видов. В результате исследования процесса биотрансформации бетулина (3,0 г/л) в подобранных условиях (рН 8,0;

OП600 2,6) с использованием нерастущих клеток родококков разных видов установлено, что наиболее высокой степенью биоконверсии бетулина характеризуются коллекционные культуры, принадлежащие к R. rhodochrous и R. erythropolis (табл.

7). В отличие от растущих культур (см. табл. 2), нерастущие клетки R. opacus и ‘R. longus’ катализируют образование лишь следовых (менее 5%) количеств бетулона, а таковые R. ruber вообще не проявляют бетулинтрансформирующих свойств.

Таблица Биотрансформация бетулина (3,0 г/л) нерастущими клетками родококков Вид, штамм Бетулон, % R. rhodochrous ИЭГМ 62 39±3, ИЭГМ 63 14,6±4, ИЭГМ 66 40±4, ИЭГМ 608 29,9±3, ИЭГМ 646 17,1±2, ИЭГМ 647 24,1±1, ИЭГМ 655 24,4±1, ИЭГМ 760 36,6±3, R. erythropolis ИЭГМ 7 9,7±0, ИЭГМ 17 12±0, ИЭГМ 25 10,9±0, ИЭГМ 266 26,3±2, ИЭГМ 499 10,4±0, ИЭГМ 678 17±0, ИЭГМ 682 14,9±0, ИЭГМ 683 20,2±3, R. opacus ИЭГМ 61 ИЭГМ 246 ‘R. longus’ ИЭГМ 488 ИЭГМ 692 R. ruber ИЭГМ 90 0, ИЭГМ 237 0, Биотрансформация бетулона с использованием и R. rhodochrous Предполагается, что окисление 3-гидроксильной группы R. erythropolis.

тритерпеновых кислот и спиртов – начальный этап расщепления кольца А тритерпеноидов и образования секопроизводных, перспективных противоопухолевых агентов (Akihisa et al., 2002). Для определения возможности более глубокого окисления бетулина родококками исследовали способность представителей R. rhodochrous и R. erythropolis к биотрансформации бетулона.

Процесс биотрансформации бетулона проводили с использованием растущих и нерастущих клеток родококков. Показано, что в условиях использования МПБ или фосфатного буферного раствора родококки не способны к биоконверсии бетулона. В присутствии 1 об.% н-гексадекана через 7 сут регистрируется частичное (5%) обратимое восстановление бетулона в бетулин. Аналогичный процесс восстановления гидроксильной группы 3-оксопроизводного описан в процессе биотрансформации глицирризина представителями кишечной микрофлоры (Clostridium innocuum ES24-06, Eubacterium sp. GLH, Ruminococcus при этом отмечено также обращение конфигурации С(3) sp. PO1-3), гидроксильной группы глицирретовой кислоты из - в -положение (Akao et al., 2001). Следует отметить, что в процессе биотрансформации бетулона в присутствии 1 об.% н-гексадекана на 4–5 сут также наблюдается образование глобул, представляющих собой скопление клеток и гидрофобного субстрата.

Нами не выявлено других ожидаемых продуктов биотрансформации бетулона (бетулоновой кислоты или секопроизводных бетулина), что подтверждает высокий уровень селективности актинобактерий рода Rhodococcus в отношении бетулина (рис. 23).

OH OH COOH 28 28 3 Бетулоновая Бетулин Бетулон HO O O кислота OH R R А-секопроизводное Рис. 23. Возможные пути биотрансформации бетулина Биологический смысл трансформации бетулина. Изучение микробиологической трансформации органических соединений сопровождается поиском объяснения биологического смысла этих реакций, об их значении для микробной клетки. Это может быть “случайным” процессом, результатом действия конститутивных ферментных систем. Вероятно, что модификация бетулина осуществляется как побочная функция ферментами, основной функцией которых является метаболизм других соединений. Возможно и другое объяснение модификации, а именно эти превращения осуществляются полифункциональными ферментными системами, которые не имеют прямого отношения к конструктивному или энергетическому метаболизму и функцией которых является воздействие на весьма широкий спектр поступающих в клетку соединений. Г.А. Белицким (1969) сформулировано представление о системе неспецифических ферментов, осуществляющих первичную атаку на необычные для микробной клетки вещества. Неспецифическое действие ферментов основано на их полифункциональности и составляет функциональную основу микробиологических модификаций. Биологический смысл модификаций заключается в способности микроорганизмов атаковать самые разнообразные органические вещества, независимо от конечного результата. Активное отношение микроорганизмов к химическим компонентам среды – одна из основных предпосылок их адаптации к среде обитания. Эта активность позволяет организму использовать неосвоенные элементы среды, включать их в сферу своей жизнедеятельности. Клетка осуществляет первичную атаку на необычные для ее метаболических систем вещества, результатом которой может быть дальнейшая ассимиляция вещества, или накопление трансформированного продукта. Большая часть микробиологических трансформаций (стероидов, терпенов, антибиотиков, алкалоидов и даже углеводов) относится к сфере так называемого периферийного или подготовительного метаболизма. Ферменты, участвующие в процессах периферийного обмена, имеют ряд специфических особенностей. В частности, именно для этих процессов характерно накопление в среде интермедиатов, широкая субстратная специфичность ферментов и разного рода побочные реакции как результат широкой специфичности (Скрябин, Головлева, 1976).

Высокая бетулинтрансформирующая активность родококков может быть связана с тем, что в условиях голодания нерастущие клетки метаболизируют бетулин с целью использования его в качестве источника углерода и энергии, при этом первичная атака бетулина сопровождается образованием бетулона.

Очевидно, в клетках отсутствуют ферментные системы, способные к дальнейшей модификации бетулона, что приводит к его накоплению в трансформационной среде в качестве основного метаболита.

Глава 5. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССА БИОТРАНСФОРМАЦИИ БЕТУЛИНА Для построения математической модели процесса биотрансформации бетулина использовали эмпирические данные о влиянии на процесс таких факторов, как рН буферного раствора, количество клеточной биомассы и концентрация субстрата (табл. 8, табл. 9).

Биомеханика процесса биотрансформации бетулина. Биомеханические аспекты биотрансформации бетулина определяются механикой движения клеток родококков и окружающей их жидкости с субстратом (бетулином) в колбах Эрленмейера, закрепленных на платформе орбитального шейкера. Характер этого движения оказывает влияние на уровень окислительной биоконверсии бетулина.

Влияние может быть прямым – изменение степени взаимодействия клеток с субстратом или опосредованным – изменение характеристик аэробного дыхания клеток при перемешивании жидкости. Далее нами рассмотрено только прямое влияние, для количественного описания которого использованы феноменологические представления, предложенные в (Куюкина и др., 2007).

Предполагается, что в системе отсчета, связанной с колбой, молекулы субстрата и бактериальные клетки образуют идеальные псевдогазы. Пусть u – средняя скорость движения частиц псевдогазов, y(t) – зависимость процента выхода бетулона от времени.

Таблица Влияние уровня рН буфера и количества биомассы на выход (%) бетулона Количество биомассы, OD600 нм Уровень рН 1,6 2,2 2, н.д.

6 24,8 41, н.д.

7 29,9 45, 8 34,8 50,2 39, н.д.

9 49,9 39, Примечание. “н.д.” нет данных.

Таблица Динамика образования бетулона (%) при внесении различных концентраций бетулина Время, ч Концентрация субстрата, г/л 3 24 48 72 0,10 29,8 49,8 51,2 51,9 52, 0,25 28,7 50,2 50,3 51,3 51, 0,50 32,6 49,3 50,2 50,6 51, С механической точки зрения интенсивность реакции биотрансформации и, следовательно, скорость dy(t)/dt изменения y(t) определяется частотой столкновений молекул субстрата и клеток. Будем считать, что скорость пропорциональна частоте столкновений: dy(t)/dt=kv, где k – некоторый коэффициент. За бесконечно малый промежуток времени dt с клеткой столкнется половина молекул субстрата, находящихся в окружающем клетку слое жидкости толщиной u dt (вторая половина движется в противоположном направлении), следовательно, с данной клеткой столкнутся Suns(t)dt/2 молекул субстрата, где S – площадь поверхности клетки, ns(t) – концентрация молекул субстрата. Так как y(t) = C1(ns(0) ns(t)), где C1 – некоторый калибровочный коэффициент, то y(0) = и dy(t)/dt = (a1 y(t))/a2, где a1 = C1ns(0), a2 = 2C1/(kSu). Решением полученного дифференциального уравнения является экспоненциальная функция:

y(t) = a1(1exp(t/a2)) (1).

Рассмотрим теперь влияние концентрации биомассы nb на максимальный выход y бетулoна. С одной стороны, уменьшение nb приводит к уменьшению y, поэтому можно считать, что при малых nb y пропорционален nb. С другой стороны, чрезмерное увеличение nb также приводит к уменьшению y за счет ограничения процесса массопереноса. Поэтому можно считать, что y пропорционален вероятности w того, что длина свободного пробега L клетки как частицы псевдогаза больше некоторого критического значения Lc. Поскольку w = exp(Lc/Lm), где Lm = 1/(nbs) – средняя длина свободного пробега, s – эффективное поперечное сечение соударения (4), то y = C2nb exp(Lcsnb), где C2 – некоторый коэффициент. Зависимость y(nb) имеет максимум. Представим эту зависимость в окрестности максимума приближенно в виде y = C3 +C4nb + C5nb2, где коэффициенты C3, C4, C5 выражаются через C2, Lc, s. Максимальный выход бетулона зависит также от уровня pH буфера, следовательно, коэффициенты C3, C4, C5 в последнем равенстве зависят, вообще говоря, от этого уровня. Данная зависимость механическими закономерностями не определяется, поэтому учтем ее феноменологически. Для сохранения квадратичного характера функции y будем считать, что C3 зависит от уровня pH квадратично, C4 – линейно, а C5 не зависит от уровня pH. Обозначая через x1 концентрацию биомассы, через x2 – pH буфера, окончательно получим y = c1x12 + c2x22 +c3x1x2 + c4x1 + c5x2 + c6 (2), где c1, c2, c3, c4, c5, c6 – некоторые параметры. Для отыскания этих параметров, а также параметров a1, a2, в соотношении (1) необходимо рассмотреть нижеследующую задачу.

Математическая формулировка и метод решения задачи вычисления параметров процесса по результатам измерений. Для обработки экспериментальных данных использовали модификацию метода наименьших квадратов (Линник, 1962;

Gill et al., 1981). При этом зависимость исследуемой величины от параметров не предполагалась линейной, а закон распределения ошибок не предполагался нормальным. По сути, рассматривалась задача вычисления параметров по результатам косвенных измерений. Для решения задачи необходимо сформулировать математическую модель рассматриваемого процесса. Обычно предполагается, что процесс характеризуется параметром A и двумя переменными величинами X и Y, связанными линейным соотношением Y = AX (3). Ниже рассмотрена более общая ситуация, когда имеется несколько параметров A1,…..AK (K – число параметров;

набор параметров обозначим A ), и они связаны с величинами X и Y соотношением (вообще говоря, нелинейным) ( ) Y = F A, X, (4), где F – известная функция. Далее следует сформулировать математическую модель процесса измерения величин, характеризующих явление.

В частном случае (3) параметр A и в общем случае (4) параметры A для непосредственного измерения недоступны. Экспериментатор придает величине X ряд значений X 1,..., X N ;

эти значения считаются известными точно;

N – число экспериментальных точек. Будем считать, что соответствующие величины Y1,..., YN измеряются с несистематическими неизвестными либо одинаковыми абсолютными, либо одинаковыми относительными ошибками. Иначе говоря, имеются независимые случайные величины y1,..., y N (весь набор обозначим y ), плотности которых неизвестны, но отличаются только сдвигом;

при этом M yn = Yn, где M – взятие среднего значения. Таким образом, известны (непосредственно измерены): величины X 1,..., X N (не случайные) и величины y (случайные);

неизвестны: параметры A (не случайные) и величины Y1,..., YN (не случайные). Далее следует обеспечить точную математическую постановку (в рамках сформулированных моделей) задачи вычисления параметров явления по результатам измерений. Обратимся к частному случаю (3). В нестрогой постановке задача состоит в том, чтобы вычислить A по измеренным y. Уточним эту постановку. Прежде всего, достоверное вычисление A принципиально невозможно, так как величины y, “содержащие информацию” об A, – случайные (имея в распоряжении только случайные величины, ничего нельзя найти точно).

Поэтому можно пытаться указать только отрезок ( y ) (рис. 24), на котором лежит A (отрезок зависит от y – вычисляется по измеренным y – и поэтому является случайным). Но если требовать, чтобы значение A обязательно лежало на некотором, то расширяется до всей прямой (и никакой информации об A получить не удается).

Рис. 24. Область определения параметров с заданной вероятностью.

Действительно, y теоретически могут сколь угодно сильно отклоняться от средних значений (практически трудно указать достаточно узкие интервалы, за пределы которых y заведомо не выходят), следовательно, и найденная по y “оценка” A может быть сколь угодно сильно ошибочна. Поэтому можно пытаться искать отрезок, на котором A лежит лишь с заданной вероятностью 0 p 1. Но это невозможно, так как плотности y неизвестны;

без использования этих плотностей нельзя подсчитать вероятность попадания A на построенный отрезок и убедиться, что она равна p. Если N, то эту вероятность можно подсчитать с погрешностью O (1 N ). После изложенных рассуждений окончательно приходим к следующей задаче 1: при заданном 0 p 1 найти на числовой оси отрезок ( y ), на котором A лежит c вероятностью p + O (1 N ). Отрезок определяется центром a и полушириной (рис. 26);

их требуется найти, причем a и зависят от y и поэтому являются случайными. Решение задачи 1 не обязательно единственно. Поэтому можно усложнять постановку, вводя критерий сравнения решений и ставя целью найти лучшее (в некотором классе) решение. Далее рассматривается только одно решение (основанное на идеях метода наименьших квадратов). Заметим также, что в задачу 1 можно включить нахождение аналогичного отрезка для (неизвестной) дисперсии случайных величин y. В общем случае (2) набор параметров есть K-мерный вектор, поэтому следует искать область в K-мерном пространстве. Соответствующее обобщение задачи имеет следующий вид: задача 2 при заданном 0 p 1 найти в K-мерном пространстве область ( y ), в которой A лежит c вероятностью p + O (1 N ).

Рассмотрим кратко ход решения сформулированных задач. Метод решения состоит в том, что сначала из эвристических соображений находятся выражения для a ( y ) и ( y ), а затем строится доказательство того, что эти выражения, действительно, дают решение (точнее, одно из решений, c учетом сделанных выше замечаний о единственности).

В качестве центра a ( y ) отрезка следует выбрать величину, которая в качестве “предположительного” значения параметра “наилучшим образом” A соответствует измеренным y. Согласно (эвристическому) методу наименьших квадратов, a ( y ) – точка минимума функции N ( y S (a) a X n ) (5) = n n = N N В частном случае (3) a ( y ) = X n yn X n = 1= n n (если не все X n = 0, что будем предполагать). Кроме того, N N S min ( y ) S ( a ( y ) ) ( yn a ( y ) = S= 2 X n2 (6) Xn ), G ( a ( y ) ) = = n =1 n = В данном случае G не зависит от y. Нетрудно убедиться, что M a ( y ) = A, ( ( N 1) G ), где D – взятие дисперсии. (В последней формуле = 2M S min ( y ) Da ( y ) N 1, что будем предполагать). Величина Da ( y ) остается неизвестной, так как M S min ( y ) содержит неизвестные дисперсии y (ввиду квадратичности S min ( y ) ).

Перейдем к выбору “подходящего” выражения для полуширины ( y ) отрезка.

Заметим, что a ( y ) – cумма “большого” числа случайных величин. Известно (van der Waerden, 1957), что такая сумма имеет “приближенно” нормальную плотность. Тогда можно “приближенно” найти вероятность p того, что a ( y ) M a ( y ) Da ( y ), где 0 – заданное число:

exp ( 2 ) d (7).

= p Тем самым, искомая полуширина равна Da ( y ), так как p – это вероятность того, что A лежит на отрезке с центром a ( y ) и данной полушириной. Как было упомянуто выше, Da ( y ) неизвестна, поэтому последний шаг решения задачи Da ( y ) “приближенно состоит в замене величины равной” величиной ( ( N 1) G ).

2 S min ( y ) Окончательно приходим к выражению:

( ( N 1) G ) для полуширины;

( y ) =2 S min ( y ) находится из уравнения (5) (в котором p, по условию задачи 1, задано). На этом заканчивается эвристическая часть решения задачи 1. Далее можно доказать следующее утверждение: отрезок ( y ) : A a ( y ) ( y ) (8), дaет решение задачи 1. Доказательство этого утверждения является громоздким и поэтому здесь не приводится. Сделаем только несколько замечаний к утверждению. Все упомянутые “приближения” приводят, в строгой формулировке утверждения, к погрешности O (1 N ) в вероятности При увеличении увеличивается набор X 1,..., X N.

p. N Вышеупомянутое утверждение можно доказать только при (естественном) ограничении на структуру этого увеличивающегося набора: точки X n не должны “накапливаться” в окрестности значения X = 0, где значение Y = AX “не ( ) содержит информации” об A. Можно доказать, что M ( y ) = N. Этот O порядок показывает, что построенный отрезок и, следовательно, “погрешность”, с которой “найден” параметр A, являются “достаточно малыми”.

Теперь обратимся к общему случаю (4). На основании аналогичных эвристических соображений можно выписать следующие формулы, обобщающие (5)–(8): ak ( y ) ( 1 k K ;

обозначение – a ( y ) ) – точка минимума функции N ( y F ( a, X n ) ),(9) S (a) = n n = 2S ( ) N ( a ( y ) ), 1 m K, (10) yn F ( a ( y ), X n ), Gk m ( y ) = S min ( y ) = ak am n = det G ( y ) 1K d 1... d K exp Gkm ( y ) k m, Gkm = Gk m (G ) (G ) = 1 p,(11) ( 2 ) K 2 k,m =1 kk mm ( y) N K ):

прямоугольный параллелепипед (рис. 24, – Ak ak ( y ) 2 S min ( y ) ( G 1 ( y ) ) ( N K ), 1 k K, (12).

kk Заметим, что Gk m (матрица Гессе) зависит от y, а правая часть выражения для p в (11), в отличие от (7), зависит от G. Можно доказать утверждение, аналогичное утверждению о решении задачи 1: прямоугольный параллелепипед (12) дaет решение задачи 2. К этому утверждению следует сделать несколько замечаний.

Можно доказать, что в рассматриваемом общем случае (4) M a ( y ) A + O (1 N ), = то есть, в отличие от частного случая (3), средние значения координат центра полученного случайного прямоугольного параллелепипеда не равны точно (неизвестным) значениям параметров. Этот факт есть следствие (вообще говоря) нелинейности функции F в соотношении (4). Аналогично утверждению о решении задачи 1, вышеупомянутое утверждение справедливо, если точки набора X 1,..., X N не “накапливаются” в окрестности тех значений X, где производная F по какому-либо параметру Ak равна нулю (и, следовательно, значение ( ) Y = F A, X “содержит мало информации” об Ak.

При практических вычислениях по формулам (9)–(12) основная трудность состоит в нахождении точки минимума cуммы квадратов (9). Обычно это можно сделать только численно, используя один из известных методов. В настоящей работе применялся модифицированный метод Ньютона, основанный на спектральном разложении матрицы Гессе (Gill et al., 1981).

Обработка экспериментальных данных. Математический анализ данных табл. 9 проводили в соответствии с соотношением (1). Параметры a1, a определяются концентрацией субстрата. Для их нахождения был использован подход, изложенный выше. В формулах (11)–(12) положено =1, тогда полуширина отрезка, на котором лежит значение параметра, есть оценка соответствующего среднеквадратичного отклонения, при этом вероятность p = 0, 4. Полученные теоретические кривые (и экспериментальные точки) приведены на рис. 25 (а, б, в). Из графиков видно хорошее соответствие экспериментальных данных и теоретических результатов, что подтверждает адекватность разработанной математической модели для описания процесса биотрансформации бетулина в условиях использования различных концентраций субстрата. Численные значения параметров a1, a2 и их среднеквадратичных отклонений () представлены в табл. 10. Максимальная приведенная погрешность составляет 0,45%. Выявленные закономерности использовали для разработки прогнозной модели процесса биотрансформации бетулина в повышенных концентрациях (рис. 25г, 25д, 25е).

Таблица Теоретические параметры (кинетические константы) процесса биотрансформации бетулина Концентрация 1, % a2, ч 2, ч a1, % субстрата, г/л 0,10 51,2 0,43 3,45 0, 0,25 50,9 0,35 3,62 0, 0,50 50,5 0,45 2,89 0, а б г в д е Рис. 25. Математическое моделирование процесса биотрансформации бетулина Определение оптимальных значений уровня рН и количества клеточной биомассы проводили с учетом данных, представленных в табл. 8. Зависимость выхода целевого продукта от количества биомассы и pH буфера определяется соотношением (2). Для нахождения параметров c1, c2, c3, c4, c5, c6 применялся =2, тогда изложенный выше подход. В формулах (11)–(12) положено p = 0,3. Полученная теоретическая поверхность (поверхность вероятность отклика (Yang, Zhang, 2012)) и экспериментальные точки показаны на рис. 26.

Численные значения параметров и их среднеквадратичных отклонений:

с1 = 34,2%/OD2600нм, с2 = 1,12%/рН2, с3 = 1,65%/(рНxOD600нм), с4 = 168%/OD600нм, с5 = 23,4%/рН, с6 = 241%, 1 = 2,1%/OD2600нм, 2 = 0,34%/ рН2, 3 = 1,1%/(рНxOD600нм), 4 = 6,5%/OD600нм, 5 = 4,0%/pH, 6 = 16%. Согласно представленной модели, оптимальные значения параметров процесса биотрансформации: количество биомассы x1opt = 2,38 OD600нм;

pH буфера, x2opt = 7,81 pH. Следует отметить, что значения рН=8, ОD600нм 2,4 и 2,6, являются “выбросами” и плохо аппроксимируются математической зависимостью.

Рис. 26. Математическая модель процесса биотрансформации бетулина в зависимости от концентрации биомассы и уровня рН буферного раствора Разработан теоретический подход к математической обработке экспериментальных данных, полученных в результате исследования процесса биотрансформации бетулина. Представлены биомеханические аспекты процесса биотрансформации бетулина, связанные с характером взаимодействия бактериальных клеток и частиц субстрата. Построена математическая модель, адекватно описывающая процесс биотрансформации бетулина в условиях различных концентраций исходного субстрата. Предложенный подход может быть эффективно распространен на близкие задачи.

Глава 6. ХИМИКО-ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ СЕКОПРОИЗВОДНЫХ БЕТУЛИНА Химический синтез 3,4-секобетулина на основе бетулона, полученного в результате бактериального окисления бетулина. В связи с неспособностью родококков катализировать образование секопроизводных бетулина реакцию окислительного расщепления кольца бетулона проводили с помощью химических агентов. Полученный при максимальной (3,0 г/л) нагрузке бетулина экстракт продуктов биотрансформации, содержащий бетулон (171), вводили в дальнейшие химические превращения без предварительной очистки бетулона (171).

Химический синтез 3,4-секобетулина (192) включал реакции оксимирования и фрагментации по Бекману (рис. 4). Так, обработкой смеси продуктов биотрансформации солянокислым гидроксиламином в смеси этанола и пиридина с выходом 61% получен оксим бетулона (189). Для исключения возможной изомеризации с участием свободной С(28) гидроксильной группы оксима (189) под действием кислотных агентов в процессе расщепления кольца А использовали бензильную защиту (выход 28-бензоилоксипроизводного составил 65%). Следует отметить, что полученный во второй стадии оксим (189) напрямую может быть использован в синтезе гетероциклических и функционализированных тритерпеновых производных. В реакции Бекмана с участием тионилхлорида использовали бензоилоксипроизводное (191), расщеплением кольца А которого с выходом 74% получено соответствующее 3,4 секопроизводное (191). Последующим щелочным гидролизом соединения (191) синтезирован целевой 3,4-секобетулин (192) (выход 81%).

Таким образом, нами предложен новый метод синтеза 3,4-секопроизводного бетулина, сочетающий в себе стадию предварительного бактериального окисления бетулина и последующей химической модификации полученного бетулона. При этом бетулон вводится в химический синтез без предварительной очистки смеси продуктов биотрансформации, что позволяет оптимизировать и сделать более технологичным синтез целевого продукта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В качестве стартового соединения для получения фармакологически активных соединений широко используется доступный растительный тритерпеноид бетулин, окисленные производные которого проявляют противовоспалительную, гепапротекторную, противоопухолевую, противовирусную активность (Tolstikov et al., 2005;

Alakurtti et al., 2006;

Santos et al., 2009). В настоящее время предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов. Примеры по биотрансформации бетулина пока немногочисленны и связаны преимущественно с использованием эукариотных организмов, в частности представителей грибов, принадлежащих к родам Armillaria, Aspergillus, Chaetomium, Cunninghamella, Dothideomycete, Microsporum, Rhodotorula, Trichophyton. При этом большинство исследованных культур катализируют окисление первичной гидроксильной группы бетулина с образованием бетулиновой кислоты (Chen et al., 2009;

Liu et al., 2010;

Fu et al., 2011;

Feng et al., 2013;

Qazi et al., 2013). Лишь недавно появились сведения о региоселективном окислении бетулина до бетулона с использованием Rhodotorula mucilaginosa F10 (Mao et al., 2012) и Dothideomycete sp. HQ 316564 (Liu et al., 2013). Однако описанные процессы биотрансформации бетулина в бетулон растущими клетками грибов и дрожжей характеризуются значительными недостатками, как то: использованием бетулина в низких (0,1 и 0,057 г/л) концентрациях, высокой продолжительностью (до 144 ч) процесса биотрансформации, образованием побочных метаболитов.

Одной из активно разрабатываемых групп прокариотных микроорганизмов в промышленной биотехнологии являются непатогенные актинобактерии рода обладающие явными технологическими преимуществами и Rhodococcus, уникальным биокаталитическим потенциалом. Показана способность родокококков к направленному окислению органических соединений различной структуры, в том числе нитрилов, арилалкильных сульфидов, азотсодержащих гетероциклических соединений, растительных стеролов, стероидов, ациклических и полициклических терпеноидов (Warhurst, Fewson, 1994;

Bunch, 1998;

de Carvalho, da Fonseca, 2006;

Донова, 2010). Тем не менее, в настоящее время практически отсутствуют научные публикации, касающиеся биотрансформации пентацикличексих тритерпеноидов с использованием родококков.

На основе биоресурсов Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов впервые показана способность актинобактерий рода Rhodococcus к биотрансформации растительного пентациклического тритерпеноида лупанового ряда бетулина. С целью повышения эффективности процесса биотрансформации бетулина были апробированы различные приемы:

(1) периодическое аэробное культивирование бактерий, (2) введение в среду ферментации дополнительных энергетических субстратов (глюкозы, глицерина, н-гексадекана), (3) иммобилизация бактериальных клеток в матрицу криогеля на основе ПВС, (4) применение суспензий нерастущих клеток, описанных в литературе как: “resting cells, выживающих при перенесении в голодные буферные среды” (Kim et al. 2007;

Marchand et al. 2008).

В результате оценки бетулинтрансформирующей активности коллекционных культур родококков разных видов отобран штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66, эффективно катализирующий образование бетулона. Максимальный (свыше 70%) уровень биоконверсии бетулина (0,5 г/л) регистрируется в присутствии 3,0 об.% н-гексадекана в течение 240 ч. Существенное сокращение (до 24 ч) длительности процесса биотрансформации бетулина достигается при использовании нерастущих клеток. Оптимальными условиями трансформации бетулина нерастущими клетками являются предварительное выращивание родококков в богатой питательной среде (МПБ), слабощелочная реакция среды (рН 8,0–9,0) и использование клеточной биомассы в количестве 10 г/л. При этом уровень конверсии бетулина составляет 60%. В условиях повышенных концентраций бетулина (1,0–3,0 г/л) нерастущие клетки катализируют образование бетулона с выходом от 40 до 57%. Следует отметить, что в процессе биотрансформации бетулина в бетулон с применением растущих клеток грибов Dothideomycete sp. HQ 316564 или дрожжей R. mucilaginosa F10 биоконверсия бетулина не превышала 43,4 и 52,65% соответственно при использовании значительно меньших (в 30 и 50 раз) концентраций субстрата.

Разработанная математическая модель позволяет адекватно прогнозировать продолжительность процесса биотрансформации бетулина и возможный выход целевого продукта в зависимости от исходной концентрации бетулина. В экспериментах с использованием различных клеточных фракций родококков подтверждена прочная связь ферментов, катализирующих региоселективное окисление бетулина, с клеточной мембраной родококков. С использованием методов микроскопического анализа выявлена тенденция к агрегации клеток с бетулином и формированию клеточных агломератов. По-видимому, нахождение клеток в составе агломератов позволяет популяции адаптироваться к условиям, при которых одиночные клетки не способны к превращению бетулина.

Использование атомно-силовой микроскопии позволило определить истинно трехмерный рельеф поверхности клеток родококков и исследовать особенности структуры поверхности бактерий при взаимодействии их с бетулином. Показано, что окислительная биотрансформация бетулина протекает благодаря адгезии актинобактериальных клеток к тритерпеновому субстрату.

По результатам проведенных исследований предложен новый подход к синтезу 3,4-секобетулина, основанный на использовании процесса предварительного окисления бетулина нерастущими клетками R. rhodochrous ИЭГМ 66 до бетулона и последующей его химической модификации в 3,4 секопроизводное, перспективного в качестве противоопухолевого агента.

Использование бетулона в качестве ключевого интермедиата в химическом синтезе функционализированных производных (А-секопроизводных и гетероциклических, в частности) бетулина позволит расширить спектр новых тритерпеновых соединений с ценной биологической активностью.



Pages:     | 1 || 3 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.