авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |
-- [ Страница 1 ] --

ФГБУ «Московский научно-исследовательский

онкологический институт им.П.А.Герцена» Минздрава России

На правах рукописи

КАРМАКОВА Татьяна Анатольевна

МУЦИН MUC1 КАК БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАРКЕР

В МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

/14.01.12 – Онкология/

Диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Научные консультанты:

профессор, д.б.н. Р.И.Якубовская академик РАМН, профессор, д.м.н. Г.А.Франк Москва 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………. 5 РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………..………. 1.Общая характеристика муцинов …………………………………….…… 2. Муцин MUC1 (строение молекулы, синтез в клетке, полиморфизм) … 3. Моноклональные антитела к MUC1 ………………………………..…… 4. Экспрессия и функциональная роль MUC1 в норме ……….……….…. 5. Экспрессия и патофизиологическая роль MUC1 при злокачественных новообразованиях эпителия …………………………………………...…... 6. MUC1 при предопухолевых изменениях эпителия ……………..…...… 7. Циркулирующий в крови MUC1 ……………..……………………….… 8. MUC1 как мишень для терапии злокачественных опухолей …….….… 9. Анти-MUC1 моноклональное антитело ИКО25 …………….…………. РАЗДЕЛ II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ………………………….…… 1. Объекты исследования ……………………………………….…….……. 2. Реактивы, реагенты и лабораторные материалы ………………….…… 3. Препаративные и аналитические методы исследований …………...….. 3.1. Методы получения антигена и антител ……………..……..… 3.2. Аналитические методы ………………….……………..…….….... 3.3. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) …………………... 3.4. Методы иммуногисто- и иммуноцитохимического анализа ….... 3.5. Проточная цитофлуориметрия ……………………………..…….. 3.6. Методы исследования 5-АЛК-индуцированной флуоресценции протопорфирина IX (ППIX) в цитологических препаратах ……….... 4. Клинический материал, пациенты и дизайн клинико экспериментальных исследований …………………………………..….... 4.1. Характеристика образцов тканей молочной железы …………... 4.2. Характеристика образцов тканей легкого …………….……..… 4.3. Иммуноцитохимическое исследование бронхиального эпителия 4.4. Иммуноцитохимическое исследование цервикального эпителия 4.5. Серологические исследования ………….……………………….. 5. Методы статистического анализа ………………………………….. РАЗДЕЛ III. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ………………………. ГЛАВА 1. Характеристика моноклонального антитела ИКО25 ……. 1.1. Экспрессия MUC1/ИКО25 в нормальных тканях человека ….…….... 1.2. Экспрессия MUC1/ИКО25 в тканях злокачественных опухолей человека ……………………………………………………………………....

1.3. MUC1/ИКО25 при доброкачественных и злокачественных изменениях эпителия молочной железы ………………………………..…. 1.4. Сравнительная характеристика экспрессии различных по гликозилированию форм MUC1 в нормальных и опухолевых тканях человека ………………………………………………………………..……. 1.5. ОБСУЖДЕНИЕ ……………………..…………………………..…..….. ГЛАВА 2. Экспрессия MUC1 в бронхиальном эпителии при раке легкого ……………………………………………………………………….



2.1. MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии при плоскоклеточном раке легкого (гистологическое исследование) ……………………..……..…..… 2.2. MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии при плоскоклеточном раке легкого (цитологическое исследование) …………………..………..…..… 2.2.1. Отработка методики оценки экспрессии MUC1/ИКО25 в цитологических препаратах бронхиального эпителия …….…...….. 2.2.2. MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии при неопухолевых заболеваниях легких и у онкологических больных ……………….… 2.2.3. Экспрессия MUC1/ИКО25 и 5-АЛК-индуцированный протопорфирин IX в клетках бронхиального эпителия..…………… 2.2.4. MUС1/ИКО25 в бронхиальном эпителии у больных раком легкого после специфического лечения ……….…………………….. 2.2.5. Алгоритм исследования экспрессии MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии в комплексном обследовании больных раком легкого после специфического лечения …………..…..……… 2.3. ОБСУЖДЕНИЕ ………………………………………….…….……….. ГЛАВА 3. Экспрессия MUC1 при предопухолевых изменениях в эпителии шейки матки - цитологическое исследование ………….… 3.1. MUC1/ИКО25 в цервикальном эпителии в норме, при воспалительных и фоновых заболеваниях шейки матки ………….….….. 3.2. MUC1/ИКО25 в клетках цервикального эпителия при начальном раке шейки матки и интраэпителиальной неоплазии шейки матки …….. 3.3. Экспрессия MUС1/ИКО25 в цервикальном эпителии после органосохраняющего лечения интраэпителиальной неоплазиии шейки матки ……………………………………………………………………...…..

3.4. ИКО25+ дискератоцит-подобные клетки в цервикальном эпителии и папилломавирусная инфекция …………..…………………………………. 3.5 ОБСУЖДЕНИЕ ……………………………………………………..…... ГЛАВА 4. Серологические исследования MUС1/ИКО25 ……….…… 4.1. Разработка тест-системы для определения содержания MUC1/ИКО25 в сыворотке крови человека ………...………………..…... 4.2. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при раке молочной железы.......... 4.3. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при первичном раке легкого ……. 4.3.1. Характеристика общей группы наблюдений ………………….. 4.3.2. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при аденокарциноме легкого ……………………………………………………………….…. 4.3.3. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при плоскоклеточном раке легкого …………………………………………………………………. 4.3.4. Повышенный уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови как серологический маркер аденокарциномы при первичном раке легкого ………………………………………………………………….. 4.3.5. МUC1/ИКО25 в сыворотке крови больных НМРЛ до и после хирургической операции ………………………………………………. 4.4. MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при раке желудка ……….……….. 4.4.1. Характеристика общей группы наблюдений ………………….. 4.4.2. MUC1/ИКО25 и послеоперационная пневмония у больных злокачественными опухолями органов верхних отделов желудочно кишечного тракта …………………….....…………………………….. 4.6. ОБСУЖДЕНИЕ ……………………..…………………………..……... ВЫВОДЫ …………………………..…………………………….…….…… ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ……………….………..….…... Список сокращений и условных обозначений ………………..….……. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ………………………………….……….……. ВВЕДЕНИЕ Исследования в области молекулярной биологии значительно расширили существующие представления о сложных биологических процессах, лежащих в основе возникновения и прогрессии злокачественных опухолей. Современный уровень развития биотехнологии и генной инженерии создает предпосылки для расшифровки тонких механизмов канцерогенеза, разработки высокочувствительных и специфичных методов скрининга, диагностики новообразований, а также новых эффективных способов лечения онкологических больных.





К настоящему времени описано множество биологических маркеров, определение которых в клетках, тканях или жидкостях организма может способствовать выявлению злокачественной опухоли, служить индикатором ее биологических особенностей или распространенности заболевания [1-3].

В этом отношении высокомолекулярный гликопротеин, мембранно связанный муцин MUC1 на протяжении многих лет привлекает к себе особое внимание исследователей.

В норме в организме человека MUC1 преимущественно экспрессируется клетками однослойного эпителия, локализуется на апикальной поверхности клеток и входит в состав молекулярной системы, которая способствует устойчивости эпителиального барьера при инфекционном поражении [4-6].

В эпителиальных злокачественных опухолях обнаруживают повышенную, по сравнению с нормальным эпителием, экспрессию MUC1, изменение его внутриклеточной локализации и увеличение содержания гипогликозилированных форм гликопротеина [7]. MUС1, представленный на поверхностной мембране опухолевых клеток, рассматривают как идеальную мишень для таргетной терапии [8 - 11]. Способность MUC1 инициировать реакции Т-клеточного и гуморального иммунитета стимулирует создание различных MUC1-содержащих противоопухолевых вакцин [12 - 16].

По данным клинико-морфологических исследований, при раке молочной железы (РМЖ) [17 - 19], раке легкого [20, 21], раке желудка [22 25], а также при эпителиальных злокачественных новообразованиях ряда других органов [26 - 29] высокий уровень экспрессии и деполяризованный характер распределения MUС1 в клетках опухоли коррелируют с неблагоприятным прогнозом заболевания. Клинические наблюдения подтверждаются результатами экспериментальных исследований, которые свидетельствуют о том, что сверхэкспрессия гипогликозилированного MUC и его аномальная внутриклеточная локализация могут способствовать увеличению инвазивного и метастатического потенциала злокачественных клеток [30, 31].

Изменения характера экспрессии MUC1, аналогичные тем, что наблюдаются в ткани инвазивных опухолей, описаны при внутриэпителиальном раке молочной железы [32, 33], поджелудочной железы [34-37], предстательной железы [38] и других органов [39, 40]. Эти наблюдения дают основание предполагать взаимосвязь между особенностями экспрессии MUC1 в клетках эпителия и развитием предопухолевых нарушений. Однако на фоне активного и всестороннего изучения MUC1 при злокачественных новообразованиях сведения о характере его экспрессии при ранних неопластических изменениях в эпителии немногочисленны.

Физиологическая роль MUC1 как фактора защиты эпителия от инвазии патогенных микроорганизмов, в сочетании с его характеристикой как опухоль-ассоциированного антигена, вызывает особый интерес в свете известных онкогенных свойств некоторых вирусов [41, 42]. При этом публикации, посвященные, в частности, изучению муцинов при неоплазии эпителия шейки матки, для которой доказана этиологическая связь с папилломавирусной инфекцией, не рассматривают возможных особенностей экспрессии MUC1, обусловленных вирусным поражением [29, 43-48].

Увеличение содержания MUC1 в циркулирующей крови обнаруживают при РМЖ, раке легкого, яичников, печени, поджелудочной железы, а также при ряде новообразований гемопоэтической ткани [49-53]. Мониторинг сывороточного уровня MUC1 (CA15-3, CA27.29) у больных метастатическим РМЖ, в сочетании с оценкой клинических факторов и результатов других диагностических тестов, в настоящее время рекомендован Американским обществом клинической онкологии (ASCO) и Европейской группой по опухолевым маркерам (EGTM) для контроля эффективности консервативного лечения [3, 54]. По данным последних лет, повышенный дооперационный сывороточный уровень CA15-3 при местно распространенном РМЖ достоверно коррелирует с коротким безрецидивным периодом и меньшей выживаемостью больных [55-61].

Повышенное содержание MUC1 в сыворотке крови до начала лечения ассоциировано с неблагоприятным клиническим прогнозом у больных аденокарциномой легкого [21, 62, 63] и коррелирует с низкой эффективностью терапии у больных немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), получающих лечение ингибиторами эпидермального фактора роста [64-67]. При этом данные о сывороточном уровне MUC1 у первичных больных НМРЛ на сегодняшний день ограничены. Целенаправленные исследования содержания MUС1 в сыворотке крови при раке желудка в опубликованной литературе не представлены.

Основным способом определения MUC1 в тканях и биологических жидкостях в клинических исследованиях являются методы иммунохимического анализа. Оценка корреляции между характеристиками онкологического заболевания и особенностями экспрессии MUC1 в опухолевых клетках или его содержанием в сыворотке крови пациентов зависит от локализации и гистологического типа опухоли, а также от природы и эпитопной специфичности используемых антител [17, 20, 21, 26 29, 32, 68, 69]. Последнее обстоятельство связано с тем, что MUC отличается изменчивостью по количеству и набору потенциальных антигенных детерминант. С одной стороны, это обусловлено генетическим полиморфизмом, свойственным муциноподобным гликопротеинам, с другой стороны, вариабельностью гликозилирования MUC1 в клетках эпителия, как в норме, так и при патологических нарушениях [70]. Структурное разнообразие MUC1 служит основанием для постоянного поиска моноклональных антител, узнающих фенотипические варианты антигена, наиболее информативные для уточняющей диагностики, мониторинга или прогноза онкологического заболевания.

Таким образом, MUC1, как объект исследования, представляет интерес для понимания биологии злокачественных новообразований эпителия и предшествующих их развитию фоновых процессов, а также для совершенствования методов уточняющей диагностики и прогноза при онкологическом заболевании. Многие аспекты потенциальной роли MUC1 в возникновении и прогрессии злокачественных опухолей, а также возможность непосредственного практического приложения накопленных экспериментальных и клинических данных, на сегодняшний день остаются изученными недостаточно.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью работы являлась оценка значимости муцина MUC1 как биологического маркера при эпителиальных злокачественных опухолях и изучение аспектов его возможного применения в морфологических и серологических исследованиях у онкологических больных.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать оригинальное анти-MUC1 моноклональное антитело (МКА) ИКО25 по эпитопной специфичности, взаимодействию с нормальными тканями человека и тканями злокачественных опухолей различного гистогенеза и локализации.

2. Исследовать экспрессию MUC1, узнаваемого ИКО25 (MUC1/ИКО25), а также различных по гликозилированию форм MUC1 в ткани молочной железы при доброкачественных заболеваниях, предопухолевых изменениях и злокачественных опухолях методами иммуногистохимического анализа.

3. Охарактеризовать особенности экспрессии MUC1/ИКО25 в нормальном бронхиальном эпителии, при реактивных и предопухолевых изменениях бронхиального эпителия и при плоскоклеточном раке легкого методами иммуногистохимического и иммуноцитохимического анализа.

4. Изучить возможность использования MUC1/ИКО25 в цитологических исследованиях как биологического маркера патологических нарушений бронхиального эпителия.

5. Методами иммуноцитохимического анализа исследовать особенности экспрессии MUC1/ИКО25 при предопухолевых изменениях в эпителии шейки матки, в том числе, в аспекте вирус-ассоциированной этиологии заболевания.

6. Разработать тест-систему для количественного определения MUC1 в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа на основе ИКО25 и апробировать ее на клиническом материале.

7. Исследовать уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови при первичном немелкоклеточном раке легкого и первичном раке желудка, провести анализ клинико-лабораторных данных и оценить информативность сывороточного уровня MUC1/ИКО25 как серологического маркера у данных больных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ С использованием оригинального моноклонального антитела ИКО25, полученного к высокомолекулярному гликопротеиду мембран жировых глобул женского молока, впервые детально охарактеризована экспрессия гипогликозилированного MUC1 (MUC1/ИКО25) в бронхиальном эпителии в норме, при реактивных изменениях и предопухолевых нарушениях.

На основании данных, полученных при мониторинге больных раком легкого, впервые установлено, что аномальная экспрессия MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии является патогенетическим маркером скрытых предопухолевых изменений, характеризующихся высокой вероятностью прогрессии до плоскоклеточного рака. Показана целесообразность определения характера экспрессии MUC1/ИКО25 в бронхиальном эпителии у больных плоскоклеточным раком легкого в целях раннего выявления рецидива опухоли и прогноза развития первично-множественного центрального рака.

На цитологическом уровне исследования впервые выявлена корреляция между особенностями экспрессии MUC1/ИКО25 в клетках цервикального эпителия, цитологическими признаками, патогномоничными для инфекции вирусом папилломы человека (ВПЧ), и положительным результатом определения ДНК ВПЧ высокого канцерогенного риска. Полученные данные свидетельствуют о возможном вирус-ассоциированном характере изменений экспрессии MUC1 в клетках эпителия шейки матки.

На основе ИКО25 разработана оригинальная тест-система для количественного определения MUC1 в сыворотке крови человека методом твердофазного ингибиторного иммуноферментного анализа.

Охарактеризована значимость MUC1/ИКО25 как серологического маркера для уточняющей диагностики у первичных больных немелкоклеточным раком легкого при различной гистологической и клинико-анатомической форме опухоли, а также в зависимости от возраста пациентов.

Впервые показано, что низкое относительно среднестатистических значений показателя в норме содержание MUC1 в сыворотке крови при первичном раке желудка ассоциировано с бльшей распространенностью опухолевого процесса. Установлена корреляция между низким дооперационным сывороточным уровнем MUC1 и развитием послеоперационной пневмонии у больных злокачественными опухолями органов верхних отделов желудочно-кишечного тракта, что указывает на возможную клиническую значимость уровня циркулирующего MUC1 как показателя состоятельности местной системы резистентности в ткани легкого.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ Выявленные особенности экспрессии MUC1/ИКО25 в эпителии молочной железы, бронхов и шейки матки являются основой для дальнейшего изучения MUC1 как иммуногистохимического маркера в клинических исследованиях, направленных на определение показаний к проведению органосохраняющего лечения и оценку его эффективности.

Разработан метод оценки характера экспрессии MUC1/ИКО25 в цитологических образцах бронхиального эпителия, который может быть использован в дополнение к комплексному обследованию и при активном мониторинге больных плоскоклеточным раком легкого после специализированного лечения, в целях прогноза и раннего выявления местного рецидива заболевания. Предложен алгоритм оценки результатов иммуноцитохимического исследования бронхиальных мазков-скарификатов, который позволяет оптимизировать схему включения данного теста в программу планового обследования индивидуальных больных. Метод может быть использован в лечебных учреждениях онкологического и пульмонологического профиля, оснащенных бронхофиброскопической аппаратурой, при поддержке лабораторных подразделений. Применение данного подхода перспективно при формировании групп повышенного риска в целях ранней диагностики центрального рака при обследовании больных хроническими неспецифическими заболеваниями легких.

Результаты, полученные при исследовании содержания MUC1/ИКО в сыворотке крови онкологических больных, являются предпосылкой для углубленного клинического изучения MUC1 как серологического маркера при первичном раке легкого, а также в клинических группах больных, характеризующихся повышенным риском развития послеоперационных инфекционно-воспалительных легочных осложнений. Высокий уровень корреляции между сывороточным уровнем MUС1/ИКО25 и СА15-3 делает возможным использование в этих целях существующих коммерческих диагностических наборов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Изменения в характере экспрессии MUC1, отличающие клетки нормального эпителия и клетки злокачественных эпителиальных опухолей повышенный уровень экспрессии антигена и его деполяризованное внутриклеточное распределение, в эпителии молочной железы, бронхиальном эпителии и эпителии шейки матки возникают на этапе предопухолевых нарушений до появления морфологических признаков злокачественности.

2. Аномальная для бронхиального эпителия в норме экспрессия гипогликозилированного MUC1 (MUC1/ИКО25) в клетках метаплазированного плоского эпителия и резервных клетках пролиферирующего цилиндрического эпителия является патогенетическим маркером ранних предопухолевых нарушений, характеризующихся высоким риском прогрессии до плоскоклеточного рака.

3. Определение характера экспрессии MUC1/ИКО25 в цитологических образцах бронхиального эпителия в комплексе с бронхоскопическим исследованием позволяет формировать группу риска развития первично множественного центрального плоскоклеточного рака и местного рецидива заболевания после хирургического и/или эндоскопического лечения у больных плоскоклеточным раком легкого.

4. Высокая экспрессия MUC1/ИКО25 в дискератоцитах, патогномоничных для папилломавирусной инфекции, корреляция между MUC1-положительными дискератоцитами и инфекцией вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска, а также высокий уровень экспрессии антигена в атипических клетках при цервикальной интраэпителиальной неоплазии косвенно указывают на вирус ассоциированный характер изменений экспрессии MUC1 в эпителии шейки матки.

5. При первичной аденокарциноме легкого увеличение уровня MUC1/ИКО25 в сыворотке крови коррелирует со стадией заболевания.

Значимость повышенного сывороточного уровня MUC1/ИКО25 при раке легкого как серологического маркера для уточняющей диагностики зависит от клинико-анатомической локализации новообразования и возраста больных.

6. При первичном раке желудка с распространенной стадией заболевания коррелирует низкий (относительно среднестатистических значений показателя в норме) сывороточный уровень MUC1/ИКО25. Низкий дооперационный уровень MUC1/ИКО25 в сыворотке крови у больных раком желудка и раком пищевода является независимым фактором риска развития послеоперационной пневмонии.

АПРОБАЦИЯ НАУЧНЫХ ПОЛОЖЕНИЙ Основные результаты исследований доложены на Всесоюзной конференции «Современные направления создания медицинских диагностикумов» (Москва, 1990);

Втором Всесоюзном конгрессе по болезням органов дыхания (Челябинск, 1991);

IV Всероссийском съезде онкологов (Ростов-на-Дону, 1995);

III Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 1996);

8th International Congress on Anti-Cancer Treatment (Paris, 1998);

10th NCI-EORTC Symposium on New Drugs in cancer therapy (Amsterdam, 1998);

9th International Congress on Anti-cancer Treatment (Paris, 1999);

Первой Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (Москва, 2002);

V съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Санкт-Петербург, 2003);

XIII World Congress for Bronchology (Barselona, Spain, 2004);

Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005;

2006;

2007;

2009;

) III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006);

VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007);

35th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM (Prague, 2007);

25th International Papillomavirus Conference (Malmo, Sweeden. 2009);

Первой Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии» (Москва, 2012);

Втором Конгрессе Евро-Азиатской ассоциации дерматовенерологов, ЕААД (Москва, 2012);

Второй Всероссийской конференции. «Актуальные вопросы фотодинамической терапии и фотодиагностики» (Москва, 2013);

Научно практическом симпозиуме «Новые медицинские технологии в эндоскопической диагностике и лечении раннего рака желудка и раннего центрального рака легкого» (Москва, 2013);

15th World Conference on Lung Cancer (Sydney, Australia, 2013);

VIII Всероссийском съезде онкологов (Санкт-Петербург, 2013).

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ По материалам диссертации опубликованы 44 печатные работы.

Публикации включают: 14 статей в рецензируемых журналах, 1 статью в сборниках научных трудов, 25 тезисов в материалах научных форумов, патента Российской Федерации.

.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы (Раздел I), описания материалов и методов (Раздел II), Раздела III, содержащего собственные результаты и состоящего из 4-х глав, Выводов и Практических рекомендаций. Материалы диссертации изложены на 368 cтраницах машинописного текста, снабжены 75 таблицами и 81 рисунком.

Библиографический указатель включает 510 источников (35 отечественных, 475 зарубежных).

РАЗДЕЛ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Общая характеристика муцинов Муцины - высокомолекулярные гликопротеины, структура которых характеризуются определенными особенностями, а именно, множественными повторами аминокислотных последовательностей в пептидном коре молекулы (Variable Number of Tandem Repeats, VNTR) и высокой плотностью олигосахаридов, присоединенных к молекуле белка О гликозидной связью. В организме человека и других млекопитающих муцины продуцируются клетками эпителия органов дыхания, желудочно кишечного тракта и репродуктивной системы, а также эндотелием, клетками лимфоидной и кроветворной систем.

На сегодняшний день описано 20 представителей семейства муцинов, которые кодируются независимыми генами (табл. 1 и 2). Среди них выделяют два основных подкласса: мембранно-связанные и гель-образующие муцины [71 - 73].

Гель-образующие муцины продуцируются специализированными клетками эпителия и являются главным компонентом слизи, которая защищает поверхность клеток от механических повреждений, действия протеаз, кислой рН клеточных секретов, препятствует инвазии патогенов, секвестрирует биологически активные молекулы, выделяемые клетками в зоне воспаления или повреждения [72, 74].

Мембранно-связанные муцины имеют в своем составе аминокислотную последовательность, богатую остатками гидрофобных аминокислот, которая позволяет молекуле удерживаться в плазматической мембране.

Внеклеточный домен мембранно-связанных муцинов, представляющий собой длинную гликозилированную полипептидную цепь, располагается над поверхностью клеток и входит в состав гликокаликса. Он обуславливает антиадгезивные и проадгезивные свойства поверхностной мембраны.

Короткий внутриклеточный домен мембранно-связанных муцинов (cytoplasmic tail, CT) располагается в цитоплазме. Для некоторых, наиболее хорошо изученных представителей данного подкласса (MUC1 и MUC4) показано, что посредством CT-домена они способны участвовать в передаче внутриклеточных молекулярных сигналов [7, 31, 75].

Таблица Характеристика мембранно-связанных муцинов муцинов (по Williams O.W. et al. [73]) * Хромосомный Ген Распределение в тканях локус Роговица глаз, слюнные железы, пищевод, желудок, поджелудочная железа, толстый кишечник, двенадцатиперстная кишка, желчный пузырь, легкое, 1q MUC молочная железа, предстательная железа, яичники, почки, матка, шейка матки, дендритные клетки, клетки предшественники костного мозга 7q22 Тимус, тонкий кишечник, толстый кишечник, почки MUC Роговица глаз, молочная железа, слюнные железы, 3q MUC пищевод, тонкий кишечник, почки, эндоцервикс Среднее ухо, тимус, легкое, тонкий кишечник, 7q22 поджелудочная железа, толстый кишечник, печень, почки, MUC матка, предстательная железа Среднее ухо, поджелудочная железа, толстый кишечник, 7q MUC матка, предстательная железа Коньюктива, желудок, тонкий кишечник, толстый 3q MUC кишечник, легкое, почки, 4q24 Эндотелий MUC Коньюктива, миндалины, тимус, лимфатические узлы, молочная железа, тонкий кишечник, толстый кишечник, 11q14 печень, селезенка, легкое, предстательная железа, MUC семенники, яичники, лейкоциты, клетки костного мозга, лейкоциты периферической крови 19q13.2 Коньюктива, яичники MUC 7q22 Тонкий кишечник, коньюктива MUC 11q23.3 Предстательная железа MUC Легкое, печень, почки, толстый кишечник, плацента, 3q MUC предстательная железа Примечания. *дополнена данными последующих публикаций.

Таблица Характеристика гель-образующих и других муцинов муцинов (по Williams O.W. et al. [73]) Хромосомный Ген Распределение в тканях локус Коньюктива, среднее ухо, желудок, тонкий кишечник, 11р15 толстый кишечник, эпителий назофарингеальной зоны, MUC легкое, предстательная железа Коньюктива, среднее ухо, желудок, желчный пузырь, MUC 11р эпителий назофарингеальной зоны, легкое AC Среднее ухо, подъязычные слюнные железы, гортань, 11р15 пищевод, желудок, двенадцатиперстная кишка, желчный MUC5B пузырь, эпителий назофарингеальной зоны, легкое Желудок, двенадцатиперстная кишка, желчный пузырь, 11р MUC поджелудочная железа, почки Cлюнные железы, легкое, почки, печень, толстый 12q MUC кишечник, плацента, предстательная железа Другие муцины* 4q13-21 Слезные железы, слюнные железы, легкое MUC 12q24.3 Эпителий носовых ходов, легкое MUC 1р13 Эпителий фаллопиевых труб MUC Примечания. * нет однозначных данных в отношении особенностей продукции клетками.

Нарушения продукции муцинов у человека связаны с заболеваниями органов дыхания – бронхиальной астмой [76], муковисцидозом [77], хроническими воспалительными и обструктивными заболеваниями легких [78 79];

хроническими воспалительными заболеваниями желудка и толстого кишечника [80 - 82];

офтальмологическими заболеваниями (синдром сухого глаза) [83];

нарушениями процессов имплантации эмбриона [84].

Однако наибольший интерес исследователей со времени выделения муцинов как самостоятельного класса привлекает роль этих гликопротеинов при заболевании злокачественными опухолями [7, 74, 85 - 88].

2. Муцин MUC MUC1 относится к подклассу мембранно-связанных муцинов и является первым идентифицированным представителем этой группы [89]. В норме MUC1 преимущественно экспрессируется клетками однослойного эпителия и присутствует практически во всех органах человека (см.табл.1.1).

[73, 90]. В дифференцированных клетках MUC1 локализуется на апикальной поверхности клеток, в свободной форме - входит в состав секреторной жидкости. В секрете лактирующей молочной железы MUC1 содержится в мембранах жировых глобул, которые являются фрагментами апикальной мембраны секреторных клеток [90, 91].

Строение молекулы и синтез в клетке Пептид MUC1 кодируется геном, который расположен в 21-ом локусе длинного плеча 1-й хромосомы [92 - 94]. В процессе трансляции пептидный кор MUC1 синтезируется в виде линейной молекулы (рис.1), затем в эндоплазматическом ретикулуме происходит его протеолитическое расщепление c образованием стабильного гетеродимерного комплекса, состоящего из большой (MUC1) и малой (MUC1) субъединиц [31, 95].

Далее в аппарате Гольджи происходит гликозилирование MUC1, после чего гетеродимер транспортируется к поверхности клетки и встраивается в плазматическую мембрану (рис. 2).

-cубъединица -cубъединица (MUC1) (MUC1) Уникальная последовательность Сайт протеолитического расщепления Сигнальная последовательность Трансмембранный домен VNTR-домен SEA домен Цитоплазматический домен (CT) Рис.1. Схематическое изображение структуры полипептидной цепи MUC (по Hollingsworth M.A. and Swanson B.J. [74]).

Субъединица MUC1, содержащая VNTR-регион, формирует внеклеточный домен. Количество VNTR-повторов в структуре MUC колеблется от 20 до 120 [96]. Каждый VNTR-повтор состоит из специфической для MUC1 последовательности из 20 остатков аминокислот (AHGVTSAPDTRPAPGSTAPP) и содержит 5 сайтов О-гликозилирования.

Молекулярная масса MUC1 может составлять от 300 до 600 кДа и зависит от длины MUC1 и степени ее гликозилирования [70, 97, 98].

MUC GST AP PA H G V VNTR-повтор T S A DP RT AP P MUC Плазматическая мембрана Цитоплазматический домен (СТ) Рис.2. Схематическое строение молекулы MUC1 (по Kim K.C. et al., 2008) [99]. Сайты гликозилирования указаны зеленым цветом.

Степень гликозилирования MUC1 варьирует в широких пределах. Доля сайтов, занятых О-связанными олигосахаридами (О-гликанами), может колебаться от 50% до 100%. В состав части углеводов входят остатки сиаловых кислот [100]. Большое количество олигосахаридов, прикрепленных на всем протяжении пептидной цепочки MUC1, придает линейной молекуле жесткость, в результате чего она на сотни нанометров выступает над поверхностью клеток. О-связанные олигосахариды в составе MUC1 обуславливают стехиометрические особенности поверхностного слоя, связывают различные малые молекулы и протеины, что влияет на анти адгезивные и проадгезивные свойства клеточной поверхности [ 7, 89, 101].

Под действием протеолитических ферментов MUC1 может освобождаться из состава гетеродимера и сбрасываться с поверхности клетки, образуя пул растворимого муцина.

Малая субъединица MUC1 включает короткую последовательность аминокислот, участвующую в формировании нековалентных взаимодействий с MUC1, гидрофобную последовательность, которая образует трансмембранный домен и цитоплазматический СТ-домен (MUC1-CT). В структуре MUC1-CT имеются участки, содержащие аминокислоты, которые фосфорилируются различными киназами, а также сайты связывания с целым рядом внутриклеточных белков:

-катенином, -катенином, белком р53, белками теплового шока – HSP70 и HSP90 (рис.3) [102].

Трансмембраный домен Плазматическая мембрана ZAP- PI3K C-Src GSK3 Shc - катенин PDGFR c-Src EGFR PKC Lck PDGFR- PLC Lyn Grb-2 Цитоплазматический домен Рис.3. Схематическое строение цитоплазматического домена MUC (MUC1-CT). В составе аминокислотной последовательности стрелками обозначены участки фосфорилирования для соответствующих киназ (номенклатурные названия киназ указаны аббревиатурами), оранжевым и зеленым цветом обозначены сайты связывания с киназами и -катенином (по Kim K.C. et al., [99]).

Полиморфизм MUC Молекула MUC1 отличается высоким структурным разнообразием, что обусловлено генетическим полиморфизмом, особенностями трансляционных процессов и посттрансляционной модификации муцина.

Так, известны десятки вариантов генетического полиморфизма MUC1 в виде однонуклеотидной замены (single nucleotide polymorphism, SNP).

Вариант SNP rs4072037 (замена нуклеотидов A/G) с высокой частотой, до 30%, встречается в современной популяции человека. Данный вариант полиморфизма является функциональным и определяет количество VNTR регионов в составе MUC1, т.е. длину внеклеточного домена MUC1 [103, 104].

Выпадение фрагментов матричной РНК, кодирующей полипептид муцина, при сплайсинге приводит к образованию различных структурных вариантов молекулы MUC1. Известны изоформы, лишенные большей части MUC1 (MUC1/Y, MUC1/Z, MUC1/TM), секреторная форма MUC1/SEC, лишенная трансмембранного домена, а также полноразмерные сплайсинг варианты (MUC1/A, MUC1/B и др.). Вариабельная экспрессия матричных РНК, соответствующих различным изоформам MUC1, описана в культивируемых опухолевых клетках человека и в тканях - при доброкачественных изменениях эпителия, воспалительных заболеваниях и злокачественных опухолях [105-109] Структурный полиморфизм MUC1 в значительной степени определяется и характером гликозилирования MUC1, который варьирует в зависимости от функциональной специализации клеток, степени их дифференцировки, а также может изменяться под действием физиологических и патологических сигналов [70, 110].

Некоторые из возможных структурных вариантов MUC1 для наглядности схематически изображены на рис.4.

Сочетание всех перечисленных выше факторов является причиной крайне неоднородного состава пула MUC1, который экспрессируется на поверхности клеток и высвобождается во внешнюю среду, как в норме, так и в условиях патологии.

Рис.4. Схематическое изображение некоторых возможных структурных вариантов MUC1, представленного на поверхностной мембране клеток эпителия.

3. Моноклональные антитела к MUC В экспериментальных исследованиях для оценки содержания MUC1 в клетках и тканях часто используются методы, основанные на определении кодирующей его матричной РНК, что, в определенной степени, нивелирует проблему, связанную с высоким структурным разнообразием гликопротеида.

Однако в области клинических исследований основным инструментом для изучения экспрессии MUC1 в тканях и его содержания в биологических жидкостях являются моноклональные антитела (МКА).

Вследствие значительных размеров и сложного состава в структуре MUC1 представлено множество потенциальных антигенных детерминант. К настоящему времени, с использованием антигена из различных источников, в мире получены десятки отличных друг от друга клонов анти-MUC1 МКА.

Подавляющее большинство МКА, которые используются в морфологических и серологических исследованиях взаимодействуют с MUC1. Это обусловлено рядом факторов, среди которых: большая доступность коммерческих анти-MUC1 антител;

значительное количество повторяющихся антигенных эпитопов в составе MUC1, что обеспечивает высокую чувствительность методов иммунохимического анализа;

возможность сопоставить полученные результаты с уровнем циркулирующего MUC1;

возможность использовать МUC1 как мишень для пассивной иммунотерапии и таргетного воздействия с использованием конъюгированных антител.

В последние годы ведутся исследования, направленные на определение преимуществ, которые может дать для клинико-экспериментальных и диагностических исследований применение МКА, направленных к MUC1 CT [111-113].

МКА, полученные к MUC1 до 1996 г., охарактеризованы в рамках международного семинара (4th International Workshop on Monoclonal Antibodies against MUC1, ISOBM TD-4) [114]. Клоны, которые сегодня наиболее широко используются в исследовательских работах, а также входят в состав диагностических наборов, представлены в таблице 3.

Обобщение известных сведений в отношении чувствительности антигенной детерминанты к ферментативной и биохимической обработке позволяет выделить следующие систематические группы анти-MUС1 МКА:

I – антитела, узнающие пептидный эпитоп в составе VNTR, на доступность которого не влияет или слабо влияет степень гликозилирования MUC1;

II – антитела, узнающие пептидный эпитоп в составе VNTR, частично экранированный короткими сиалированными боковыми углеводными цепочками;

III – антитела, узнающие пептидный эпитоп в составе VNTR, конформация которого зависит от присутствия сиалированных олигосахаридов;

Таблица Моноклональные антитела к MUC1.

МКА Чувствительность антигенного эпитопа ISOBM Класс К дегликози- К десиали- К дегликози TD-4 Иммуноген VNTR Ig лированию. рованию лированию in vitro in vitro в тканях #162 IgG1 Рекомбинантный пептид VNTR + 0 0 A 214D #123 IgM МЖГ + +- 0 A BC I #139 IgG1 Муцин из асцитической жидкости человека + + 0 A B27. #172 IgG3 Муцин из мочи человека + 0 В C #169 IgG1 МЖГ + 0 В HMFG- II #124 IgG1 МЖГ + 0 В HMPV #136 IgG1 Клетки метастаза РМЖ + 0 В DF III #122 IgG1 ZR75-1 (клетки культуры РМЖ человека) + + В Ma #138 IgG1 МЖГ + + A BC Дегликозилированный муцин молочной железы #165 IgG1 + + В SM человека #159 IgG2a МЖГ + + A E IV W5-6 (клетки культуры плоскоклеточного рака #143 IgM - ++ C M легкого) + муцин из опухолевого асцита #144 IgG1 Рекомбинантный пептид VNTR + ++ В VU-4-H #148 IgG2b МЖГ - ++ В 115D #145 IgM Ткань РМЖ человека - ++ D 3E1. Муцин из асцита больного аденокарциномой [282] IgG ? +++ н/о KL- легкого с метастазами в печень V [283] ? ? ? +++ н/о MY.1E [284] IgG ? ? +++ н/о PankoMab #154 IgG1 ZR75-1 (клетки культуры РМЖ человека) - ++ A Ma RIP1 (клетки культуры рака поджелудочной [246] IgG ? ++ ? н/о РАМ железы человека).

Примечания – см.следующую стр.

Примечания к табл.3. МКА - моноклональное антитело;

ISOBM TD-4# - шифр по материалам 4th International Workshop on Monoclonal Antibodies against MUC1 [114];

VNTR – способность антител взаимодействовать с рекомбинантным пептидом MUC1.

Чувствительность к дегликозилированию (перйодатное окисление) in vitro: +++ абсолютная;

++ выраженная;

+ умеренная;

+/- слабая;

0 - нечувствителен [117, 118].

Чувствительность к десиалированию: интенсивность взаимодействия МКА с MUC1 при - увеличивается, - снижается, 0 - не изменяется [119].

десиалировании:

Чувствительность к дегликозилированию в тканях (перйодатное окисление): А - Pan MUC1 антитела, антигенная детерминанта в парафиновых срезах выявляется без предварительной обработки ткани;

В – реактивность антител с антигеном в парафиновых срезах зависит от предварительной обработки ткани;

С – углеводные эпитопы;

D – другие особенности [120].

IV – антитела, узнающие комбинированный глико-пептидный эпитоп в составе VNTR, экранированный сиалированными углеводами;

V – антитела, узнающие сиалированный углевод-зависимый эпитоп MUC1, но не взаимодействующие с рекомбинантным VNTR-пептидом MUC1.

Для МКА в группах I, II и III, а также для части МКА в группе IV, известна аминокислотная последовательность VNTR-региона, которая формирует узнаваемый ими антигенный эпитоп [114]. МКА М26, 115D8, 3E1.2 и Ма695 не взаимодействуют с рекомбинантным VNTR-пептидом MUC1 и, предположительно, узнают последовательность вне VNTR-региона либо конформационную детерминанту, пространственная конфигурация которой критическим образом зависит от присутствия олигосахаридов [114].

Как указано выше, структура MUC1, который продуцируется клетками эпителия различных органов в норме и при патологических изменениях, варьирует. Как следствие этого, при использовании различных анти-MUC МКА может отличаться характер окрашивания нормальных и опухолевых тканей [38, 112, 121, 117 - 125] и результат количественного определения антигена в сыворотке крови [126 - 128].

4. Экспрессия и функциональная роль MUC1 в норме Эпителий В норме MUC1 является частью системы высокомолекулярных гликопротеидов, защищающих поверхность клеток от повреждающих факторов внешней среды и инвазии патогенов [129].

Данные исследований на животных свидетельствуют, что экспрессия MUC1 в эпителиальных клетках играет ключевую роль в защите слизистой оболочки при инфекционном поражении. Так, у мышей, нокаутных по гену Muc1 (Muc1-/-), отсутствует резистентность к острой и хронической инфекции желудочно-кишечного тракта, вызываемой Helicobacter pylori [4].

Muc1-/- мыши в большей степени, чем животные с нормальным фенотипом, страдают от инфекции, поражающей репродуктивные пути [130], более тяжело переносят кишечную инфекцию Campylobacter jejuni [5] и инфекцию дыхательных путей, вызываемую Pseudomonas aeruginosa [131].

Эпителиальные клетки в культуре, экспрессирующие MUC1, более устойчивы к трансфекции аденовирусом, чем клетки, не продуцирующие муцин или экспрессирующие его в виде мутантного, гипогликозилированного пептида [132, 133]. Трансфекция респираторного эпителия мышей аденовирусом in vivo неэффективна даже у трансгенных животных, эпителиальные клетки которых экспрессируют рецептор к аденовирусу. Эффективность такой трансфекции значительно улучшалась у мышей с нокаутированным геном MUC1 [134]. В экспериментах in vitro показано, что нативный MUC1, присутствующий в культуральной среде, значительно снижает инфицирующую способность вирусов [135-138].

В эксперименте эпителиальные клетки отвечают на контакт с микроорганизмами повышенной продукцией MUC1. Так, внесение вирусных частиц в культуральную среду приводит к увеличению экспрессии MUC1 в опухолевых и нормальных клетках человека [139-142]. Заражение бактериальными патогенами вызывает увеличение синтеза MUC1 в клетках кишечного и легочного эпителия у животных [5, 6].

Увеличение экспрессии MUC1 в клетках опосредовано действием провоспалительных медиаторов - интерфероном и фактором некроза опухолей [6, 142-144], эластазы нейтрофилов [145], а также активных форм кислорода [146, 147]. В культуре клеток повышению экспрессии белка муцина предшествует активация транскрипционных факторов – NF-B, Sp1, STAT, которые взаимодействуют с промотором гена MUC1, что указывает на существование специфических механизмов регуляции экспрессии MUC1 в клетке [99, 139, 145].

По существующим представлениям, MUC1 способен препятствовать инвазии патогенных микроорганизмов в эпителиальный слой и ограничивать их колонизацию на слизистых оболочках, а также участвует в передаче сигнала о контакте с инфекцией с поверхностной мембраны на внутриклеточные сигнальные системы.

Так, О-связанные олигосахариды в составе MUC1 являются лигандами для белков-адгезинов P.aeruginosa [148, 149], Helicobacter pylori [4], вирусных белков [132, 133]. При взаимодействии MUC1 с микроорганизмами происходит отщепление внеклеточного домена муцина и его сбрасывание вместе с патогеном с поверхности клетки [4, 136, 150, 151].

Фосфорилирование MUC1-CT, индуцированное отщеплением внеклеточного домена, вызывает активацию каскада MAP-киназ [152], регулирующих широкий спектр клеточных реакций, включая процессы пролиферации и дифференцировки. Предполагают, что способность фосфорилированного MUC1-CT взаимодействовать с белком р ингибирует сигналы к программируемой гибели, индуцированные повреждением клетки [5].

На различных экспериментальных моделях показано, что изменение экспрессии MUC1 и опосредованные им эффекты тесным образом связаны с функционированием Toll-подобных рецепторов и активностью транскрипционного фактора NF-B [99, 140, 149, 153, 154]. При этом увеличение экспрессии MUC1 вызывает реципрокное ингибирование нисходящего сигнального каскада системы Toll-подобных рецепторов, что приводит к снижению секреции клетками провоспалительных цитокинов и подавлению избыточной активности острой воспалительной реакции.

Таким образом, совокупный эффект увеличения экспрессии MUC1 в клетках эпителия при инфекционном поражении носит противовоспалительный характер и способствует повышению устойчивости эпителиального барьера.

Структурные вариации MUC1, по-видимому, имеют значение для реализации его защитной функции. Так, у человека генетически детерминированная экспрессия укороченных форм MUC1 (SNP rs4072037, AА вариант генотипа) ассоциирована с подверженностью слизистой оболочки желудка хронической инфекции Helicobacter pylori [155-157]. При остром и хроническом воспалении, вызванном инфекционными агентами, а также под действием провоспалительных цитокинов в клетках эпителия наблюдают выраженные изменения олигосахаридного состава муцинов.

Олигосахариды играют важную роль в механизмах межклеточного распознавания, в том числе, клетками иммунной системы [138]. Считается, что тонкая регуляция гликозилирования поверхностных белков позволяет модулировать свойства клеточной поверхности и отражается на характере внешних лиганд-рецепторных взаимодействий, а неэффективность этой регуляции может определять тяжесть и длительность течения воспалительного процесса [129].

Следует отметить, что клиническая значимость особенностей экспрессии MUC1 в эпителии при инфекционных заболеваниях у человека, за исключением упомянутой выше корреляции между определенными вариантами генетического полиморфизма и уязвимостью слизистой оболочки желудка при инфекции H.pylori, практически не исследована.

Клетки крови Помимо клеток эпителия MUC1 (CD227) экспрессируется на поверхности клеток костного мозга [158], В-лимфоцитов [159], плазматических клеток [53], дендритных клеток [160] и активированных in vitro Т-лимфоцитов [161]. Физиологическая роль, которую играет экспрессия MUC1 на гемопоэтических клетках и лейкоцитах, остается неясной. В экспериментах показано, что MUC1 участвует в регуляции подвижности и адгезии лимфоцитов и дендритных клеток и, возможно, служит связующим звеном между гликокаликсом и сетью актиновых филаментов, входящих в состав цитоскелета [160, 162]. Уровень экспрессии MUC1 на лимфоцитах находится под контролем митогенных стимулов [163]. Предполагают, что экспрессия MUC1 может влиять на регуляторные сигналы, определяющие специфическую активность клеток иммунной системы [164], а также способствует увеличению продолжительности жизни лимфоцитов в кровотоке и в участке воспаления [165].

5. Экспрессия и патофизиологическая роль MUC1 при злокачественных новообразованиях эпителия MUC1 экспрессируется клетками большинства эпителиальных злокачественных опухолей человека: при раке молочной железы (РМЖ), яичников, матки, поджелудочной железы, предстательной железы, легкого и органов верхних дыхательных путей, органов желудочно-кишечного тракта, оро-фарингеальной зоны [166 - 169], а также клетками ряда новообразований гемопоэтической ткани [53, 170].

В отличие от клеток нормального эпителия, в которых экспрессия MUC1 ограничена апикальной мембраной, в клетках эпителиальных злокачественных опухолей часто обнаруживают деполяризованное внутриклеточное распределение антигена по всей поверхностной мембране и накопление MUC1 в цитоплазме [89].

Анализ данных, полученных методами иммуногистохимии, (MUC1+) показывает, что частота MUC1-положительных случаев и распределение антигена в опухолевых клетках зависят от органной локализации, гистологического типа, степени дифференцировки новообразования. Кроме того, относительная доля клеток, окрашенных иммунохимической реакцией в ткани опухоли, варьирует в зависимости от типа МКА, которые используют для анализа.

Клинико-морфологические исследования Рак молочной железы При РМЖ экспрессию MUC1 обнаруживают в подавляющем большинстве случаев (cм. табл.4). Частота случаев с высоким уровнем экспрессии антигена, т.е. в которых интенсивное окрашивание наблюдается более чем в 50% опухолевых клеток, составляет, по данным различных авторов, от 24% до 88%.

Таблица Частота MUC1- положительных (MUC1+) случаев при раке молочной железы (все гистологические формы) Анти-MUC1 Количество Количество MUC1+ случаев, моноклональное исследованных Источник антитело случаев % B27.29 (I) 54 100 [18] HMFG-1 (II) 46 98 [173] С595 (II) 98 73 [174] Ma552 (III) 46 95 [173] DF3 (III) 81 97 [121] SM3 (IV) 68 74 [257] VU-4H5 (IV) 79 77 [121] 1447 91 [19] Ma695 (V) 240 94 [33] 46 98 [173] 140 92 [171] MY.1E12 (V) 46 100 [18] PankoMab (V) 82 95 [121] HMFG-2 (?) 46 92 [173] СТ2 (CT-домен) 98 93 [174] Примечание. Для моноклональных антител в скобках указана систематическая группа по табл.3;

«?» – нет данных для оценки эпитопной специфичности.

В большинстве случаев, независимо от эпитопной специфичности анти-MUC1 МКА, при РМЖ наблюдают цитоплазматическое окрашивание клеток и деполяризованное распределение MUC1 на поверхностной мембране. В части случаев MUC1 преимущественно локализуется по краю просвета протоковоподобных структур (апикально-люминальное распределение), либо имеет место сочетание указанных вариантов распределения. В публикациях, наиболее репрезентативных по количеству наблюдений, доля случаев инфильтративного протокового РМЖ, в которых внутриклеточное распределение MUC1 соответствует деполяризованному, апикально-люминальному или смешанному типу, составляет 62-77%, 4% и 18-27%, соответственно [33, 19].

Деполяризованный цитоплазматический и/или мембранный тип внутриклеточного распределения MUC1 достоверно ассоциирован с большей степенью злокачественности опухоли и меньшей продолжительностью жизни больных [17, 18, 19]. Как самостоятельный показатель экспрессии MUC1 при РМЖ, высокая доля интенсивно окрашенных клеток в ткани опухоли, безотносительно внутриклеточного распределения антигена, не коррелирует с параметрами TNM и экспрессией HER2, но коррелирует с более высокой степенью гистологической дифференцировки опухоли, положительным статусом по рецепторам эстрогенов и более благоприятным клиническим прогнозом [18, 19, 32, 33, 121, 171].

Полное отсутствие экспрессии MUС1 в опухолевых клетках при РМЖ наблюдается в 2-9% случаев, как правило, при анапластическом раке и коррелирует с повышенной экспрессией Ki-67, утратой экспрессии гормональных рецепторов и HER2, коротким безрецидивным периодом заболевания после лечения [19, 32, 33, 172].

Между индивидуальными опухолями наблюдается существенная вариабельность по представленности эпитопов, которые узнаются различными анти-MUC1 МКА [121, 173, 174]. Отличается и характер корреляции между экспрессией некоторых MUC1-ассоциированных эпитопов и клинико-морфологическими параметрами опухоли [18, 121, 175].

Эти особенности служат основанием для постоянного поиска моноклональных антител, узнающих фенотипические варианты антигена, наиболее информативные для уточняющей диагностики, мониторинга или прогноза онкологического заболевания.

Рак легкого При аденокарциноме (АК) легкого экспрессия MUC1 в опухолевых клетках определяется в подавляющем большинстве (80-100%) случаев (табл.5). При ПКР легкого результат иммуногистохимического окрашивания существенным образом зависит от эпитопной специфичности МКА и частота MUC1+ случаев варьирует от 36 до 95% (табл.5). Можно отметить, что частота подобных случаев при ПКР легкого выше при использовании МКА, узнающих независимые или слабо зависимые от гликозилирования антигенные эпитопы в составе MUC1.

Общий уровень экспрессии MUС1 при раке легкого не коррелирует с прогностически значимыми морфологическими особенностями опухоли.

Более того, по данным Awaya Н. с соавт., экспрессия MUC1, который детектируется МКА Ma695, снижается в ряду: атипическая аденоматозная гиперплазия, бронхиолоальвеолярный рак и аденокарцинома легкого, а при раке легкого – снижается с увеличением размера опухоли [176]. Kuemmel A.

с соавт. в прямом сравнительном исследовании выявили, что при НМРЛ легкого высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках MUC1, узнаваемого PankoMab, в отличие от MUC1, узнаваемого МКА Е29 или 214D14, коррелирует с большей продолжительностью жизни больных [117].

Деполяризованное внутриклеточное распределение MUC1 в опухолевых клетках при АК легкого отмечают в 34 – 50% случаев, как правило, в умеренно и низко дифференцированных опухолях, при ПКР легкого – в 48 100% случаев, безотносительно степени гистологической дифференцировки [21, 177 - 179], при аденоплоскоклеточном и крупноклеточном раке легкого – в 100% случаев [21, 178], при бронхиолоальвеолярном раке – в 15% случаев [176].

Таблица Экспрессия MUC1 при раке легкого Гистологический тип опухоли Анти-MUC АК ПКР Другие Источник моноклональное MUC1+, MUC1+, MUC1+, антитело N N N % % % 122 98 99 88 - - [178] 214D4 (I) 39 100 34 95 - - [117] BC3 (I) 13 100 20 90 - - [394] HMPV (II) 56 79 36 39 - - [182] DF3 (III) 47 100 11 100 4 100 [178] 56 79 36 39 - - [182] МА552 (III) - - 42 61 - - [393] Е29 (IV) 39 93 34 60 - - [117] РankoMab (V) 39 66 34 36 - - [117] 37 35 70 47 - - [184] Ma695 (V) - - 42 42 - - [393] 56 79 36 39 - - [182] KL-6 (V) 78 100 16 100 9 100 [21] ? 69 86 51 39 58 74 [20] Примечание. Для моноклональных антител в скобках указана систематическая группа по табл.3;

«?» – в публикации не указан клон анти-MUC1 МКА;

N -количество исследованных случаев, MUC1+ - количество MUC1-положительных случаев (%) Результаты всех опубликованных работ согласуются в том, что деполяризованное распределение MUC1 в опухолевых клетках при НМРЛ ассоциировано с меньшей продолжительностью жизни больных и является фактором неблагоприятного клинического прогноза. По данным одних авторов, эта корреляция наиболее выражена в группе больных аденокарциномой легкого [20, 178, 180] и достоверно прослеживается в случаях, в которых заболевание диагностировано на ранней стадии [20, 181].

По данным других исследований, взаимосвязь между характером экспрессии MUС1 и прогнозом заболевания не зависит от гистологического типа опухоли [21, 182], либо преимущественно наблюдается в группе больных ПКР легкого [177, 183]. Существуют данные, что при раке легкого деполяризованное распределение MUC1 в клетках опухоли ассоциировано с биохимическими показателями и молекулярными факторами, указывающими на гипоксическое состояние ткани [184, 179].

По данным, полученным с использованием большинства МКА, деполяризованный тип внутриклеточного распределения MUC1 при НМРЛ не зависит от гистологической степени злокачественности опухоли и клинико-патологическими параметрами заболевания (TNM). Однако Tanaka S. с соавт., с использованием оригинального МКA KL-6 обнаружили прямую корреляцию деполяризованного распределения антигена в опухолевых клетках как с бльшим размером опухолевого узла, так и с поражением регионарных лимфатических узлов и наличием отдаленных метастазов [21].

Рак шейки матки Исследования, посвященные MUC1 при раке шейки матки, единичны, что позволяет составить только самое общее представление в отношении особенностей его экспрессии при данной локализации злокачественной опухоли. Так, при аденокарциноме и плоскоклеточном раке шейки матки в большинстве исследованных случаев обнаружено повышенное содержание в опухолевой ткани РНК, кодирующей пептид MUC1 [47]. Корреляция между высоким уровнем экспрессии MUC1 и неблагоприятным клиническим прогнозом выявлена при эндоцервикальной муцинозной карциноме [29].

Рак желудка Частота случаев, в которых обнаруживают экспрессию MUС1 при аденокарциноме желудка, по данным разных авторов, составляет от 13% до 100% (табл.6).

Большинство авторов отмечают, что при высоко дифференцированной аденокарциноме желудка экспрессия MUC1 наблюдается чаще, чем при низко дифференцированной гистологической форме опухоли [23, 185, 186], при интестинальном гистологическом типе аденокарциномы - чаще, чем при диффузном типе [23, 186 - 188], при перстневидноклеточном раке желудка реже, чем при других гистологических подтипах аденокарциномы [68, 186, 189]. В то же время, в группах наблюдений, объединяющих одни и те же гистологические варианты рака желудка, частота MUС1-положительных случаев коррелирует с более глубокой инвазией опухоли и с метастазами в лимфатические узлы [22 - 25, 185, 186, 190 - 192], а наличие экспрессии MUC1 в опухоли ассоциировано с неблагоприятным клиническим прогнозом [22, 23, 186, 193, 194].

Таблица Частота MUC1- положительных (MUC1+) случаев при аденокарциноме желудка Анти-MUC Количество Количество моноклональное Источник MUC1+ случаев, % исследованных случаев антитело 73 100 [191] HMFG-1 (II) 136 77 [24] 109 32 [185] DF3 (III) 136 55 [24] 115 74 [193] SM3 (IV) 180 80 [191] VU-4H5 (IV) 76 65 [25] Е29 (IV) 44 66 [22] 136 13 [24] Ma695 (V) 21* 24 [189] MY.1E12 (V) 136 74 [24] HMFG-2 (?) 128 61 [23] ВС1 (?) 46 63 [25] ПКА 257 90 [69] Примечание. Для моноклональных антител в скобках указана систематическая группа по табл.3;

«?» – нет данных для оценки эпитопной специфичности;

ПКА – поликлональные анти-MUC1 антитела;

*все наблюдения – перстневидноклеточный рак желудка В то же время, в ряде других исследований не выявлено достоверных отличий по экспрессии MUC1 между перстневидноклеточным раком и другими типами аденокарциномы желудка [195] или достоверной корреляции между уровнем экспрессии MUC1 и клинико-патологическими параметрами опухоли [68, 188, 191, 195]. Некоторые авторы отмечают снижение частоты MUC1+ случаев с увеличением размера первичной опухоли и степени распространенности опухолевого процесса при раке желудка [69, 196]. Анализ этих данных осложняется отсутствием сведений о природе и специфике анти-MUC1 антител в части этих работ, однако значительные расхождения в оценке корреляции между экспрессией антигена и клинико-морфологическими характеристиками в независимых исследованиях подтверждают значимость выбора антител инструмента для иммуногистохимического анализа.

Другие злокачественные опухоли Данные, свидетельствующие о неблагоприятном клиническом прогнозе при деполяризованном распределении MUC1 в опухолевых клетках, с использованием различных анти-MUC1 МКА получены для широкого спектра злокачественных новообразований, в том числе: при колоректальном раке [197, 198], раке пищевода [199], щитовидной железы [200, 201], эпителиальных опухолях печени [26], раке желчных протоков [28], раке почки [202], карциноме эндометрия [203], плоскоклеточном орофарингеальном раке [27, 204, 205].

По данным ряда исследований, оценка уровня экспрессии и особенностей внутриклеточного распределения MUC1 позволяет дифференцировать некоторые гистологические типы злокачественных новообразований органов мочевыводящих путей [206, 207], печени [26], матки [208, 209], почки [210], тимуса [211], коррелирует со степенью гистологической дифференцировки аденокарциномы толстой кишки [212] и характером патологического процесса при заболевании поджелудочной железы [213 - 215].

Таким образом, данные клинико-морфологических исследований свидетельствуют, что при ряде эпителиальных злокачественных опухолей включение MUC1 в панель иммуногистохимических маркеров может быть полезным для уточняющей морфологической диагностики и оценки прогноза заболевания.


Патофизиологическая роль MUC1 в злокачественных клетках   Биологические механизмы, которые лежат в основе корреляции между особенностями экспрессии MUC1 в злокачественных новообразованиях и клиническими характеристиками заболевания, на протяжении многих лет являются предметом молекулярно-биологических, генетических и модельных экспериментальных исследований.

Накопленные экспериментальные данные свидетельствуют, что сверхэкспрессия MUC1, аберрантный характер его гликозилирования и аномальное изменение внутриклеточной локализации могут способствовать увеличению инвазивного и метастатического потенциала опухоли.

В клетках ряда аденокарцином [201, 216-219], а также миелоидных и лимфоидных новообразований [220, 221] обнаружена амплификация гена, кодирующего MUC1. Таким образом, генетические нарушения могут являться одной из причин, которая приводит к увеличению содержания MUC1 в опухолевых клетках.

Предполагают, что повышенная экспрессия MUC1 на плазматической мембране, вследствие значительных размеров молекулы муцина, создает стерические препятствия для функционирования поверхностных рецепторных систем, тем самым, экранируя клетку от нормальных паракринных регуляторных сигналов, нарушает формирование физиологических проадгезивных и анти-адгезивных взаимодействий [7, 89, 101].

Выявлено, что в результате изменения работы ферментативных систем, обеспечивающих гликозилирование белков, в составе муцинов, которые продуцируются опухолевой клеткой, преобладают укороченные, слаборазветвленные, сверхсиалированные О-связанные углеводные остатки core-1 гликаны: (T, Tn), sialyl-Tn, sialyl-T, sialyl-Lea и sialyl-Lex. Помимо этого, в структуре MUC1 увеличивается количество сайтов гликозилирования (рис.5) [70, 222 - 224].

Показано, что незрелые олигосахариды в составе MUC1 способны взаимодействовать с молекулами адгезии (ICAM-1), Е-селектином и другими лектинами, что способствует дезинтеграции клеток и нарушает их взаимодействие с межклеточным матриксом [225-228]. Незрелые олигосахариды также могут служить лигандами для селектин-подобных молекул эндотелиальных клеток, что облегчает экстравазацию и метастатическое распространение опухолевых клеток по кровотоку [229 232]. Взаимодействие гипогликозилированного MUC1 на поверхности циркулирующих опухолевых клеток с растворимыми селектинами крови приводит к образованию клеточных агрегатов и способствует выживанию метастатических клеток в кровотоке [233].

MUC MUC клеток культуры T47D лактирующей (рак молочной железы) молочной железы Рис.5. Схематичное изображение углеводной составляющей MUC лактирующей молочной железы человека и MUC1, который продуцируется клетками РМЖ (культура T47D). По Hanisch F.-G. & Muller S. [70].

На рисунке представлены: белковый кор (VNTR, ) и цепочки олигосахаридов, образованные простыми сахарами – N-ацетилгалактозой (), N-ацетилглюкозой (), галактозой (), фукозой () и сиаловой кислотой ().

Ключевым событием, с которым связывают возникновение патофизиологической направленности молекулярных эффектов, опосредованных MUC1, является нарушение полярной организации, свойственной клеткам эпителия в норме.

Утрата полярности делает возможным взаимодействие MUC1 c мембранными и цитоплазматическими белками, которые в поляризованной клетке локализованы в базолатеральном компартменте, и с которыми он в норме пространственно разделен (рис.6).

К настоящему времени описан целый ряд молекулярных эффектов, которые могут быть вызваны этими взаимодействиями и которые могут влиять на ключевые биологические свойства клеток [изложены в обзорах: 30, 31, 234-236]. Наиболее важные из них схематично представлены на рис.7.

Дифференцированные клетки Деполяризованная опухолевая нормального эпителия клетка Рис.6. Перераспределение белков апикальной мембраны (MUC1) и белков базолатеральной мембраны в деполяризованной опухолевой клетке (схема).

Так, обнаружено, что субъединица MUC1 способна взаимодействовать с рецептором эпидермального фактора роста ErbB1, посредством связывания внеклеточных доменов этих гликопротеидов с галектином. Цитоплазматический домен ErbB1, обладающий киназной активностью, фосфорилирует MUC1-CT, что, в свою очередь, активирует фосфорилирование белков MAPK/ERK-сигнального пути – одного из основных регуляторов транскрипции генов, контролирующих пролиферацию, подвижность и выживание клеток.

ErbB1 MUC Гал Плазматическая мембрана - Кат MUC1-CT P РЭ олигомер р P HSP- HSP- MUC1-CT Активация MAPK сигнального каскада Ядро Митохондрии Транскрипция генов Пролиферация Дифференцировка Апоптоз Подвижность Рис.7. Внутриклеточные эффекты, опосредованные взаимодействием цитоплазматического домена MUC1 (MUC1-CT) и сигнальных белков (пояснения см. в тексте).

ErbB1 - рецептор эпидермального фактора роста, MUC1 – внеклеточный домен MUC1, Гал – галектин, -Кат - -катенин;

РЭ – рецептор эстрогенов ;

HSP – белки теплового шока;

Р – фосфорилирование.

Фосфорилирование повышает сродство цитоплазматического домена MUC1 к ряду внутриклеточных белков, в частности, к -катенину. MUC1 CT взаимодействует с -катенином в участке, который в норме служит сайтом связывания -катенина с Е-кадгерином и АРС-белком. Неспособность -катенина вступать в «нормальные» взаимодействия со своими лигандами приводит к диссоциации межклеточных контактов, что облегчает миграцию клеток.

В клетках РМЖ MUC1-CT связывается с рецептором эстрогенов (РЭ) и стабилизирует его, что увеличивает экспрессию эстроген - зависимых генов и активность пролиферации клетки.

В комплексе с различными белками - эпидермальным фактором роста, катенином, РЭ, импортином, а также в виде гомодимеров, цитоплазматический домен MUC1 способен поступать в ядро клетки.

Локализация подобных комплексов в ядре вызывает активацию транскрипции гена циклина D1 - одного из ключевых ферментов, участвующих в регуляции клеточного цикла, и супрессию гена р53.

Следствием этого является активация пролиферации клеток, задержка процесса дифференцировки и ингибирование апоптоза.

К снижению активности сигналов, инициирующих программируемую гибель клеток, ведет и локализация комплекса MUC1-CT с белками теплового шока в митохондриях, где этот комплекс блокирует снижение митохондриального транс-мембранного потенциала, вызванного окислительным стрессом.

Кроме того, MUC1-CT способен непосредственно взаимодействовать с белком Р53 и транскрипционными факторами, которые регулируют активность гена р53. Образование комплекса MUC1-CT с белками STAT1 и STAT3 потенциирует активность генов, контролируемых этими транскрипционными факторами, и активирует промотор собственно гена, кодирующего MUC1.

Предполагают, что ингибирование апоптоза и активация STAT зависимого сигнального пути способствует выживанию опухолевых клеток в условиях окислительного стресса, гипоксии и недостаточности глюкозы, а также повышению устойчивости клеток к генотоксическому действию цитостатиков и ионизирующему излучению.

В экспериментах на животных взаимосвязь между характером экспрессии MUC1 и биологической агрессивностью опухоли прослежена как при естественно возникающих новообразованиях, так и на модели опухолевых гетеротрансплантатов.

Так, у нокаутных по гену Muc1 (Muc1-/-) мышей частота образования карцином и скорость роста опухолей молочной железы, поджелудочной железы, а также и количество образующихся метастазов ниже, чем у животных с диким фенотипом [237-240].    Трансфекция опухолевых клеток в культуре геном MUC1 приводит к увеличению скорости роста ксенографта опухоли у бестимусных мышей (nude или SCID) [241-243].

У иммунокомпетентных животных, трансгенных по гену MUC человека (muc1), скорость роста опухоли при трансплантации MUC1 трансфицированых клеток выше, чем при трансплантации тех же клеток, не содержащих muc1 [243, 244]. У животных, трансгенных по muc1, скорость роста сингенной опухоли молочной железы, трансфицированной геном muc и экспрессирующий муцин с короткими боковыми углеводными цепочками (core-1 гликанами), выше, чем скорость роста опухоли, клетки которой экспрессируют муцин с длинными олигосахаридами (core-2 гликанами) [245].

Таким образом, данные экспериментальных исследований свидетельствуют, что повышенная экспрессия MUC1 в деполяризованной опухолевой клетке может играть непосредственную роль в прогрессии злокачественных новообразований. Принимая во внимание данные клинико морфологических исследований, можно предполагать, что апикально люминальный тип внутриклеточного распределения MUC1 в опухолевой ткани является маркером, указывающим на относительную сохранность молекулярных процессов, контролирующих биологическое поведение клеток, в то время как деполяризованная экспрессия MUС1 на поверхностной мембране и накопление его в цитоплазме отражают глубокую степень дезорганизации регуляторных внутриклеточных механизмов.

6. MUC1 при предопухолевых изменениях эпителия На фоне активного и всестороннего изучения возможностей использования MUC1 как опухолевого маркера и патофизиологических механизмов, в которых может быть задействован этот гликопротеин в опухолевых клетках, сведения о характере экспрессии MUC1 при предопухолевых нарушениях в эпителии в целом немногочисленны.

При этом повышенную, по сравнению с нормальным эпителием, экспрессию MUC1 обнаруживают при внутриэпителиальных патологических изменениях в поджелудочной железе [34, 246], слюнной железе [39], предстательной железе [247], эпителии пищевода [248-250], толстой кишки [251 - 253], желчного пузыря [40], в уротелии [254]. Различного рода отличия по спектру экспрессии муцинов описаны при полной и неполной кишечной метаплазии эпителия желудка [191, 236, 255, 256].

В ряде исследований прослежена корреляция между увеличением уровня экспрессии MUC1, изменением характера его гликозилирования и внутриклеточного распределения с нарастанием тяжести внутриэпителиальных неопластических нарушений.

Так, при внутрипротоковой папиллярной муцинозной карциноме поджелудочной железы повышенную экспрессию MUC1 рассматривают как фактор высокого риска наличия инвазии [35], причем начало инвазивного роста обнаруживают в MUC1+ участках эпителия [36].

С использованием МКА, узнающих различные по степени гликозилирования формы MUC1, показано, что при интраэпителиальной неоплазии предстательной железы, как и в ткани инвазивного рака простаты, преобладает экспрессия гипогликозилированного муцина [38].

Определенный спектр изменений в экспрессии О-гликанов сопровождает прогрессию морфологических нарушений в ряду от интраэпителиальной неоплазии до инвазивного рака в эпителии поджелудочной железы [37].

С малигнизацией эпителия ассоциировано появление деполяризованного внутриклеточного распределения MUC1 (Ma695) в участках атипической аденоматозной гиперплазии в респираторных отделах легкого [176].

Значительное количество данных накоплено в отношении предопухолевых изменений в ткани молочной железы. При доброкачественных изменениях эпителия молочной железы, в том числе, при доброкачественных опухолях, непролиферативных и гиперпластических изменениях MUC1 сохраняет поляризованное внутриклеточное распределение, характерное для нормального эпителия [123, 112]. При внутрипротоковом (ВПР) РМЖ, как и при инвазивном раке, частота MUC1+ случаев, в зависимости от МКА и критериев оценки, составляет от 89% до 100% [32, 33, 123, 257]. Появление деполяризованного внутриклеточного распределения антигена в структурах ВПР РМЖ, по данным разных авторов, обнаруживают с частотой от 15% до 30% [18, 32, 123, 257, 258]. При этом цитоплазматическая локализация MUC1 в клетках коррелирует с меньшей степенью морфологической дифференцировки ВПР РМЖ [256].

Таким образом, в железистом эпителии ряда органов увеличение экспрессии MUC1, аномальное внутриклеточное распределение антигена и аберрантное гликозилирование муцина обнаруживают при патологических изменениях, которые на морфологическом уровне предшествуют развитию злокачественного новообразования. Это позволяет предполагать, что условия, которые вовлекают MUC1 в формирование патологических молекулярных сигналов, возникают уже на этапе предопухолевых нарушений.

Сведения, касающиеся особенностей экспрессии MUC1 при предопухолевых нарушениях в бронхиальном эпителии единичны и достаточно противоречивы. Так, Jarrard J.A. с соавт. [182] при исследовании операционного материала не обнаружили экспрессии MUC1, который детектируется антителами Ма552, Ма695 или HMPV ни в одном из исследованных случаев плоскоэпителиальной метаплазии (n=4), дисплазии (n=4) или CIS (n=4) бронхиального эпителия. Demirag F. с соавт., также при исследовании операционного материала, выявили экспрессию MUC1 при плоскоэпителиальной дисплазии эпителия бронхов в большинстве исследованных случаев (20/24, 80%) с использованием поликлональных антител [259].

Анализ других работ, в которых представлены данные по экспрессии MUC1 в ткани легкого, показывает, что результат иммунохимического окрашивания морфологически неизмененного или реактивно измененного покровного бронхиального эпителия существенным образом зависит от анти MUС1 МКА [117, 177, 182, 260]. Таким образом, имеющиеся данные не дают возможности оценить характер изменений экспрессии MUC1 при развитии предопухолевых нарушений в эпителии проводящих путей легкого.

В эндоцервикальном эпителии, по данным иммуногистохимических исследований, характер экспрессии MUC1 (Ма695) в норме, при реактивных изменениях, дисплазии и аденокарциноме in situ (AIS) не имеет принципиальных качественных отличий [48]. Повышенная экспрессия MUC (поликлональные антитела анти-MUC1 и МКА AGF4:48) наблюдается в эпителии без признаков атипии, непосредственно граничащем с AIS, что не позволяет уверенно их дифференцировать только на основании результата иммунохимического окрашивания [45].

Baker A.C. с соавт. отмечают, что в многослойном плоском эпителии влагалищной порции шейки матки, на общем фоне отсутствия окрашивания с анти-MUC1 МКА, в покрове эктоцервикса наблюдаются фокальные интенсивно окрашенные участки с признаками лимфоидной инфильтрации, на основании чего авторы предполагают взаимосвязь между воспалительными изменениями и увеличением экспрессии MUC1 в плоском эпителии [48].

В серии ранних работ, целью которых являлось создание метода автоматического анализа мазков на наличие неопластических изменений, экспрессия MUC1 исследована на цитологическом материале, полученном со слизистой оболочки шейки матки [43, 44]. С использованием панели поликлональных и моноклональных анти-MUC1 антител авторами показано, что интенсивно окрашенные специфической реакцией MUC1+ клетки, в том числе, без цитологических признаков атипии, достоверно чаще детектируются при цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) и раке шейки матки (РШМ), чем в образцах, полученных у здоровых женщин, а интенсивность иммуноцитохимического окрашивания атипических клеток увеличивается с нарастанием тяжести дискариоза. По результатам пилотного исследования (здоровые женщины -26, ЦИН -32, РШМ -6), метод цитометрии цервикальных мазков, с учетом количественной оценки интенсивности иммуноцитохимического окрашивания, позволял с высокой чувствительностью (100%) и достаточно высокой специфичностью (88%) выделять случаи, в которых при рутинном цитологическом исследовании установлен диагноз неоплазии шейки матки [261].

Развитие неопластических нарушений в эпителии шейки матки связывают с персистирующей инфекцией вирусом папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска и трансформирующей активностью его белков [262-264]. Данные, экспериментальных исследований, представленные выше (см. п. 4. данного раздела Экспрессия и функциональная роль MUC1 в норме) свидетельствуют о важной роли, которую играет MUC1 в защите слизистых оболочек при поражении бактериальными и вирусными патогенами. Однако, исследования, касающиеся возможных вирус-ассоциированных особенностей экспрессии MUC1 при интраэпителиальной неоплазии шейки матки, в опубликованной литературе отсутствуют.

7. Циркулирующий в крови MUC В настоящее время существует множество коммерческих наборов для определения циркулирующего MUC1 иммуносорбентными методами, отличающихся эпитопной специфичностью анти-MUC1 МКА и дизайном тест-систем. В серологических исследованиях MUC1-ассоциированые антигены наиболее известны под обозначениями СА15-3 и CA27.29 [49, 265], Krebs von den Lungen антиген (KL-6) [266].

Однозначного представления о сходстве или отличиях особенностей MUC1, который определяется в сыворотке крови различными моноклональными антителами, нет. Так, результаты количественного определения СА15-3 с применением наборов от разных производителей не вполне коррелируют между собой [267-269]. С другой стороны, при разных количественных единицах измерения, содержание СА15-3 в крови здоровых доноров удовлетворительно коррелирует с уровнем KL-6 [270], а диагностическая значимость оценки сывороточного уровня СА15-3 и MUC1/KL-6 при РМЖ и неопухолевых заболеваниях легких сравнима [271 273]. При отдельных нозологиях, как например, при интерстициальных заболеваниях легкого, использование KL-6, по мнению авторов, оказывается предпочтительнее СА15-3 [128].

Известно, что на результат количественного определения MUC1 ассоциированых антигенов в сыворотке крови в значительной степени влияют генетически детерминированные вариации структуры MUC1, который экспрессируется клетками организма.

Так, у различного контингента лиц-носителей аллеля, определяющего синтез «короткого» MUC1 (SNP rs4072037, генотип АА) - у здоровых доноров, больных саркоидозом легкого, больных доброкачественными заболеваниями молочной железы и раком молочной железы, содержание MUC1-ассоциированных антигенов в сыворотке крови ниже, чем у лиц, имеющих другие аллельные варианты (AG или GG) в тех же клинических группах [274 - 277].

Кроме того, известно, что в кровотоке MUC1 циркулирует в виде иммунных комплексов с аутологичными антителами - IgG или IgM [278, 279 281], количество и состав которых могут изменяться при различных физиологических и патологических состояниях организма и которые, предположительно, также могут влиять на результаты количественного определения муцина в сыворотке крови.

Стремление к повышению информативности серологического исследования постоянно инициирует поиск новых анти-MUC1 МКА, использование которых может способствовать увеличению чувствительности и специфичности диагностики онкологических заболеваний [282 - 286].

MUC1 в сыворотке крови в норме и при неопухолевых заболеваниях У здоровых лиц MUC1 определяется в сыворотке крови. Предполагают, что в норме источником циркулирующего MUC1 может быть респираторный эпителий. Вследствие тесного капиллярно-альвеолярного контакта в кровь попадает секреторный муцин, ускользающий в подлежащую ткань через полупроницаемую базальную мембрану эпителия [287]. Косвенно это подтверждается тем, что содержание MUC1 в сыворотке крови коррелирует с содержанием антигена в жидкости бронхиолоальвеолярного лаважа при неопухолевых заболеваниях легких [274, 288] и у здоровых лиц [275], а также с уровнем экспрессии MUC1 в легочной ткани у больных хронической обструктивной болезнью легких [289].

Физиологическое увеличение сывороточного уровня MUC1 (CASA и СA15-3) описано у беременных женщин [278, 290, 291], хотя в отношении СА15-3 с этими данными не согласуются результаты некоторых других исследований [292, 293]. Общая доля случаев, в которых наблюдают повышенный уровень СА15-3 при беременности, варьирует от 3% до 20%, а наибольшее увеличение уровня маркера относится к третьему триместру.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 8 |
 

Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.