авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 |
-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ВОЕННОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ИМ. С.М.КИРОВА»

МИНИСТЕРСТВА

ОБОРОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВ Виктор Андреевич

ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПОЛИПРЕНОЛСОДЕРЖАЩИХ

ПРЕПАРАТОВ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук профессор П.Д. ШАБАНОВ Санкт-Петербург 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ стр.

ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………….. Глава 1. РОЛЬ И ФУНКЦИИ ПОЛИПРЕНОЛОВ В ОРГАНИЗМЕ (АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР) ……………………………………..…… Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………….. 2.1. Выбор животных и их содержание …… …………………………… 2.2. Вживление электродов в дофаминергические структуры мозга ….. 2.3. Методы самораздражения мозга у крыс ……………………………. 2.4. Исследование поведения крыс в «открытом поле» ………………… 2.5. Исследование функциональной асимметрии мозга с помощью метода ротации …………………………………………………………… 2.6. Исследование поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте …………………………………….……….. 2.7. Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент» ………………... 2.8. Исследование антидепрессантной активности в тесте Порсолта …. 2.9. Моделирование экспериментального подострого гепатоза ………. 2.10. Биохимическое исследование крови ……………………………… 2.11. Гистологическое исследование печени ……….………………….. 2.12. Биохимическое исследование мозга ………………………………. 2.13. Фармакологические вещества, используемые для анализа двигательных и эмоциональных форм поведения ……………………… 2.14. Статистическая обработка полученных материалов …………….. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ………. 3.1. Исследование поведенческих эффектов полипренолов …………... 3.1.1. Влияние ропрена на двигательную активность и поведение крыс в «открытом поле» ………………………………………………….. 3.1.2. Влияние полипренолов на двигательную активность и стереотипное (ротационное) поведение крыс …………………………… 3.1.3. Влияние полипренолов на поведение крыс в приподнятом крестообразном лабиринте …………………………………………….… 3.1.4. Влияние полипренолов на показатели агрессии в тесте «чужак резидент» у крыс …………………………………………………………. 3.1.5. Влияние полипренолов на показатели депрессии в тесте Порсолта у крыс …………………………………………………………… 3.1.6. Влияние полипренолов на систему мозгового подкрепления в тесте самостимуляции латерального гипоталамуса у крыс ………..



… 3.1.7. Заключение …………………………………………………………. 3.2. Исследование поведенческих и нейрохимических эффектов полипренолов при подостром гепатозе ………………………………….. 3.2.1. Характеристика экспериментальной модели …………………….. 3.2.2. Влияние полипренолов и адеметионина на выживаемость крыс, подвергнутых воздействию CCl4 …………………….………………….. 3.2.3. Влияние полипренолов и адеметионина на поведение крыс, подвергнутых воздействию CCl4 …………………….………………….. 3.2.4. Влияние полипренолов и адеметионина на биохимические показатели крови крыс, подвергнутых воздействию CCl4 ……….………………….. 3.2.5. Влияние полипренолов и адеметионина на морфологическую картину печени на модели подострого гепатоза, вызванного CCl4 у крыс ……….………………………………………………………... 3.2.6. Влияние полипренолов и адеметионина на обмен моноаминов в структурах мозга крыс, подвергнутых воздействию CCl4 ……….…….. Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ …………… 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………. 6. ВЫВОДЫ………………………………………………………………… 7. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ …………………… 8. ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………… СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5-гидрокси-3-индолуксусная кислота 5-ГИУК четыреххлористый углерод CCl АЛТ аланинтрансаминаза АСТ аспартаттрансаминаза ГВК гомованилиновая кислота ДА дофамин ДОФУК 3,4-диоксифенилуксусная кислота КОМТ катехол-О-метилтрансфераза ЛПНП липопротеиды низкой плотности НА норадреналин СЕР серотонин ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Современная фармакология требует открытия и изучения новых ней ропротекторов и средств защиты печени, в том числе растительного проис хождения. К их числу может быть отнесен и ропрен, получаемый из ней тральной части хвои сосны и ели. И хотя ропрен зарегистрирован и позицио нирован, прежде всего, как гепатопротектор, у него обнаружены нейропро текторные свойства при ишемии и токсическом поражении головного мозга (Шабанов П.Д, Султанов В.С., 2012).

Ропрен представляет собой смесь полипренолов, природных линейных полимеров, содержащих 8-18 изопреновых единиц, и имеет следующую структурную формулу: СН Н – (СН2–С =СН–СН2)n–ОН, где n – число изопреновых звеньев от 8 до 18.

Препарат разрешен к практическому перименению (регистрационный номер ЛСР-001521/07), его получают по способу, описанному в патенте RU2238291. Ропрен производства ОАО «Фармацевтическая фабрика», Санкт Петербург, рассматривается как концентрат полипренолов (с содержанием суммы полипренолов 95%), он рекомендован в качестве гепатопротекторно го средства растительного происхождения (Код АТХ05ВА). Показаниями к применению ропрена являются жировая дистрофия печени различной этио логии, гепатит, цирроз печени (в комплексном лечении), токсические пора жения печени (алкогольные, наркотические, лекарственные).

Использование ропрена стимулирует репаративно-регенерационные процессы в печени, восстанавливает нарушенный гомеостаз, выводит токси ны, способствует повышению активности антиоксидантной системы орга низма. Наряду с этим отмечено стимулирующее действие ропрена на уровень неспецифической резистентности организма (нейтрофильного и моноцитар ного звена). В ходе лечения больных с патологией печени было установлено, что ропрен обладает еще иммуномодулирующим действием, оказывает нор мализующее влияние на измененный статус организма, особенно на клеточ ное звено иммунитета, о чем свидетельствует повышение активных Т лимфоцитов и индекса Тхелперы/Тсупрессоры. Применение ропрена снижает уро вень аллергической напряженности организма, что подтверждается снижени ем циркулирующих иммунных комплексов и эозинофилов крови (Свидер ский В.Л. и др., 2006).





Вместе с тем, ропрен – это высококонцентрированный препарат поли пренолов, применяемый как гепатопротектор в достаточно высоких дозах.

Имеются сведения, что малые дозы полипренолов могут проявлять и нейро протекторную активность, особенно при хронических ишемических повреж дениях головного мозга (Свидерский В.Л. и др., 2007).

Степень разработанности темы Центральные эффекты ропрена и вообще полипренолов изучены не достаточно. Более того, нет точных сведений о мишенях и интимных меха низмах действия полипренолов на центральную нервную систему (ЦНС) и высшие функции мозга. Не изучено влияние полипренолов на нейромедиа торные процессы в клетках головного мозга, по-видимому, во многом опре деляющих психоактивирующее действие препарата. Все указанное позволи ло сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Цель и задачи исследования Целью исследования было изучение поведенческих, антитоксических и нейропротекторных эффектов полипренолов у крыс.

Задачи исследования:

1) Исследовать влияние полипренолов на поведение крыс в тестах «от крытое поле», приподнятый крестообразный лабиринт, «чужак-резидент», ротации, вынужденной беспомощности Порсолта, самостимуляции латераль ного гипоталамуса.

2) Исследовать поведение, состояние системы крови и морфологию пе чени крыс с экспериментальным гепатозом и токсической энцефалопатией, вызванной подострым введением четыреххлористого углерода.

3) Исследовать нейропротекторные эффекты полипренолов на модели подострого гепатоза и токсической энцефалопатии, вызванной четыреххло ристым углеродом у крыс.

4) Исследовать влияние полипренолов на метаболизм моноаминов (до фамина и серотонина) в двигательных и эмоциогенных структурах головного мозга крыс.

Научная новизна Отсутствие четких представлений о системных эффектах полипренол содержащих препаратов и интимных механизмах их действия позволили ав тору сосредоточить основное внимание на изучении поведенческого спектра эффектов ропрена и выяснении его нейропротекторных свойств в модели экспериментального токсического поражения головного мозга. Показано, что полипренолы в широком диапазоне доз (2,2-4,3-11,6 мг/кг) обладают умерен ными психоактивирующими свойствами, антидепрессантной активностью, способностью изменять подкрепляющие свойства головного мозга. Указан ные особенности действия полипренолов на ЦНС связаны, по-видимому, с изменением обмена моноаминов, в частности дофамина, в головном мозге. В действии препарата можно выделить, по крайней мере, два направления:

первое связано с эффектами на эмоциональную сферу (депрессивность, под крепление), второе – с двигательными эффектами препарата (в основном, нормализация разных видов двигательной активности, сниженной вследствие токсических воздействий на мозг). Традиционно эти виды фармакологиче ской активности связывают с влиянием на нейромедиаторные системы мозга.

Действительно, полипренолы, применяемые в сравнительно низких дозах (2,2-4,3 мг/кг) повышают активность мезолимбической (прилежащее ядро) и нигростриатной (стриатум) дофаминергических систем у крыс с подострым гепатозом и токсической энцефалопатией. Этот эффект не связан с гепато протекторными свойствами полипренолов. Данное положение подтверждает ся фактом, что гепатопротектор адеметионин (гептрал) таким действием не обладает. Сказанное позволяет отнести полипренолы к перспективным со временным средствам с выраженным центральным психоактивирующим действием и способностью защищать печень и другие внутренние органы от действия токсикантов типа четыреххлористого углерода.

Теоретическая и практическая значимость В результате проведенных исследований получены новые данные о системных нейропротекторных, гепатопротекторных, антитоксических и эмоциогенных свойствах полипренолсодержащих препаратов, в частности, малых доз ропрена. В модельных опытах на крысах, у которых воспроизво дили подострый гепатоз введением четыреххлористого углерода доказано, что полипренолы в дозах 2,2-4,3-11,6 мг/кг оказывает нормализующее дейст вие на двигательную и исследовательскую активность, а также эмоциональ ность крыс, нарушенную CCl4. Препарат сравнения адеметионин (гептрал 300 мг/кг такого действия не оказывает). Полипренолы проявляют умеренное антиагрессивное действие, превышающее таковое для адеметионина, вклю чая высокую степень защиты (защитного поведения) у экспериментальных животных. Полипренолы нормализуют показатели крови, нарушенные вве дением CCl4. Гепатопротекторное действие полипренолов заключается в нормализации морфологического повреждения печени при эксперименталь ном гепатозе (белковой и жировой дистрофии), вызванном CCl4. Максималь ный гепатопротекторный эффект регистрируется при введении ропрена в до зе 11,6 мг/кг и гептрала в дозе 300 мг/кг (данные сопоставимы статистиче ски). В противоположность адеметионину полипренолы в дозах 2,2-4,3-11, мг/кг оказывают умеренное психоактивирующее действие, в основе которого лежит их влияние на активность дофаминергических систем головного мозга:

у крыс с подострым гепатозом и токсической энцефалопатией полипренолы повышают активность мезолимбической (прилежащее ядро) и нигростриат ной (стриатум) дофаминергических систем, тогда как адеметионин таким действием не обладает. В целом продемонстрирована фармакологическая близость гепатопротекторных эффектов полипренолов (особенно в дозе 11, мг/кг) и адеметионина, но принципиальное отличие в их центральных эффек тах. Изучение этих и родственных с ними вопросов во многом может при близить нас к пониманию механизмов действия полипренолсодержащих пре паратов и к разработке конкретных рекомендаций по их использованию в неврологической практике.

Методология и методы исследования Методология исследования состояла в изучении у крыс поведенческих эффектов полипренолов растительного происхождения в разных дозах (2,2 4,3-11,6-13,4 мг/кг), оцененных в батарее тестов («открытое поле», припод нятый крестообразный лабиринт, ротационный тест, «чужак-резидент», тест Порсолта, самостимуляция латерального гипоталамуса), моделировании по дострого гепатоза с энцефалопатией введением CCl4 с последующей оценкой гепато- и нейропротекторных эффектов полипренолов в сравнении с адеме тионином на основании поведенческих тестов, биохимии крови, морфологи ческих изменений в печени и нарушенеий обмена моноаминов (дофамина и серотонина) в головном мозге. Исследования выполнены с соблюдением всех правил доказательной медицины.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полипренолы в дозах 4,3-8,6-13,4 мг/кг при их курсовом введении (5-7 дней) умеренно активируют двигательную активность, проявляют ан ксиогенное действие, подавляют индивидуальное поведение и оказывают двухфазный эффект (подавление-активация) на поведение самостимуляции в камере Скиннера у интактных крыс.

2. В модели экспериментального подострого гепатоза с энцефалопати ей, вызванного четыреххлористым углеродом, полипренолы в дозах 2,2-4,3 11,6 мг/кг нормализуют двигательную и исследовательскую активность, а также эмоциональность крыс, проявляют умеренное антиагрессивное дейст вие, при этом препарат сравнения адеметионин 300 мг/кг такого действия не оказывает.

3. Полипренолы в дозах 2,2-4,3-11,6 мг/кг, так же как и препарат сравнения адеметионин, нормализуют показатели крови, нарушенные введением CCl4, и восстанавливают нормальную морфологическую структуру печени при токсическом подостром гепатозе (антитоксическое действие). Эффекты полипренолов 11,6 мг/кг и адеметионина 300 мг/кг приблизительно равны.

4. Полипренолы в дозах 2,2-4,3-11,6 мг/кг оказывает центральное пси хоактивирующее действие, в основе которого лежит его влияние на актив ность дофаминергических систем головного мозга. Это выявляется в модели подострого гепатоза с токсической энцефалопатией, когда полипренолы по вышают активность мезолимбической (прилежащее ядро) и нигростриатной (стриатум) дофаминергических систем. Адеметионин таким действием не обладает.

Степень достоверности и апробация материалов исследования Степень достоверности определяется большим количеством экспери ментальных животных (306 крыс), рандомизацией и формированием групп сравнения и активного контроля, адекватными поведенческими, токсиколо гическими, морфологическими, биохимическими и фармакологическими ме тодами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными ме тодами статистической обработки.

Реализация результатов Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры фармакологии Военно-медицинской академии имени С.М.Кирова, кафедры терапии, нервных болезней и психиатрии Института медицинского образова ния Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого.

Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Материал диссертации вошел в грантовые разработки Российского фонда фундамен тальных исследований РАН (РФФИ №10-04-00473).

Апробация результатов Материалы, вошедшие в диссертацию, доложены на научной конференции Российской ассоциации психонейроэндокринологии (Санкт Петербург, 2010), международных конференциях «Актуальные проблемы химии природных соединений» (Ташкент, 2010) и «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Рио-де-Жанейро, 2011), 4-ом съезде фармакологов России (Казань, 2012). По теме диссертации опубликованы 3 статьи (все в журналах, рекомендованных ВАК РФ) и тезиса. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедр фармакологии и НИО обитаемости НИЦ Военно-медицинской академии им.

С.М.Кирова.

Личный вклад автора Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в планировании экспериментов, их непосредственном выполнении, обработке полученных результатов, обсуждении результатов, написании статей и тезисов, написании диссертации и автореферета. Участие автора в выполнении, сборе и анализе – 95%, статистической обработке – 100%, в написании статей и тезисов – 90%, написании диссертации и автореферата – 95%.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований (включающей 2 раздела), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и таблицами. Библиографический указатель содержит 158 наименований, в том числе 62 отечественных и 96 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. РОЛЬ И ФУНКЦИИ ПОЛИПРЕНОЛОВ В ОРГАНИЗМЕ (обзор литературы) Синтез таких известных антиоксидантов как витамины А, Е, кароти ноиды, убихиноны идет через образование и использование изопреновых звеньев. Главным структурным звеном этих соединений является изопрен С5Н8. Изопреноидный путь обмена осуществляется через ацетилкоэнзим А, мевалонаткиназу, полипренолы (долихолы), сквален и далее может приво дить к образованию циклических производных – холестерина, стероидов, гормонов, либо к длинноцепочечным линейным полиенам – каротина, каро тиноидов, витамина А, либо к построению таких хиноновых соединений, как витамин К2 и убихинон. Участвуя в изопреноидном пути обмена, полипре нолы, как транспортные липидсодержащие молекулы, обладают разносто ронней биологической активностью. Изопрениловые молекулы убихинона и менахинона являются наиболее важными, так как они являются дыхательны ми коферментами в системах переноса электронов, как у растений, так и у животных.

1.1. Химия полипренолов Полипренолы, или как их еще называют полиизопреноиды, представ ляют собой большую группу соединений – линейных 1,5-полиенов с различ ной конфигурацией тризамещенных связей СС с -изопреновым звеном.

Биологически они являются высоко функционально активными веществами.

Полипренолы относятся к соединениям с общей структурной формулой (рис. 1) Н(С5Н8)n ОН, где n=5-24.

Большинство изопреновых остатков имеют цис-замещенную двойную связь, и только 2 или 3 в -конце цепи представлены транс-конфигурациеей, возрастающей до ди(транс) или три(транс)поли(цис)преноидных алкоголей.

В этом отношении они отличаются от полипренолов, таких как соланенол, которые являются предшественниками боковой цепи пластохинонов, убихи нонов и менахинонов. Некоторые поли(цис)преноидные алкоголи содержат один или, по крайней мере, небольшое число насыщенных изопреновых ос татков. Долихолы (от греч. – длинный) имеют насыщенный остаток, то есть являются 2,3-дигидрополи(цис)изопреноидными алкоголями.

Они представляют собой очень гидрофобные длинные молекулы с n в верх ней части ряда, как правило, от 18 до 24.

СН3 СН3 СН СН3 – С =СН – СН2 – (СН2-С =СН – СН2–)n-2 – СН2 – С = СН – СН2 –ОН -остаток -остаток Рис 1. Общая структура полиизопреноидных спиртов (полипренолов).

Термин поли(цис)изопреноидные алкоголи часто сокращается до по ли(цис)пренолов или полипренолов в зависимости от контекста. Само содер жание полипренолов в ткани не всегда отражает концентрацию соединения в его функциональной форме, которой является монофосфат. Поэтому часто необходимо измерять фосфатазную активность или скорость метаболизма свободных полипренолов, чтобы более точно оценить их функциональную активность.

Полипренолы относятся к природным биорегуляторам (физиологиче ски активны), для которых установлены коферментные функции мембрано активных участников транспорта гидрофильных частиц в процессе биосинте за полисахаридов, гликопротеидов, пептидогликанов и углеводсодержащих биополимеров.

Все бактерии содержат ди(транс)поли(цис)пренолы с 10-12 изопрено выми остатками. Их главный компонент ундекапренол иногда называют бак топренолом. В организме бактерий он присутствует, как правило, в форме фосфоундекапренола или его гликозилированных производных. В частности, такие структуры присутствуют в золотистом стафилококке, Staphylococcus aureus, а также в лактобактериях, Lactobacilli. В Staphylococcus aureus, нахо дящегося в стационарной фазе, свыше 90% ундекапренола (0,03 моль/г кле ток) неэстерифицировано (Hemming F.W., 1985).

Зеленые листья высших растений содержат три(транс)поли(цис)прено лы, в которых n колеблется в пределах 10-13 изопреновых остатков, обычно большинство компонентов в смеси составляют 11-12 остатков. Например, в работах, выполненных на листьях фикуса, Ficus elastica, большинство поли пренолов было представлено фикапренолом-11 и фикапренолом-12. Концен трация этих спиртов в листьях обычно возрастает по мере старения листьев.

Иглы сосны разных видов накапливают три(транс)поли(цис)пренолы с коле баниями изопреновых остатков от 13 до 21, которые представлены главным образом ациловыми эфирами. Нефотосинтезирующие ткани высших расте ний иногда содержат мало отличающиеся поли(цис)пренолы с малым числом изопреновых единиц (6-9), обычно в форме эфиров жирных кислот. Напри мер, в древесной ткани серебристой березы, Betula verricosa, содержатся бе тулапренолы-6-9 (Hemming F.W., 1985).

Большинство эукариотических клеток содержат 2,3 дигидрополи(цис)пренолы, которые называют долихолами. Почти все они включают 2 транс-остатка в -конце цепи. Суммарные данные по распреде лению долихолов в организме позвоночных представлены в табл. 1. Видно, что наиболее изучено распределение долихолов в организме человека и кры сы. Концентрация долихолов резко колеблется в зависимости от органа или ткани. У человека содержание долихолов в тканях в 10-50 раз превышает та ковое в организме крысы. Из тканей человека, наиболее богатых долихолами, необходимо выделить гонады (яички), гипофиз и надпочечники, то есть именно те органы, которые осуществляют гормональный контроль функция ми. В организме крысы концентрация долихолов наиболее высока в селезен ке, поджелудочной железе и печени. Если в человеческом организме содер жание долихолов колеблется весьма выражено, то у крысы оно мало отлича ется от органа к органу. Достаточно высокие концентрации долихолов обна ружены в клетках печени свиньи, причем неэстерифицированные долихолы локализованы главным образом в митохондриях, а эстерифицированные с жирными кислотами – в грубой ядерной фракции.

Радиоактивный [3H]долихол, введенный крысам внутривенно, обнару живается главным образом в печени, на митохондриальной внешней мембра не, в меньших количествах – в легких, желудочно-кишечном тракте и селе зенке. При введении крысам радиоактивного долихола, смешанного с под солнечным маслом, сыворотка крови и печень содержали по одной третьей части общей радиоактивности каждая, менее всего – в легких и селезенке.

При внутрижелудочковом введении содержание долихола в различных отде лах мозга крыс снижалось в ряду: мозжечок средний мозг серое вещество ствол мозга белое вещество.

Таблица Распределение долихолов в организме животных и человека (Hemming F.W., 1985, с изменениями) Животное Орган Концентрация мкг/г массы Бык Щитовидная железа Гипофиз 130- Курица Яичники 164- Печень Кровь 0, Человек Яички Гипофиз Надпочечник Печень Щитовидная железа Поджелудочная железа Простата Сердце Почки Селезенка Легкие Свинья Печень 69- Кролик Печень 10- Крыса Селезенка Поджелудочная железа Печень Головной мозг Легкие Тонкая кишка Почки Яички Сердце Мышцы Кровь Костный мозг Кожа 1.2. Биосинтез полипренолов Принципиальная схема синтеза полипренолов у прокариотов и эука риотов сходна (Holstein SA, Hohl RJ., 2004). В клетках эукариотов синтез по ли(цис)пренолов, как и убихинонов, локализован главным в митохондриях и представлен на рис. 2. Однако ряд этапов биосинтеза требует более подроб ных пояснений. В частности, этапы 7 и 8 локализованы на внутренней мем бране митохондрий, хотя этап 5, связанный с долихолсинтетазой, осуществ ляется на внешней мембране митохондрий. Этапы 9 и 10 идут на гладком эн доплазматическом ретикулуме. Утилизация фарнезилпирофосфата на этапе происходит в цитоплазме, так же, как и этап 2. Важно отметить, что стерео химия изопреновых остатков полипренолов определяется свойствами фер ментов, катализирующих этапы 4, 5 и 7.

Рис. 2. Биосинтез дифосфополи(цис)пренолов и связь с другими путями син теза изопреноидов (Hemming F.W., 1985) х и n означают число изопреновых остатков в каждой молекуле.

1.3. Роль полипренолов в переносе сахаров (гликозилировании).

Как уже отмечалось выше, фосфополи(цис)пренолы выполняют функ цию коферментов в нескольких реакциях гликозилирования. Ферменты, ко торые участвуют в этом процессе, относятся к категории связанных с мем браной гликозилтрансфераз, сама система достаточна проста. Переносимый сахар присутствует в форме растворенного в воде дифосфата сахара, высту пающего в роли донора. Он переносится из цитоплазмы связанной с мембра ной трансферазой, которая катализирует его перенос на монофосфопо ли(цис)пренол, также связанный с мембраной. Поскольку эта реакция преду сматривает обмен одного сахар-1-фосфата на другой, реакция обратима и по тенциал переноса фосфата сахара остается в этом связанном с липидом про межуточном продукте. Гликозилтрансфераза использует этот гидрофобный донор в качестве субстрата, катализирующего перенос остатка сахара на спе цифический акцептор для связывания гликозилированием и высвобождает монофосфополи(цис)пренол для следующего взаимодействия с трансферазой (McTaggart SJ., 2006;

Hemming F.W., 1985).

Выше мы рассмотрели общую схему участия фосфополи(цис)пренолов в гликозилировании (переносе сахаров). Однако эта схема вполне переноси ма на комплекс полисахаридов бактериальных клеток, где фосфопо ли(цис)пренолы также выполняют роль коферментов, обеспечивая формиро вание пептидогликанов (главного компонента бактериальной клетки) как у грам-положительных, так и у грам-отрицательных бактерий. Кроме того, фосфополи(цис)пренолы обеспечивают N-гликозилирование белков (через остаток аспарагина), О-гликозилирование у растений (олигоманнозильную группу на серин и треонин), а также гликозилирование (маннозилирование) ретинола, который также является одним из полипренолов – аллильным изо преноидным алкоголем (Burda P., Aebi M., 1999). Схематически N гликозилирование, С- и О-манозилирование в листьях растений представле ны на рис. 3.

Рис. 3. Схематическое представление путей N-гликозилирования, С- и О манозилирования (А) Предшественник олигосахарида структуры Glc3Man8GlcNAc2 (глюкоза манноза-N-ацетилглюкозамин) расположен на внешней и внутренней сторо нах листков эндоплазматического ретикулума (ER). Олигосахарид перено сится на протеин с помощью олигосахаридтрансферазы. Число требуемых молекул долихолфосфата показано под рисунком. (В) Белки модифицируют ся с помощью якорей гликозилфосфатидилинозитола (GPI), С- или О маннозилирования (обозначены как а, b, с соответственно) на внутренней по верхности листков эндоплазматического ретикулума (ER) (Denecke J., Kranz C., 2009).

Таким образом, представленные данные подчеркивают универсальный характер участия полипренолов в гликозилировании (переносе сахаров), что является важнейшей биохимической реакцией, без которой не мыслимо осу ществление ни одной функции организма – будь то бактерия, растение, жи вотное или человек.

1.4. Функциональная роль полипренолов в организме В организме животных роль поли(цис)пренолов выполняют их 2,3 дигидропроизводные – долихолы, представляющие собой длинноцепочечные поли(цис)изопреновые спирты.

Синтез долихолов осуществляется из мевалоната посредством мевало наткиназы (см. выше рис. 1). Долихолы регулируют N-гликозилирование белков. Активной является фосфорилированная форма долихолов (Adair W.L., Keller R.K., 1982). Долихолы располагаются внутри фосфолипидного бислоя мембран, но их точное расположение неизвестно, так как их движе ние и распределение варьирует в зависимости от геометрии мембраны.

Предполагается, что они определяют и модифицируют текучесть, стабиль ность и проницаемость мембран. Долихол может действовать как радикаль ный поглотитель образующихся на мембране перекисных липидов. Некото рые данные свидетельствуют, что, будучи эндогенным липофильным погло тителем, долихол вместе с витамином Е, возможно, является интегральным элементом антиокислительного механизма клеточных мембран. Полагают, что долихол может взаимодействовать с витамином Е, образовывая хорошо отлаженную цепь по перемещению свободных радикалов, а нарушения в ра боте этой цепи влекут за собой молекулярно-деструктивные процессы в па тогенезе многих заболеваний человеческого организма (Владимиров Ю.А., 2000;

Bergamini E. et al., 2004).

В качестве примеров приведем ряд фактов, свидетельствующих о раз витии клеточных повреждений вследствие активации перекисного окисления липидов (ПОЛ). В клетках и, в особенности, в субклеточных органеллах ми тохондриях, где дыхательная цепь генерирует основную массу активных форм кислорода, окисление тиоловых групп продуктами ПОЛ приводит к появлению в мембранах различных дефектов, повышающих ее проницае мость (пор). Под действием разности электрических потенциалов на мембра нах сквозь такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрии – ионы калия. Эти процессы повышают осмотическое давление внутри клеток и ми тохондрий и вызывают их набухание, что еще больше повреждает мембраны.

Генерализация ПОЛ постепенно делает мембраны более твердыми, хрупкими и проницаемыми («протекающими»), лишая их способности нормально реа гировать с окружающей средой (Тодоров И.Н., Тодоров Г.И., 2003).

Продукты ПОЛ могут также поражать ионтранспортные ферменты, та кие как Са2+-АТФазы, окисляя тиоловые группы их активного центра. Эти события ведут к замедлению откачивания ионов кальция из клетки и одно временно к ускорению входа кальция в клетку, что сопровождается повыше нием внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки.

Под влиянием ПОЛ мембраны митохондрий делаются проницаемыми для ионов водорода и кальция, в результате чего эти органеллы теряют способ ность к синтезу АТФ, и клетка оказывается в условиях энергетического голо да (Владимиров Ю.А., 2000). Эти примеры можно продолжить, но для пове ствования представляется более важным рассмотреть участие полипренолов в процессах регуляции ПОЛ и антиоксидантной защиты.

1.5. Фармакологическое значение полипренолов и их производных Прежде всего, вернемся к публикации Е. Бергамини и соавторов (Ber gamini E. et al., 2004), работающих в Пизе (Италия). Эти авторы подметили, что уровень долихолов, как и холестерина, с возрастом неуклонно растет.

Низкокалорийная диета несколько замедляет связанные с возрастом измене ния в распределении долихолов в организме. Более того, авторы представили доказательства, что долихолы могут выступать как поглотители активных форм кислорода и нейтрализаторы ПОЛ мембран клеток.. Описывая этот процесс, они подчеркивают, что долихолы взаимодействуют с ненасыщен ными жирными кислотами и витамином Е (наиболее мощным биологическим антиоксидантом). По сути, долихолы предохраняют от прогрессирования клеточных нарушений, приводящих к атеросклерозу и нейродегенеративным заболеваниям (Farooqui T, 2009;

Eckert GP, 2009). Задолго до исследований E. Bergamini и соавторов (2004) аналогичное наблюдение было выполнено R.K.Pullatkat и H. Reha (1982). Они выявили, что за время жизни уровень до лихолов в головном мозге увеличивается почти в 15 раз: от 18 мкг/г ткани у 6-летних детей до 263 мкг/г ткани у 68-летних пожилых людей. Следова тельно, с возрастом происходит интенсификация образования и накопления долихолов, которые, по-видимому, осуществляют защитные функции, ней трализуя некоторые химически агрессивные соединения, например, активные формы кислорода.

По мнению R.R.Kurup и P.A.Kurup (2003), в результате изопреноидного обмена могут образовываться три главных метаболита: 1) дигоксин – эндо генный ингибитор мембранной Na+-К+-АТФазы (речь идет об эндогенных дигиталисоподобных соединениях, имеющих видовую специфичность) ;

2) убихинон – мембранный антиоксидант и вещество, способствующее прохож дению транспорта электронов через мембрану и улавливанию свободных ра дикалов, и 3) долихол, осуществляющий N-гликозилирование сахаров и бел ков. Этот вывод авторы сделали на основании большого клинического мате риала, полученного в процессе изучения различных форм патологии, связан ных с нарушениями изопреноидного обмена, где в качестве маркеров они изучали не только изменения уровня в сыворотке крови дигоксина, убихино на и долихола, но и магния, а также активность 3-гидрокси-3-метилглутарил КoA-редуктазы, Na+-К+-АТФазы, соотношение холестерин/фосфолипиды, кальций/магний, уровень лизосомальных ферментов, свободных радикалов при различных заболеваниях. Как отмечают эти авторы, в клинической прак тике нарушения метаболизма изопреноидного пути наблюдаются довольно часто при различных нейродегенеративных заболеваниях ЦНС, включая бо лезнь Альцгеймера, при хронических заболеваниях внутренних органов, на пример, хронической эмфиземе легких, идиопатическом фиброзе легких, саркоидозе легких, бронхиальной астме, язвенном колите, алкогольном цир розе печени и гепатолентикулярной дегенерации, пептических язвах и других заболеваниях желудочно-кишечного тракта, дегенеративных заболеваниях нервно-мышечной системы, остеопорозе, остеоартрите, спондилезе, беспло дии. Кроме того, R.R.Kurup и P.A.Kurup (2003) уверены, что нарушения об мена изопреноидов встречаются у больных при тромбозе сосудов и закупор ке артерий, иммунодефицитных состояниях (ревматизм, стрептококковая инфекция), эритроматозной волчанке, зависимости от еды (булимия и ано рексия), болезни Крейтцфельда-Якобса и других патологиях. R.R.Kurup и P.A.Kurup опубликовали более десятка работ в Международном журнале нейронаук (2003), в каждой из которых подчеркивают значение полипрено лов в развитии указанной патологии.

Действительно, многие из этих наблюдений подтверждаются. Напри мер, в исследовании Н.Я.Григорьевой и А.М.Моисеенкова (Grigor’eva N.Ya., Moiseenkov A.M., 1989) продемонстрирована антиульцерогенная активность многих полипренолов и их производных, что стало предметом изобретения.

Результаты других исследований показали важную роль долихолов при на рушении холестеринового обмена (Bentinger M. et al., 2008), когда наблюда ется высокое накопление холестерина и липидов низкой и очень низкой плотности в сосудах и других органах, что взаимосвязано с повышением концентрации долихолфосфата в результате ингибирования транспорта ней трального спирта долихола из эндоплазматического ретикулума в лизосомы.

Они играют, по-видимому, важную роль в поддержании правильного липид ного состава мембран (Jones P.H., 2003).

У пациентов с болезнью Альцгеймера содержание долихолов в 10 раз личных областях мозга оказалось на 20-50% меньше, чем у здоровых людей (Parentini I, 2005;

Cole SL, 2006;

Hooff G.P. et al., 2008, 2010).

При нарушении синтеза долихолов (расстройствах гликозилирования), происходящего на эндоплазматическом ретикулуме или в цитоплазме, воз можны серьезные врожденные дефекты. Так, в работе E. Morava и соавторов (2010) описан врожденный мозжечково-глазной синдром, в состав которого входит мозжечковая атаксия, анемия, ихтиоформный дерматит, дисфункция печени, нарушения свертывания крови и прогрессирующие офтальмологиче ские признаки в форме гипоплазии глазного нерва, отслойки сетчатки, врож денной катаракты и глаукомы. Причина данной патологии не ясна. Исследуя 12 пациентов из 9 семей с признаками мозжечковой атаксии и врожденной патологией глаз, авторы выявили наличие у пациентов (детей) мутации гена SRD5A3, кодирующего стероидную 5-редуктазу типа 3. Это приводит к на рушениям N-гликозилирования сахаров и белков, то есть синтезу долихолов.

Данное исследование еще раз подтвердило важность правильного синтеза долихолов для обеспечения здоровья человека.

Синтез долихолов может нарушаться на разных уровнях (Chojnacki T, Dallner G, 1988).. Во-первых, чаще всего это происходит на уровне образова ния мевалоновой кислоты. Так действуют статины, блокирующие активность 3-гидрокси-3-метилглутарил-КoA-редуктазы. К ним относится большая группа гиполипидемических средств, применяемых для лечения атероскле роза (аторвастатин, симвастатин, правастатин, ловастатин, флувастатин, ро зувастатин). Эта группа препаратов квалифицируется как наиболее активная из всех гиполипидемических препаратов (Jones P.H. et al., 2003). Однако ста тины крайне редко рассматриваются с позиции возможного торможения до лихолов. Единственным связующим звеном между долихолами и холестери ном является факт взаимосвязанного снижения содержания обоих сложных спиртов в организме под влиянием лечения статинами (Espenshade PJ, Hughes AL., 2007).

Второй мишенью действия лекарственных веществ в цепочке биосинте за долихолов является фарнезилфосфат (Mo H., Elson C.E., 2004). Именно это звено является привлекательным для создания противоопухолевых средств, учитывая, что одним из путей превращения фарнезилфосфата является его трансформация в геранилгеранилфосфат, осуществляющий N гликозилирование рецепторов фактора роста. Действительно, препараты, уг нетающие мевалонатпирофосфатдекарбоксилазу (фенилацетат натрия, фе нилбутират натрия) показали высокую противоопухолевую эффективность в доклинических и клинических (фазы I-II) исследованиях. Средств угнетения фарнезилпротеинтрансферазы (следующего этапа синтеза долихолов) оказа лось больше, чем испытанных на предыдущем этапе. Ими стали типифарниб и экспериментальные соединения под шифрами R115777, SCH66336, BMS 214662, L-778,123. Эти соединения показали разные результаты, но в целом антибластомная активность их не вызывала сомнений. Другими исследова ниями было показано, что соединения, влияющие на фарнезилпротеинтранс феразу, обладают антивирусной активностью в отношении вируса гепатита D (Einav S., Glenn J.S., 2003). И, наконец, еще одним перспективным антибла стомным средством является периллил алкоголь, также угнетающий фарне зилпротеинтрансферазу. Экспериментальные и клинические исследования подтвердили его эффективность в качестве средства лечения и профилактики онкологических заболеваний (Mo H., Elson C.E., 2004).

В зависимости от количества изопреновых единиц, заместителей, на сыщенности двойных связей, эти соединения способны проявлять различное иммуномодулирующее и метаболическое действие на организм. Иммуномо дулирующее действие полипренолов на организм, как предполагают, опре деляется способностью этих веществ стимулировать образование нейтрофи лов и активировать макрофаги ретикулоэндотелиальной системы. Некоторые синтетические полипренолы были запатентованы японской фирмой «Эйсан»

в качестве препаратов для профилактики и лечения болезней, обусловлен ных иммунодефицитом (бронхиальная астма, ревматоидный артрит и др.), а также в сочетании с антибиотиками при различных инфекционных заболева ниях для повышения иммунитета.

Пониженный уровень долихолов наблюдается при остром ревматизме и других иммунодефицитных состояниях (Buhaescu I., Izzedine H., 2007).

Иммуномодулирующее действие полипренолов было доказано рядом авторов на модели вируса гриппа и при нейроинфекциях. Эффективность полипре нолов выявлена при профилактическом введении их за двое суток до аэро генного инфицирования мышей вирусом гриппа А. Кроме того, имеются данные, указывающие на то, что у животных, зараженных вирусом Сендай, регистрируется более высокий уровень интерферонов в ткани легких при введении им дигидрогептапренола, одного из производных полипренолов. У некоторых из полипренолов, полученных как путем синтеза, так и выделен ных из растительного сырья (гингко билоба, сосна и др.) выявлена противо язвенная активность (Grigor’eva N.Ya., Moiseenkov A.M., 1989), некоторые из этого класса соединений обладают антитромботической активностью (чет вертичные моноаммониевые соли диаминов). Синтезированные различными способами полипренолы могут обладать также противоопухолевой активно стью (например, при гепатоканцерогенезе) (Holstein SA, 2010). Их низкая токсичность делает этот класс соединений перспективным при лечении раз личных видов опухолей (Mo H., Elson C.E., 2004).

Большую перспективу представляют изопреноиды, созданные путем химического или микробиологического синтеза (Klein-Marcuschamer D. et al., 2007). Среди них выделяются средства растительного происхождения, влияющие на мевалонатный путь (каротиноиды, моно-, ди- и тритерпены, то коферолы, гиббереллины, производные хлорофилла, стеролы) (Kirby J., Keas tling J.D., 2009).

Наконец, полиизопреноидные спирты, кислоты и их амиды способны восстанавливать функцию печени, что позволило запатентовать эти соедине ния как средства для лечения заболеваний печени, вызванных воспалением, перерождением, а также нарушениями в жировом и углеводном обмене.

1.6. Гепатопротекторы синтетического и растительного происхождения.

Гепатопротектор ропрен Многообразие нарушений функций печени существенно осложняет задачу медикаментозной коррекции таких состояний и требует применения фармакологических средств широкого спектра действия. К тому же следует иметь в виду, что в патогенезе самых различных заболеваний печени важную роль играют иммунологические сдвиги, сопровождающие патологию этого органа.

В соответствии с современными принципами лечения заболеваний пе чени, программа комплексной терапии такой патологии включает два основ ных направления (Подымова С.Д., 1998). Первое представляет этиотропную терапию, направленную на подавление патологического возбудителя, его элиминацию и санацию организма. Второе направление соответствует патоге нетической терапии, имеющей целью адекватную фармакологическую кор рекцию универсальных, мультифакторных и разнесенных во времени звеньев патогенеза. При этом нужно отметить, что универсальность основных звеньев патогенеза различных поражений печени позволяет при всей полиэтиологич ности данной патологии использовать достаточно близкую патогенетическую терапию, основу которой могут составлять лекарственные средства с направ ленным действием на печеночные клетки.

Основной целью этиотропной терапии хронических гепатитов является удаление из организма этиологического фактора и продукция адекватного иммунного ответа (Подымова С.Д., 1998). Комплексная терапия таких боль ных должна учитывать тип возбудителя, степень активности патологического процесса, ведущего клинического синдрома, наличие признаков цирротиче ской стадии, а при наличии вируса – фазы вирусной инфекции – репликации или интеграции (Оковитый С.В. и др., 2002). В этом отношении ведущее зна чение имеет система интерферонов, обладающих прямой и обратной связью с иммунной системой организма. Противовирусное действие интерферонов осуществляется через клеточный синтез нуклеиновых кислот с помощью ряда ферментов и ингибиторов, приводящих к деградации чужеродной генетиче ской информации.

Среди патогенетических средств лечения заболеваний печени традици онно выделяют группу гепатопротекторов растительного происхождения (Пастушенков Л.В. и др., 1990;

Пастушенков Л.В., Лесиовская Е.Е., 1995). В методической работе П.Д.Шабанова (2002) рассмотрены вопросы использо вания таких гепатопротекторов для лечения заболеваний печени в основном токсического и алкогольного происхождения. Дана классификация гепато протекторов. Подробно описаны механизмы действия гепатопротекторов растительного происхождения. Специальный раздел посвящен использова нию нового гепатопротектора растительного происхождения маргали в ком плексном лечении паренхиматозных поражений печени. На большом факти ческом материале (более 100 больных с алкогольными гепатитами и цирро зами) доказана эффективность клинического применения маргали, исполь зуемого как гепатопротектор в течение 3-недельного курса лечения. У боль ных, получавших лечение с помощью комплексного препарата маргали, от мечено значительное улучшение самочувствия, нормализация биохимиче ских показателей печени, иммунного статуса, уменьшение размеров желчно го пузыря. Сделан вывод о возможности включения препарата маргали в комплексную терапию гепатитов и циррозов алкогольного происхождения.

Однако современная гепатология требует открытия и изучения новых гепатопротекторных средств, в первую очередь растительного происхожде ния. К их числу отнесен и ропрен, полученный из нейтральной части хвои сосны и ели. Ропрен представляет собой группу полипренолов, точнее смесь полипренолов, содержащих 8-18 изопреновых единиц и имеет следующую структурную формулу:

СН Н – (-СН2-С =СН-СН2-)n-ОН, где n – число изопреновых звеньев от 8 до 18.

Лекарственный препарат ропрен зарегистрирован Минздавсоцразвития РФ (ЛСР-001521/07 от 12.07.2007 г.), его получают из хвои сосны и ели по способу, описанному в патенте (RU2238291).

Ропрен производства ОАО «Фармацевтическая фабрика Санкт Петербурга» (ГаленоФарм), представляет собой концентрат полипренолов (с содержанием суммы полипренолов 95%), рекомендован в качестве гепато протекторного средства растительного происхождения (Код АТХ05ВА).

Показаниями к применению ропрена являются жировая дистрофия пе чени различной этиологии, гепатит, цирроз печени (в комплексном лечении), токсические поражения печени (алкогольные, наркотические, лекарствен ные).

Использование ропрена стимулирует репаративно-регенерационные процессы в печени, восстанавливает нарушенный гомеостаз, выводит токси ны, способствует повышению активности антиоксидантной системы орга низма. Наряду с этим отмечено стимулирующее действие ропрена на уровень неспецифической резистентности организма (нейтрофильного и моноцитар ного звена). В ходе лечения больных с патологией печени было установлено, что ропрен обладает еще иммуномодулирующим действием, оказывает нор мализующее влияние на измененный статус организма, особенно на клеточ ное звено иммунитета, о чем свидетельствует повышение активных Т лимфоцитов и индекса Тхелперы/Тсупрессоры. Применение ропрена снижает уро вень аллергической напряженности организма, что подтверждается снижени ем циркулирующих иммунных комплексов и эозинофилов крови.

Ассортимент лекарственных средств, применяемых в комплексной те рапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, насчитывает более наименований. Среди такого многообразия препаратов выделяют сравнитель но небольшую группу оказывающих избирательное защитное действие на пе чень – гепатопротекторов. Их действие направлено на восстановление гомео стаза в печени, повышение устойчивости органа к действию патогенных фак торов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаратив но-регенерационных процессов в печени. Основные требования к идеальному гепатопротектору можно представить в следующем виде:

• препарат должен достаточно полно абсорбироваться;

• обязательно наличие эффекта «первого прохождения» через пе чень;

• у препарата должна быть выраженная способность связывать или предупреждать образование высокоактивных повреждающих соединений;

• наличие противовоспалительных свойств;

• наличие способности подавлять процесс фиброгенеза;

• препарат должен стимулировать регенерацию печени;

• у соединения должен быть естественный метаболизм при патоло гии печени;

• важна экстенсивная энтерогепатическая циркуляция;

• невысокая токсичность.

К сожалению, на сегодняшний день ни один из использующихся в медицинской практике гепатопротекторов не удовлетворяет в полной мере этим требованиям, хотя в последние годы арсенал современных гепатозащитных средств и расширился как за счет появления синтетических препаратов, так и новых природных средств.

К основным группам гепатопротекторов следует отнести:

• препараты растительного и животного происхождения (в первую очередь препараты из расторопши пятнистой, ропрен, эссенциале);

• стероидные и нестероидные синтетические анаболические средства (оротат калия, метилурацил, пентоксил, станозолол и др.);

• препараты, восстанавливающие целостность мембран гепатоцитов (эссенциале, тропофар);

• антиоксиданты витамин Е (aльфа-токоферол), селенит натрия, супероксиддисмутаза;

• простагландины и факторы роста (простенон, илопрост, человеческий фактор роста, рекомбинантный человеческий фактор роста);

• средства, влияющие на активность микросомальных ферментов печени (диэтилтиокарбамат, метирапона гидротартрат и пиперанил бутоксид);

• витамины и гормоны: цианкобаламин (витамин В12), фолиевая кислота (витамин Вc), пиридоксин (витамин В6), липоевая кислота и её препараты (липамид, тиоктацид), глюкокортикоиды, глюкагон;

• адаптогены (препараты лимонника, заманихи, аралии, женьшеня, родиолы, элеутерококка, пантокрин, получаемый из пантов марала и рантарин из пантов северного оленя, дибазол (бендазол), бемитил, этомерзол (томерзол);

• препараты различных групп: S-аденозил-L-метионин (гептрал), урсодеокисихолевая кислота, производные никотиновой кислоты, изопропоксигерматран, даларгин, убихинон-10, оксикоричные кислоты, антагонисты кальция.

Остановимся более подробно на препаратах растительного и животного происхождения. Эта группа средств традиционна для лечения заболеваний печени и прочно занимает одно из ведущих мест в терапии поражений печени инфекционного и неинфекционного происхождения. Лечебное действие многих видов лекарственных трав, применяющихся в настоящее время в народной и научной медицине, связано с наличием в них различных биологически активных веществ: алкалоидов, гликозидов, кумаринов, сапонинов, эфирных масел, витаминов и т. д.

В основе действия препаратов растительного происхождения на процессы регенерации печени лежит либо прямое активирующее влияние на синтез РНК и белка, либо вторичный опосредованный эффект, связанный с наличием у данных средств противомикробной, противовоспалительной, желчегонной и антиоксидантной активности. У многих препаратов первичное и вторичное действие могут сочетаться.

Препараты растительного происхождения нашли широкое применение в клинической гепатологии (Соколов С.Я., Замотаев И.П., 1990). Наиболее час то в настоящее время используются лечебные средства, созданные на основе расторопши пятнистой: силибинин, силибор, легалон (силибин, силимарин).

Силибор, содержащий флаволигнаны (силибинин, силидианин, силихристин) и флавонолы, оказывает отчетливое гепатозащитное действие при вирусном гепатите, повреждениях печени, механической желтухе, однако полного вос становления функциональной активности митохондриальных и микросо мальных ферментных систем при использовании этого препарата все же не происходит (Машковский М.Д., 2008;

Оковитый С.В., 2002). Достаточно вы сокую гепатозащитную активность при экспериментальных отравлениях про являет индивидуальный флаволигнан силибинин (силимарин). Препарат дает антиоксидантный эффект и подавляет перекисное окисление полиненасыщен ных жирных кислот в составе мембран фосфолипидов, усиливает репаратив ные процессы. Улучшая функцию мембран и течение метаболических про цессов в повреждённой паренхиме печени, эти препараты препятствуют раз витию гидропической и жировой дистрофии, некрозов, стимулируют желче образование, синтез альбуминов и факторов свертывания крови. В то же время имеются работы, доказывающие, что силибор, карсил и легалон в низ ких дозах обладают слабым гепатопротективным и выраженным холеретиче ским действием, а в высоких дозах угнетают секреторно-экскреторную функ цию печени.

В механизме действия комплексного растительного препарата ЛИВ- также имеют значение ослабление перекисного окисления липидов и нормализация соотношения отдельных фосфолипидных фракций в мембранах печеночных клеток, в частности уменьшается количество гепатотоксичного лизолейцина.

Установлено позитивное влияние на регенерацию печени суммы фенольных соединений арники горной и арники облиственной, препарата солянки холмовой (лохеин), высушенных извлечений из травы пастушьей сумки, шлемника байкальского, экстракта родиолы розовой, горечавки желтой, настоя травы астрагала шерстистоцветкового. Показана эффективность при гепатите, вызванном тетрахлорметаном, ряда терпеноидных кумаринов (производных гальбановой кислоты), которые ингибируют перекисное окисление липидов, улучшают углеводный обмен, восстанавливают скорость секреции желчи.

В лечении гелиотринового гепатита с успехом был использован новый анаболический препарат, относящийся к группе фитоэкдистероидов и представляющий собой природное соединение, получаемое из корней и соцветий ряда видов левзеи. В качестве действующего начала этот препарат содержит экдистерон. Действие его подобно действию стероидных гормонов, но в отличие от последних, он не обладает тимолитическим действием. Кроме этого, у него обнаружена способность повышать стабильность полиферментных систем мембран митохондрий печени, мембраностабилизирующая активность.

Особый интерес для клинической гепатологии представляют антиоксиданты флавоноидной природы. Новое производное цианиданола – катерген – представляет собой полусинтетический флавоноид растительного происхождения, гепатопротективное действие которого доказано на основании предупреждения и уменьшения токсического влияния на печень таких ядов как Д-галактозамин, тетрахлорметан (ТХМ), фаллоидин. Эффект препарата обусловлен тем, что он может связывать свободные радикалы, высвобождаемые многими гепатотоксическими веществами. Катерген также стимулирует синтез АТФ в печени, что облегчает протекание биохимических реакций, связанных с затратами макроэргов. Помимо этого он обладает мембраностабилизирующим действием, уменьшая проницаемость клеточных мембран для низкомолекулярных водорастворимых соединений (Оковитый С.В. и др., 2002).

Перспективно изучение и использование в качестве гепатопротекторов веществ, являющихся продуктами пчеловодства. Обнаружено репаративное действие у фенольного гидрофобного препарата прополиса, содержащего в своем составе комплекс фенольных соединений (флавоны, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и др.) и обладающего умеренной антиоксидантой активностью, желчегонным и противовоспалительным действием.

Установлено замедление образования продуктов перекисного окисления липидов при гепатите, вызванном тетрахлорметаном, спиртовым экстрактом пчелиной пыльцы. При Д-галактозаминовом гепатите показана активность препарата эплира, содержащего комплекс фосфолипидов и каротиноидов лечебной грязи.

Среди средств, стимулирующих процессы регенерации, есть ряд препаратов животного происхождения. Обычно это экстракты или гидролизаты ткани печени. Такие препараты состоят из многих высокомолекулярных компонентов, иногда обладают ферментативной активностью, нередко содержат низкомолекулярные вещества. Механизм их репаративного действия сложен, может иметь много различных звеньев, часть из которых представляет прямое активирующее влияние на процессы регенерации, а часть – опосредованное.

Активация синтеза белка препаратами животного происхождения может осуществляться за счет действия входящих в них веществ пептидной или нуклеиновой природы, обладающих соответствующими регулирующими свойствами. Стимуляция репаративных процессов некоторыми препаратами объясняется также включением их компонентов в синтезируемые соединения.

При этом по субстратному механизму усиливается новообразование ферментов, участвующих в синтетических процессах. Хотя, разумеется, возможны и другие механизмы действия средств животного происхождения.

В современной гепатологии из средств этой группы нашли применение такие препараты как витогепат, сирепар, вигератин и тропофар. Тропофар содержит полипептидные компоненты клеточных мембран гепатоцитов, экстрагированных из печени крупного рогатого скота. Как показали экспериментальные исследования и клинические наблюдения, лечебный эффект тропофара основан на его способности уменьшать повреждение структурных компонентов мембран гепатоцитов, стимулировать процессы протеинсинтеза, предупреждать цитолиз гепатоцитов (Оковитый С.В. и др., 2002).

Сирепар и витогепат представляют собой сочетание гидролизатов печени крупного рогатого скота и комплекса витаминов пластического обмена. Эти препараты при отравлении парацетамолом ослабляют продукцию диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, снижают проницаемость мембран гепатоцитов для поступления в кровь аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, усиливают секрецию желчи. Близкий по своему составу к этим препаратам вигератин содержит ещё и панкреатин – препарат поджелудочной железы.

Все перечисленные выше лекарственные средства эффективны при хроническом гепатите, циррозе печени и токсическом поражении органа.

Гепатопротекторная и антиоксидантная активность этих средств, по видимому, обусловлена наличием в их составе токоферолов, флавоноидов, цианокобаламина и других биологически активных веществ, оказывающих многостороннее положительное действие на печень.

В последние годы в качестве гепатопротектора стал активно применяться адеметионин (гептрал). Адеметионин представляет собой биологически активное вещество, входящее в состав всех тканей и жидких сред организма. Он участвует в реакциях трансаминирования как донор метильных групп, а также является предшественником тиоловых соединений (цистеин, таурин, глутатион и др.). Адеметионин обладает антидепрессивной активностью, которая проявляется постепенно, начиная с конца 1-й недели лечения. У больных с ипохондрической депрессией наблюдается регрессия симптомов заболевания. Препарат обладает также гепатопротекторной активностью. При его длительном применении отмечается улучшение показателей функции печени. У больных с алкогольным циррозом отмечено повышение содержания глутамина в печени, повышение концентрации цистеина и таурина в плазме и понижение метионина в сыворотке, что свидетельствует о нормализации метаболических реакций в печени (Бурбелло А.Т., Шабров А.В., 2007).

Анализируя все представленные данные, можно заключить, что существующие лекарственные средства для стимуляции процессов регенерации в печени не полностью удовлетворяют потребности клинической практики. Некоторые препараты обладают нежелательными побочными эффектами (стероидные анаболические средства). Другие пока мало изучены в гепатологии и дороги (гепатопоэтины). Многие средства, хотя и вполне безопасны, но не всегда достаточно эффективны (витамины, нестероидные анаболические средства). Лекарственные вещества – экстракты животного и растительного происхождения, содержащие высокомолекулярные вещества, – несут потенциальную опасность развития аллергических реакций.

Поэтому актуальным остаётся поиск новых высокоэффективных и безопасных гепатопротекторов и активаторов регенераторных процессов в печени (Шабанов П.Д., Калишевич С.Ю., 1998;

Шабанов П.Д. и др., 2008, 2011). Предпочтение здесь следует отдавать средствам, стимулирующим синтез нуклеиновых кислот и белка. Перспективно и изучение препаратов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. К ним можно отнести и новый препарат ропрен, получаемый путем хроматографической очистки из хвои ели Picea abies (L.) Karst. По сути, он представляет собой природный биорегулятор, или транспортный липид, который в печени быстро метаболи зируется в долихол, участвующий в гликозилировании мембранных белков и образовании гликопротеинов. Наибольшая скорость метаболизма долихолов наблюдается в печени, почках, селезенке. Выведение долихолов с желчью считается главным путем выведения их из организма.


Таким образом, ропрен может активно компенсировать нарушения метаболизма изопреноидов в организме. В клинической практике нарушения метаболизма изопреноидного пути наблюдаются довольно часто при раз личных нейродегенеративных заболеваниях ЦНС, органов желудочно кишечного тракта, иммунодефицитных состояниях, при таких заболеваниях как язвенный колит, алкогольный цирроз печени, гепатоцеребральная деге нерация печени, пептические язвы и заболевания пищеварительной системы, дегенеративные заболевания нервно-мышечной системы (остеопороз, остео артрит, спондилез). Кроме того, подобные нарушения отмечены у больных с тромбозом сосудов и закупоркой артерий, а также при иммунодефицитных состояниях, включая ревматоидный артрит и другие системные заболевания соединительной ткани. И, наконец, следует отметить, что долихолфосфатный цикл является необходимым метаболическим звеном в процессах регенера ции, дифференциации и пролиферации клеток (Scherer M.G., Waechter C.J., 1984;

Sakakihara Y., Volpe J.J., 1985;

Elmberger P.G. et al., 1987).

Все указанное позволило сформулировать цель второй части настоящей работы – изучение действия полипренолов (разных доз ропрена) при токсическом поражении печени и головного мозга, вызванного четыреххлористым углеродом, на функциональное состояние печени, поведение животных и метаболизм моноаминов в мозге крыс в сравнении с известным гепатопротектором адеметионином (гептралом).

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Методология экспериментального изучения различных компонентов двигательных и эмоциональных форм поведения у грызунов сводится, в пер вую очередь, к исследованию поведения животных в «открытом поле», аг рессивности, игрового поведения, функциональной асимметрии, реакций са мораздражения мозга через вживленные электроды в разных вариантах (пе дальная электростимуляция в камере Скиннера, самораздражение мозга в челночной камере) или условной реакции предпочтения места (условнореф лекторное подкрепление), использованию исследуемого фармакологического вещества в различных дозах для поведенческого (этологического) анализа.

Ниже приведено описание исследуемых препаратов и методических прие мов, использованных для изучения дофаминзависимых форм поведения крыс.

2.1. Выбор животных и их содержание Опыты выполнены на 306 крысах самцах Вистар массой 200-220 г, вы ращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в ус ловиях вивария кафедры фармакологии Военно-медицинской академии им.

С.М.Кирова. Температура воздуха поддерживалась в пределах 20-22°C, отно сительная влажность – 50–70%. Температура и влажность воздуха регистри ровались ежедневно. На карантине животных содержали в течение 10 дней.

В течение этого времени проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клет ках (заболеваемость и смертность). Животных содержали при свободном доступе к воде и пище. Все опыты проведены в осенне-зимний период.

2.2. Вживление электродов в дофаминергические структуры мозга Стереотаксические операции по вживлению электродов в мозг крысам проводили под нембуталовым наркозом (50 мг/кг) с использованием стерео таксического прибора фирмы «Medicor», Венгрия.

Рис. 4. Последовательные этапы проведения операции по вживлению электродов в мозг крысы Билатерально в латеральное гипоталамическое ядро вживляли нихро мовые монополярные электроды в стеклянной изоляции (диаметр электрода 0,25 мм, длина оголенного кончика 0,25-0,30 мм, его толщина 0,12 мм) по следующим координатам: АР = 2,5 мм назад от брегмы, SD = 2,0 мм лате рально от сагитального шва, Н = 8,4 мм от поверхности черепа (Knig K.P., Klippel A.A., 1963). Индифферентный электрод из нихромовой проволоки за крепляли на черепе животного. Все электроды коммутировались на микро разъеме, который фиксировался на черепе самотвердеющей пластмассой (рис. 4).

Поведенческие эксперименты начинали не ранее 10 дней после опера ции. По окончании всех опытов производили морфологический контроль ло кализации кончиков электродов на серии фронтальных срезов мозга, которые окрашивали по методу Ниссля, предварительно производили коагуляцию че рез вживленные электроды током силой 1 мА в течение 30 с (рис. 5).

Рис. 5. Фронтальный срез головного мозга крысы Стрелкой указана область вживления электрода в латеральный гипоталамус.

2.3. Методы самораздражения мозга у крыс Использовали классический вариант изучения самораздражения мозга в виде педальной самостимуляции в камере Скиннера (рис. 6).

Рис. 6. Реакция педальной самостимуляции у крыс в камере Скиннера Два верхних фото демонстрируют нативную методику самостимуляции, нижнее – схематическое ее изображение.

Через 10 дней после вживления электродов в мозг крыс обучали нажи мать на педаль в камере Скиннера для получения электрического раздраже ния мозга (прямоугольные импульсы отрицательной полярности, длительно стью 1 мс, с частотой 100 Гц, в течение 0,4 с, пороговые значения тока в ре жиме «фиксированных пачек»). Для повторного раздражения животное было вынуждено вновь нажимать на педаль. Частота и длительность нажатий ре гистрировались автоматически. Анализировали частоту и время каждого на жатия на педаль. На основании этих результатов вычисляли коэффициент «рассогласования» (Лебедев А.А., Шабанов П.Д., 1992) по формуле:

Т1 - Т К = ---------, где Т1 + Т К – коэффициент «рассогласования»;

Т1 – время нажатия педали после окончания стимуляции в случае длительных нажатий, по длительности больших, чем 0,4 сек;

Т2 – время от момента отжатия педали до окончания стимуляции.

Коэффициент «рассогласования» принимает значения от -1 до +1 и по казывает долю активации положительной и отрицательной подкрепляющей фазы самостимуляции (Шабанов П.Д. и др., 2002). Если данный коэффициент принимает положительные значения, то это означает, что крыса продолжала нажимать на педаль даже после того, как раздражение мозга прекратилось.

При отрицательных значениях коэффициента «рассогласования» крыса за канчивала нажимать на педаль раньше, чем прекратилась стимуляция мозга.

Учитывая, что реакцию самостимуляции можно рассматривать как одновре менное включение положительного и отрицательного механизмов подкреп ления, сдвиг в сторону увеличения и снижения коэффициента позволяет го ворить как об изменении частоты самостимуляции, так и об изменениях под крепляющих свойств мозга. Поэтому, как дополнительный критерий измене ния подкрепляющих свойств стимуляции, коэффициент «рассогласования»

является удобным показателем для оценки действия фармакологических пре паратов. Исследуемый препарат полипренолов вводили на 3-й день экспери мента и далее в течение 7 дней после стабилизации реакции при использова нии фиксированного значения силы тока. Регистрировали число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования» в течение 10 мин эксперимента, за тем производили внутрибрюшинную инъекцию препарата, и через 30 мин ре гистрировали те же показатели (число нажатий на педаль и коэффициент «рассогласования») за 15-минутный интервал времени.

При изучении подкрепляющих свойств электрической стимуляции мозга использовался свободный режим подкрепления, когда электрическая стимуляция мозга длится все время нажатия педали ( Петров Е.С., 1990). Ис пользование данного режима предполагает повышенный уровень нагрузки на подкрепляющие механизмы головного мозга и дает возможность выявлять отрицательную эмоциональную составляющую реакции самостимуляции, которая обычно следует после 0,5 с от начала раздражения и заставляет жи вотное отжимать педаль (как бы избегать ее) (Вартанян Г.А., Петров Е.С., 1989).

2.4. Исследование поведения крыс в «открытом поле»

Свободную двигательную активность животных исследовали в тесте «открытого поля» (Пошивалов В.П., 1977;

Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007), представляющего собой круглую площадку диаметром 80 см, ограниченную по окружности непрозрачными бортами высотой 30 см (рис. 7). По всей пло щади открытого поля равномерно расположены 16 отверстий (норок), диа метром 3 см каждая, предназначенных для выявления видоспецифического компонента исследовательской активности у грызунов (норковый рефлекс).

Освещенность открытого поля равнялась 100 лк. Во время опыта экспери ментальный вольер находился в специальной звукоизолированной комнате.

Продолжительность одного опыта составляла 3 минуты. На основании пове денческого атласа для грызунов (Пошивалов В.П., 1978;

Михеев В.В., Шаба нов П.Д., 2007) выбирался ряд элементарных двигательных актов и поз, со вокупность которых характеризует целостное поведение в «открытом поле».

Рис. 7. «Открытое поле» для изучения поведения крыс и основные паттерны их поведения Исходя из требований регистрации и математической обработки, каж дому отдельному элементарному акту присваивался определенный номер (код): 0 – «локомоция» (поступательное движение тела в горизонтальной плоскости);

1 – «обнюхивание» (принюхивание и повороты головы без суще ственных изменений координат корпуса в горизонтальной и вертикальной плоскостях). Этот акт может осуществляться в позах «сидя», «стоя», которые трудно различимы без потери его основного биологического значения, по этому при регистрации не разделялся в зависимости от позы, в которой он появлялся);

2 – «вертикальная стойка» (стойка на задних лапах в центре от крытого поля);

3 – груминг (все разновидности этой реакции);

4 – «непод вижность» (покой, сидение, визуально определяемая неподвижность живот ного обычно в позе «сидя» с подогнутыми конечностями и сгорбленной спи ной);

5 – «движение на месте» (изменение координат головы и корпуса в пределах условной окружности, центром которой являются задние конечно сти животного, координаты которых существенно не меняются. Достигается переступанием передних конечностей при опоре на задние);

6 – «заглядыва ние в норку» (норковый рефлекс);

7 – «стойка на стенку» (вертикальная стойка на задних лапах с упором передними на стенку вольера). Регистрация актов производилась нажатием экспериментальной клавиши, соответствую щей определенному поведенческому акту, на клавишном устройстве. Полу ченные данные обрабатывали математически с использованием персонально го компьютера.

2.5. Исследование функциональной асимметрии мозга с помощью метода ротации Число ротаций определяли в полусфере диаметром 30 см (рис. 8) че рез 30 мин после введения фенамина (2,5 мг/кг внутрибрюшинно) за два по следовательных периода по 10 мин, используя для анализа средние значения (определяемые за 10 мин). Регистрировали число полных вращений на 360о отдельно вправо и влево. В дальнейшем вычисляли разность между числом предпочитаемых и непредпочитаемых вращений. Если эта разность достига ла пяти, считали что животное удовлетворяет критерию ротации.

Рис. 8. Исследование ротационного поведения у крыс в ротометре Фиксировали также число неполных ротаций (от 90о до 360о), которые связаны со спонтаной двигательной активностью и отражают снижение чув ствительности к фенамину (Carter C.J., Pycock C., 1979). Для оценки чувстви тельности животного к фенамину в последние 10 сек каждой минуты тести рования в ротометре определяли также показaтель стереотипии по следую щей шкале: 0 – сидит спокойно;

1 – обычная (нормальная) двигательная ак тивность;

2 – прерывистая активность, включая частые принюхивания и стойки;

3 – непрерывная стереотипная активность с обнюхиванием и стойка ми;

4 – отчетливые стереотипные движения головой, двигательная актив ность падает;

5 – то же, крыса грызет и лижет пол;

6 – преобладают послед ние формы поведения (Сlark D., White F., 1987).

2.6. Исследование поведения крыс в приподнятом крестообразном лабиринте Поведение крыс в приподнятом лабиринте исследовали в установке, представлявшей крестообразный приподнятый лабиринт, который состоял из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрытых рукавов 50х10 см с отры тым верхом, расположенных перпендикулярно относительно друг друга (рис.

9).

Высота над полом 1 м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, время све шивания в отрытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Продол жительность теста составляла 5 минут.

Рис. 9. Приподнятый крестообразный лабиринт для крыс (общий вид и схе ма) 2.7. Исследование агрессии в тесте «чужак-резидент»

Агрессивность изучали у половозрелых крыс самцов в тесте чужак резидент в соответствии с описанием этологического атласа (Пошивалов В.П., 1986).

Рис. 10. Тест «чужак-резирент» у крыс Верхние снимки демонстрируют поведение животных, нижний рисунок – ха рактерную позу угрозы у крыс Смысл методики состоит в том, что к крупному самцу, постоянно на ходящемуся в клетке (резиденту) подсаживают более мелкое животное (чу жака). Регистрируют число поведенческих проявлений агрессивности и за щиты, а также общее число поведенческих актов, описывающих взаимоот ношение двух особей крыс.

Изучение внутривидового взаимодействия производили в тесте «чу жак-резидент» следующим образом (рис. 10). Подопытное животное – «рези дент» в течение часа находилось в клетке размерами 20x36x20 см, после чего к нему подсаживали на 5 мин второе животное – «чужака». «Чужаками» яв лялись крысы-самцы (30 животных) массой 170-180 г, т.е. заведомо меньших размеров, чем «резиденты», что создавало условия для зоосоциального до минирования последних. В процессе 5-минутного совместного пребывания «резидента» и «чужака», помещаемого в клетку только на время опыта, реги стрировали этограмму поведения «резидента» – общее число, последователь ность и длительность всех элементарных актов и поз, образующих внутриви довую общительность, агрессию, защиту и индивидуальное поведение. Об щительность включала в себя следующие дискретные акты: приближение, следование за партнером, обнюхивание партнера, груминг загривка или тела, наползание или подползание под партнера.

Агрессия проявлялась в виде вертикальных или боковых стоек (угроза) или атаки. Социальная пассивность выражалась различными актами индиви дуального поведения: локомоцией, обнюхиванием, аутогрумингом, движе ниями на месте, вертикальными стойками, неподвижностью.

2.8. Исследование антидепрессантной активности в тесте Порсолта Плавательный тест «отчаяния» Порсолта (Porsolt R.D., 1978) преду сматривает оценку двигательной активности крыс, помещенных в стеклян ный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 27±1оС (рис. 11).

Рис. 11. Плавательный тест Порсолта Животное помещают в цилиндр на 6 мин, регистрируют время актив ного и пассивного плавания и время иммобилизации. Увеличение активного плавания и уменьшение времени иммобилизации рассматривают как антиде прессантный эффект (Андреева Н.И., 2002).

2.9. Моделирование экспериментального подострого гепатоза Экспериментальный подострый гепатоз (токсическое поражение пече ни) моделировали внутрибрюшинным введением крысам 50%-ного раствора ССl4. Для приготовления матричного раствора брали 50 мл 100%-ного рас твора ССl4 добавляли к нему 50 мл стерильного оливкового масла, переме шивали и в дальнейшем вводили внутрибрюшинно по 0,4 мл/крысу 50%-ного раствора ССl4 (это соответствовало 1000 мг/кг ССl4) на 1-й и 4-й дни опыта. В связи с нарастающей гибелью экспериментальных животных (более 50%) дальнейшее введение ССl4 не производили. В целом, каждая крыса получила 2000 мг/кг ССl4 за опыт.

В соответствии с протоколом исследования все животные были разде лены на 7 групп, каждая из которых включала 10-14 крыс:

Группа 1 – получала внутрибрюшинно (в/бр) физиологический 0,9% ный раствор хлорида натрия;

Группа 2 – получала в/бр раствор ССl4 + физиологический раствор дней;

Группа 3 – получала в/бр ССl4 + полипренолы (2,2 мг/кг) в/бр ежеднев но 14 дней;

Группа 4 – получала в/бр раствор ССl4 + полипренолы (4,3 мг/кг) в/бр ежедневно 14 дней;

Группа 5 – получала в/бр раствор ССl4 + полипренолы (11,6 мг/кг) в/бр ежедневно 14 дней;

Группа 6 – получала в/бр раствор ССl4 + адеметионин раствор мг/кг в/бр на основе лиофилизата ежедневно 14 дней;

Группа 7 – получала в/бр раствор ССl4 + адеметионин раствор мг/кг в/бр на основе таблеток ежедневно 14 дней.

Тестирование поведения начинали на 14-й день через 0,5-1 ч после по следнего введения исследуемых веществ. Поведенческие тесты проводили в течение 2 последовательных дней.

Забой животных осуществляли на 16-й день опыта. После декапитации крыс производили взятие крови, печени и мозга (стриатум, прилежащее ядро и префронтальная кора).

В случае выпадения животных из опыта (гибель вследствие токсиче ского действия ССl4) группы дополняли новыми животными, опыт в этом случае смещался во времени, но его схема сохранялась.

2.10. Биохимическое исследование крови Для биохимического анализа кровь всех животных забирали в сухие стерильные пробирки на 16-й день опыта. Материал центрифугировали при 3000 об./мин. Сыворотку отбирали для дальнейшего биохимического анализа на общий белок, глюкозу, холестерол, креатинин, мочевину, -амилазу, лак татдегидрогеназу, триглицериды, общий билирубин, аспартат аминотрансферазу (АСТ), аланин-аминотрансферазу (АЛТ), связанный били рубин, щелочную фосфатазу, мочевую кислоту, креатин-фосфокиназу (КФК), фосфор, липопротеиды низкой плотности и -глютамилтрансферазу. Матери ал исследовали на биохимическом анализаторе Sapphire 400 (производства фирмы Sapphire, Япония) с использованием реактивов системы Randox (RANDOX Laboratories Ltd., United Kingdom).

2.11. Гистологическое исследование печени После окончания поведенческих исследований на 16-й день опыта жи вотных забивали путем декапитации, извлекали печень и ткань печени крыс фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, после чего материал проходил стандартную обработку в спиртах нарастаю щей концентрации (70-95%), ксилоле и парафине для изготовления гистоло гических препаратов с толщиной серийных парафиновых срезов 3-5 мкм. Для микроскопического исследования срезы окрашивались гематоксилином и эо зином.

Морфологическое исследование гистологических препаратов проводи ли при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS (Япония) в пяти полях зрения при увеличении 200.

Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокаме ры Leica DC320 (Япония).

Масштаб патологических изменений в дольке, учитывая ее строение в виде шестигранника, оценивался как: поражение 1/3, 1/2, 2/3 и 3/4 дольки.

Патогистологическая оценка изменений в печени была проведена по трехбалльной системе:

1 балл – слабо выраженные изменения в виде белковой гиалиново капельной и мелкокапельной жировой дистрофии в цитоплазме гепатоцитов, расположенных в периферических отделах долек (перипортально) с локали зацией ее в отдельных дольках в незначительном количестве гепатоцитов.

2 балла – умеренно выраженные изменения. Наблюдалась дискомплек сация (нарушение) балочного строения в периферических отделах долек в отдельных полях зрения с поражением 1/3-1/2 протяженности балок в дольке, появлялась мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов перипортально.

В центральных отделах долек гепатоциты не имели дистрофических измене ний, слабо выраженная лимфоцитарная инфильтрация портальных трактов.

3 балла – выраженные изменения, которые характеризовались пораже нием 2/3-3/4 гепатоцитов долек и локализовались перипортально. Развива лись гиалиново-капельная белковая дистрофия и мелкокапельное ожирение гепатоцитов, дискомплексация балочного строения, слабо выраженная лим фоцитарная инфильтрация портальных трактов, центральные отделы долек были сохранны.



Pages:   || 2 | 3 |
 

Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.