авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:     | 1 | 2 || 4 |

«Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Министерство сельского хозяйства Российской Федерации ФГОУ ВПО "Ульяновская ...»

-- [ Страница 3 ] --

По предложенной нами бактериологической схеме выделено 54 штамма Bordetella bronchiseptica. Отмечено, что чаще бордетеллы выделяются от кошек всех возрастов с другими системными неинфекционными и вирусными заболеваниями (аденовироз), а у котят с клиническими признаками бронхопневмонии и ринотрахеита в возрасте 3-5-ти недель. Получены штаммы и от животных без клинических проявлений.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Предлагаемая схема позволяет выделить культуру Bordetella bronchiseptica в течение 96 часов.

Литература 1. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. Справочник под редакцией М.

А. Сидорова. М., 206 с.

УДК 616: ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA ISOLATION OF PHAGES BORDETELLA BRONCHISEPTICA Е.Н. Семанина, Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев E.N. Semanina, Yu.B. Vasilyeva, D.A. Vasilyev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In the domestic veterinary and medical practice, the question selection bacteriophage bacteria Bordetella bronchiseptica, and their use for diagnostic purposes has not been studied. Addressing these issues is of great scientific and practical interest, since phage diagnosis infections is low-cost, economical and effective method. The aim of our work was to study the possibility of separating phages B.bronchiseptica from pets and using the induction of bacteria with ultraviolet rays.

Каждый день в мире появляются новые опасные инфекции, вследствие которых гибнут миллионы людей и животных. В отечественной ветеринарной и медицинской практике вопрос выделения бактериофагов бактерий Bordetella bronchiseptica и их применения с диагностической целью не изучался [3].

Разработка диагностики малоизученных инфекционных заболеваний, характеризующихся тяжелым течением, а нередко и летальным исходом, таких, как бордетеллёз является крайне актуальной. Зарубежные ученые занимались выделением фага бордетелл путём индукции ультрафиолетовым лучом из профага, находящегося в бактерии [4]. Способы получения бордетеллёзных фагов от животных не описаны в литературе.

Решение этих вопросов представляет научный и практический интерес, так как фагодиагностика инфекций является малозатратным, экономичным и эффективным методом.



Вследствие актуальности проблемы целью нашей работы явилось изучение возможности выделения фагов B. bronchiseptica от домашних животных и при помощи индукции бактерий ультрафиолетовыми лучами.

Работа проводилась в научно-инновационном исследовательском центре микробиологии и биотехнологии УГСХА.

Выделение фагов от животных. Для проведения экспериментов были использованы животные вивариев в количестве 4-х собак и 6-ти кошек в возрасте от 6 месяцев до 1,5 лет. Для исследования подбирали животных с клиническими признаками воспаления верхних дыхательных путей: выраженное угнетение, температурная реакция, чихание, кашель, выделения из носовых отверстий.

Для выделения фагов мы использовали методы взятия глубоких мазков из глотки, истечений из носовой полости от живых животных и исследования патматериала (трахеи) от павших животных. Эти методы были апробированы нами ранее для выделения B. bronchiseptica от животных.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Животных фиксировали при взятии проб из носовой полости в стоячем или сидячем положениях, удерживая голову одной рукой за кожную складку на шее, а другой – за челюсти. При взятии проб из глотки в стоячем или сидячем положениях, разводя челюсти руками или с помощью инструментов. При взятии материала от павшего животного брали трубку трахеи длиной 5-6 см с содержимым.

Для взятия материала из носовой полости и глотки использовали стерильные ватные палочки и мясо-пептонный бульон. Палочки помещали в носовые ходы или глотку животных и совершали несколько вращательных движений, касаясь внутренней стенки носовой полости или глотки.

Затем в каждую пробирку с 9 мл МПБ добавляли исследуемый материал и мл суточной культуры 5-ти штаммов B. bronchiseptica и подращивали в термостате при t 37°С в течение 3-х суток. Далее добавляли хлороформ для бактрицидного эффекта, интенсивно взбалтывали в течение 15 минут, центрифугировали при об/мин 15 минут. Потом стерильными пипетками отсасывали надосадочную жидкость в количестве 3-4 мл и помещали в стерильную пробирку. Центрифугат исследовали по методу стекающей капли. Для этого на мясопептонный агар газоном засевали B. bronchiseptica и наносили пипеткой фильтрат. Культивировали в течение 12-18 ч при t 37°С и оценивали результаты.

При исследовании патматериала мы измельчали его и далее действовали по вышеуказанной методике.

Выделение фагов индукцией бактерий при помощи УФЛ.

1й день: Посев газоном суточной культуры B. bronchiseptica, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1метра, экспозиция 5-7 минут. Помещение чашек в термостат (37С) на сутки.

2й день: Распределение шпателем бактерий по поверхности агара. облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1метра, экспозиция 7-10 минут.

Помещение чашек в термостат (37С) на сутки.

3й день: Распределение шпателем бактерий по поверхности агара. облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5метра, экспозиция 7-10 минут.





Помещение чашек в термостат (37С) на сутки.

4й день: смыв МПБ с чашек, помещение в пробирку со штаммами бордетелл, кроме исходного. Культивирование в термостате сутки.

5й день: обработка хлороформом 1:10 в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку. Метод стекающей капли на все штаммы.

Выделение фагов от животных Исследуемый Штаммы B.bronchiseptica (наличие фага +) материал B.br 1 B.br 7 B.br 214 IV 90 B.br 22-067 B.br. мелк.

Истечения из - - - - носа (n=2) Глотка (n=9) - - - - Трахея (n=1) - - - - Данные нашего эксперимента (см табл.) показывают, что при исследовании материала от живых животных (слизь из носа и глотки) получение фага не эффективно. При исследовании материала от павших животных (трахея) мы также не получили фаги B. bronchiseptica.

При облучении бактерий УФЛ нам удалось выделить фаги B. bronchiseptica.

На чашках Петри были обнаружены слабые зоны лизиса бактерий. Данные зоны располагались по пути стекания капель фаголизата.

Таким образом, из двух использованных нами методов, можно говорить об эффективности УФЛ при выделении бактериофагов из бактерий.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Литература 1. Адамс М. Бактериофаги. - М.: Медгиз, 1961. - 521 с.

2. Габрилович И.М. Лизогения. - Минск, 1970. - 72 с.

3. Mattoo, S., A. K. Foreman-Wykert, P. A. Cotter, and J. F. Miller. 2001. Mechanisms of Bordetella pathogenesis. Front. Biosci. 168-186.

4. Waldor, M. K., and J. J. Mekalanos. 1996. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science 272.

УДК 619: БАКТЕРИИ ВИДА BACILLUS MEGATERIUM – ВОЗБУДИТЕЛИ ПОРЧИ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ BACTERIA OF TYPE BACILLUS MEGATERIUM – ACTIVATORS OF DAMAGE OF FOOD STUFFS О.А. Трусова, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, Д.С Золотухин O.A. Trusova, N.A. Feoktistova, D.A. Vasiliev, D.S.Zolonukhin Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article literary data on pollution of food stuffs by bacteria of type Bacillus megaterium are analyzed, capable to cause damage of foodstuff.

Санитарно – микробиологические аспекты исследования продуктов питания широко представлены и отечественной и зарубежной литературе.

Микробиологические показатели продовольственных товаров зависят от исходной обсемененности, в первую очередь, термоустойчивыми бактериями, например, такими, как Bac. megaterium, так как увеличение срока хранения многих продуктов питания связано с их термической обработкой, с соблюдением мер предосторожности от повторного загрязнения.

Schonberg провел бактериологическое изучение причин порчи различных пищевых продуктов. Он установил, что среди выделяемых из пищевых продуктов микробных культур определялись и спорообразующие бактерии. В их числе чаще других были изолированы Bac. subtilis, Bac. mesentericus, Bac. megaterium и Bac.

cereus [6].

Rogers приводит результаты анализа микрофлоры, содер-жащейся в тесте, пшеничной муке и зернах пшеницы. Из образцов охлажденного теста и пшеничной муки выделены и идентифицированы 95 штаммов бацилл. Среди 53 штаммов, выделенных из охлажденною теста, 24 штамма - Вас. subtilis, 17 - Вас. cereus, 10 Вас. pumilis, 2 - Вас. licheniformis. Из пшеничной муки выделены Вас. pumilis - штаммов, Вас. subtilis - 10, Вас. brevis и Вас cereus - по два, Вас. coagulans, Вас.

licheniformis, Вас. rnegaterium - но одному. Из пшеницы выделили Вас. circulans - 6, Вас. subtilis - 3, Вас. cereus - 1, Вас. licheniformis - I штамм. Таким образом, иссле дованные продукты существенно отличались по числу и видам выделенных из них штаммов бацилл [6].

Kahalafallaet определял содержание спорообразующих бактерий в пробах молока буйволиц до и после термической обработки. Автор установил, что летом количество споровых бактерий в молоке этих животных больше, причем для проб, взятых в летнее время, был характерен и более широкий диапазон колебаний их численности. После термической обработки молока (60 мин при 100° С) сезонные Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии различия в содержании спорообразующих бактерий были значительно меньшими.

Важно и другое: если в сыром молоке из общего количества спорообразующих бактерий большинство составляли такие виды, как Вас. megateriurn, Вас. brevis, Вас.

subtilis, Вас. firmus, то после термообработки чаще обнаруживались Вас. subtilis, Вас.

coagulans, Вас. cereus.

Asnani и соавторами изолировал спорообразующие аэробные бактерии (Bac.

subtilis, Bac. megaterium) из плодов манго. Под влиянием этих бактерий ткань фруктов приобретает губчатое строение. Выделяющийся экссудат содержит бактерии, способствует развитию поражения. Из пшеничной муки выделен 1 штамм Bac. megaterium [6].

И.А. Еремина утверждает, что в молоке и молочных продуктах чаще всего встречаются Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus stearother-mophilus. Многие аэробные спорообразующие бактерии вызывают пороки молочных продуктов (горький вкус, преждевременное свертывание молока без повышения кислотности и др.) [2].

Результаты исследований Е.В. Глинской и Н.Ф. Пермяковой по изучению микрофлоры сырокопченых колбас промышленного производства свидетельствуют о том, что бактерии вида Bacillus megaterium выделяются наиболее часто. В ходе экспериментов авторами было изучено также влияние температурного фактора на биологические свойства и процесс спорообразования у бактерии вида Bacillus megaterium. Результаты исследований показали, что культивирование исследуемых штаммов при температуре +45 0С к споруляции не приводило, а лишь способствовало образованию внутриклеточных гранул, появлению инволюционных форм и различных типов колоний. Так, появление гранул наблюдалось у В.

megaterium через 20 часов культивирования. Штаммы В. megaterium образовывали изогнутые и S-образные формы клеток. При культивировании исследуемых штаммов в условиях повышенной температуры наблюдалось также образование нехарактерных для данных видов бацилл колоний: гладких, блестящих, часто слизистых, небольших размеров. Указанные адаптивные изменения являлись результатом приспособления микроорганизмов к новым условиям (повышенная температура) и реверсировали в исходную форму после прекращения действия вызвавшею их фактора. Выращивание исследуемых культур при температуре +16°С не сопровождалось образованием инволюционных клеточных форм, однако вызывало задержку роста (видимый рост на МПА наблюдался лишь через 90 часов культивирования) и спорообразования. Процесс споруляции у большинства исследуемых видов бацилл начинался лишь через 90-116 часов культивирования [3].

Прорастание спор проходит несколько стадий. Активация вызывается теплом, ионизирующим излучением, воздействием химических веществ и сопровождается повышением чувствительности к пусковым факторам, способствующим переходу к следующей стадии – инициации прорастания. Такими пусковыми факторами могут быть питательные компоненты – специфичные для спор разных видов и даже штаммов бактерий, поверхностно – активные вещества, ферменты, в частности лизоцим. Например, установлено, что пусковой фактор для прорастания спор Bac.

megaterium – добавление в среду аланина. В период инициации теряется устойчивость спор к факторам внешней среды и изменяются их рефракционные свойства;

они выделяют Сa- дипиколиновую кислоту и компоненты деполимеризованного нетидогликана. Споры Bac. megaterium после добавления в среду аланина через 2-3 минуты начинают поглощать кислород, т.е. усиливается обмен веществ [5].

Интенсивное спорообразование бактерий Bacillus наблюдается на пептонно – кукурузном агаре, на разведённом МПБ. Установлено, что число спорулирующих клеток бацилл Bac. megaterium 14581 в разведённом в 10 раз водой МПБ, а также на Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии пептонно-кукурузном агаре в результате инкубации в течение 95-120 ч достигает 95% и выше [4].

Штамм Bac. megaterium D440 обладает цитохромами b,a 4-a3, o;

а в состав дыхательной цепи штамма M входят цитохромы b,c,a,o. (Downs, Jones, 1975).

Различные виды споровых бактерий неодинаково относятся к источникам азота: одни лучше усваивают аммонийный азот, другие - хорошо потребляют азот нитратов, некоторые - нуждаются в аминокислотах. Типичные культуры Bac.

megaterium хорошо растут на среде с аммонийным источником азота, не нуждаются в аминокислотах и дополнительных факторах [6].

Установлена роль Mn в процессе спорообразования у Bac. megaterium. Mn необходим в качестве кофактора фосфатглицеромутазы, которая является строго зависимым ферментом, необходимым для процесса споруляции в нормальной питательной среде [6].

Изучению ИК-спектров клеток спорообразующих бактерий посвящено лишь несколько исследований, из которых только в работе Haynes (1958) сделаны попытки таксономического использования полученных спектров. На основании полученных результатов все исследуемые штаммы разных видов бацилл были разделены на две группы. Первая группа включала представителей видов, спектры клеток которых содержали полосу: Bac. cereus, Bac. megaterium [3].

Анализ публикаций показывает, что бактерии вида Bacillus megaterium широко распространены в пищевых продуктах, вызывают их порчу, а также недостаточно изучены, и, как следствие, могут быть опасны в плане возникновения пищевых отравлений.

Литература 1. Глинская Е.В., Пермякова Н.Ф. гетерогенность свойств бактерий рода Bacillus, выделенных из колбасных изделий //Фундаментальные исследования, 2004. №2, – С.123-125.

2. Еремина И.А. Микробиология молока и молочных продуктов. – Кемерово:

КТИПП, 2004. – С.15.

3. Жвирблянская А.Ю., Бакушинская О.А. Микробиология в пищевой промышленности. – М.: Пищевая промышленность, 1966. – С. 134.

4. Заварзин Г.А. Фенотипическая систематика бактерий: Пространство логических возможностей. – М.: Наука, 1974. – С.137.

5. Красильников Н.А. Определитель бактерий и актиномицетов. – М.-Л., Изд-во АН СССР, 1949. – С.56.

6. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ – Киев: Наукова Думка, 1982. – С.117-137.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619: ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВЫДЕЛЕННЫХ ФАГОВ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS SUBTILIS STUDYING OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF THE ALLOCATED PHAGES OF BACTERIA OF TYPE BACILLUS SUBTILIS Н.А. Феоктистова, А.Х. Мустафин, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев N.A. Feoktistova, A.H. Mustafin, A.I. Kakdirkaev, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article the characteristic is given to biological properties of phages of bacteria of type Bacillus subtilis (morphology of negative colonies, the spectrum of lytic action, lytic activity).

Изучение биологических свойств фагов проводили по методикам, предложенным М. Адамсом [1], А.С. Тихоненко [9], Т.Г. Чинашвили [10], И.М.

Габриловичем [3].

Целью наших исследований было изучение следующих свойств выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis:

- морфология негативных колоний, - спектр литического действия, - литическая активность.

Морфологию негативных колоний выделенных бактериофагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев по Грациа. Учет проводили через 24 часа инкубации при температуре 33 0С.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Изучение морфологии негативных колоний выделенных бактериофагов показало, что их можно сгруппировать в два типа негативных колоний [2]:

1 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0-2,5 мм в диаметре (фаги С-3, С-4, С-5, С-8, С-10, С-15, С-19 С-9, С-12, С-14, С-17, С-18, С- серии УГСХА);

2 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 2,6-4,0 мм в диаметре (фаги С-1, С-2, С-11, С-16, С-13, С-20, С-21 серии УГСХА).

Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили методом пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной И.М. Габриловичем [4], С.Н.

Золотухиным [7].

Для этого исследуемый бактериофаг засевали по методу агаровых слоев по Грациа, используя разведения 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10,чтобы на питательной среде сформировались отдельные негативные колонии. После 24-часового культивирования в термостате одну негативную колонию, расположенную от других не менее чем в 10 мм, отвивали бактериологической петлёй на мясопептонный бульон, туда же вносили индикаторную культуру Bacillus subtilis в количестве 0,2 мл.

Одновременно ставился контроль: мясопептонный бульон, засеянный индикаторной культурой Bacillus subtilis в количестве 0,2 мл. Пробирки культивировали в термостате при 33 0С в течение 5 часов. Полученный фаголизат прогревали в водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут и исследовали методом агаровых слоев по Грациа, затем отбирали негативную колонию идентичную исходной, с которой вновь проводили такую же операцию.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Таблица Морфология негативных колоний выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis № Бактериальная Наличие негативных колоний или лизиса культура Bacillus subtilis/ название фага.

Bacillus subtilis 61/ С- Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 1.

1 УГСХА ровными краями, 2,6-3,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 3/ С- 2. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с УГСХА ровными краями, 3,0-4,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 3П/ С 3. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 3 УГСХА ровными краями, 1,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 98/ С 4. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 4 УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 8/ С- 5. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с УГСХА ровными краями, 0,5-1,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 21/ С 6. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 6 УГСХА ровными краями, 1,0-1,3 мм в диаметре Bacillus subtilis 17/ С 7. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 7 УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 5 /С- 8. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 16 /С 9. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 9 УГСХА ровными краями, 1,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 32/ С 10. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 10 УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 10/ С 11. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 11 УГСХА ровными краями, 2,6-3,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 12/ С 12. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 12 УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 26/ С 13. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 13 УГСХА ровными краями, с зоной неполного лизиса по периферии, 6,0-8,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 23/ С 14. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 14 УГСХА ровными краями, 1,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 12 /С 15. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 15 УГСХА ровными краями, 1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 4/ С 16. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 16 УГСХА ровными краями, 2,6-3,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 19/ С 17. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 17 УГСХА ровными краями, 1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 4/ С 18. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 18 УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 31/ С 19. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 19 УГСХА ровными краями, 1,0-1,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 25/ С 20. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 20 УГСХА ровными краями, с зоной неполного лизиса по периферии, 3,0-3,5 мм в диаметре Bacillus subtilis 27/ С 21. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 21 УГСХА ровными краями, с зоной неполного лизиса по периферии, 2,6-3,0 мм в диаметре Bacillus subtilis 14/ С 22. Прозрачные негативные колонии, округлой формы с 22 УГСХА ровными краями, 2,0-2,5 мм в диаметре Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Спектр литической активности является одной из основных характеристик диагностического препарата фага. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры [1, 5].

Для изучения спектра литической активности селекционированных нами изолятов фагов было использовано 30 полевых и 5 штаммов бактерий Bacillus subtilis из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3- капли 18-ти часовой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут. Чашку делили бактериологическим карандашом на два сектора. На поверхность засеянной среды в первом секторе пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили исследуемый фаг и наклоняли, чтобы капля стекла, на второй сектор аналогичным образом наносили МПБ (для контроля), затем инкубировали при температуре 33 0С, оценку результатов проводили через 18 часов.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица Спектр литической активности выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis № Фаги Кол-во испытанных Из них Процент штаммов чувствительны к лизируемых фагу штаммов 1 С-1 УГСХА 35 13 37, 2 С-2 УГСХА 35 5 14, 3 С-3 УГСХА 35 5 14, 4 С-4 УГСХА 35 8 22, 5 С-5 УГСХА 35 13 37, 6 С-6 УГСХА 35 12 34, 7 С-7 УГСХА 35 7 20, 8 С-8 УГСХА 35 10 28, 9 С-9 УГСХА 35 8 22, 10 С-10 УГСХА 35 9 25, 11 С-11 УГСХА 35 11 31, 12 С-12 УГСХА 35 12 34, 13 С-13 УГСХА 35 17 48, 14 С-14 УГСХА 35 8 22, 15 С-15 УГСХА 35 10 28, 16 С-16 УГСХА 35 17 48, 17 С-17 УГСХА 35 6 17, 18 С-18 УГСХА 35 9 25, 19 С-19 УГСХА 35 3 8, 20 С-20 УГСХА 35 7 20, 21 С-21 УГСХА 35 8 22, 22 С-22 УГСХА 35 10 28, Анализируя данные таблицы 2, нужно отметить, что бактериофагов, лизирующих только один штамм, обнаружено не было, а максимальное количество штаммов (по 17) лизировали 2 сублилисных фага С-13 УГСХА и С-16 УГСХА. Все выделенные фаги обладали перекрестным лизисом. Совокупный процент лизиса субтилисных культур бактериофагами С-13 УГСХА и С-16 УГСХА составил 64,4 %.

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем максимальным разведением, в котором испытуемый Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако этот показатель относительный, так как активность фага зависит от различных условий, основными из которых являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят от физических свойств среды, ее химического состава, окружающей температуры и так далее. Поэтому активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях.

Культуры бактерий вида Bacillus subtilis для определения литической активности бактериофагов выращивали на стандартном мясопептонном бульоне в течение 18 часов.

Литическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методу Аппельмана и Грация [8].

Определение литической активности фага по методу Аппельмана: в ряд пробирок из нейтрального стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл бульона. В первую пробирку вносили 0,5 мл исследуемого протейного фага. Затем делали последовательные разведения, перенося отдельными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл бактериофага. Использовали 10 пробирок. Из последней пробирки 0,5 мл выливали в дезинфицирующий раствор, затем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. 11 и 12 пробирки являются контрольными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все 12 пробирок помещали в термостат при 33 0С на 18 часов. Титр фага устанавливали по последней прозрачной пробирке ряда и выражали разведением фага.

Также литическую активность определяли методом агаровых слоев.

Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица Литическая активность субтилисных бактериофагов по Аппельману и Грациа №/ Название Титр по Аппельману Титр по Грациа № бактериофага 10-6 3,5х 1 С-1 УГСХА 10-7 1,0х 2 С-2 УГСХА 10-6 2,2х 3 С-3 УГСХА 10-7 2,4х 4 С-4 УГСХА 10-6 2,0х 5 С-5 УГСХА 10-7 6,0х 6 С-6 УГСХА 10-6 4,0х 7 С-7 УГСХА 10-5 1,7х 8 С-8 УГСХА 10-6 2,4х 9 С-9 УГСХА 10-7 3,0х 10 С-10 УГСХА 10-7 1,0х 11 С-11 УГСХА 10-6 4,0х 12 С-12 УГСХА 10-8 2,8х 13 С-13 УГСХА 10-7 2,4х 14 С-14 УГСХА 10-6 4,0х 15 С-15 УГСХА 10-8 3,0х 16 С-16 УГСХА 10-6 1,5х 17 С-17 УГСХА 10-7 5,1х 18 С-18 УГСХА 10-6 3,0х 19 С-19 УГСХА 10-6 1,2х 20 С-20 УГСХА 10-6 2,0х 21 С-21 УГСХА 10-7 3,4х 22 С-22 УГСХА Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Согласно данных таблицы 3, нужно отметить, что выделенные субтилисные бактериофаги обладали разной литической активностью в диапазоне от 10 –5 до 10-8, оценивая ее по Аппельману. Максимальный титр - 10-8 - отмечен у бактериофагов С 13 УГСХА и С-16 УГСХА. Изученные фаги характеризовались различным спектром литической активности, оценивая ее методом агаровых слоев по Грациа. Он колебалась от 1,7х106 до 3,0х109. Максимальный титр был зафиксирован у бактериофагов С-13 УГСХА и С-16 УГСХА и составил 2,8х109 и 3,0х соответственно.

Анализируя результаты изучения биологических свойст выделенных нами фагов бактерий вида Bacillus subtilis, нужно отметить, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым субтилисным культурам обладали фаги С-13 УГСХА и С-16 УГСХА, лизировавшие по 17 из изучаемых штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, что равно 64,4 %. Литическая активность, определяемая по методам Аппельмана и Грациа, этих фагов была максимальной из 22 выделенных.. Учитывая вышеизложенные результаты, фаги С-13 УГСХА и С- УГСХА были выбраны нами для конструирования диагностического препарата, предназначенного для индикации и идентификации бактерий вида Bacillus subtilis в объектах санитарного надзора.

Литература 1. Адамс М. Бактериофаги. – М., 1961. – С. 26-121.

2. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов E. coli О124:В17 // Проблемы бактериофагии и биологии кишечных бактерий: Сб. кафедры микробиологии 1 Лен. Мед. ин-та им. акад. И.П.

Павлова. – Л.,1973. – С.53.

3. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // Основы бактериофагии. – Минск, 1973. – С.5 – 24.

4. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences //ЖМЭИ. – 1992. – №6. – С.10-12.

5. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. – Ульяновск. – 1988. – С.45.

6. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-184.

7. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореф. дис. … канд.

вет. наук. – М, 1994. – 20с.

8. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай, 1978. – С. 41-88.

9. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М.: Наука, 1968. – С. 89.

10. Чинашвили Т.Г. К механизму образования фагоустойчивых форм микроорганизмов // В кн.: Вопросы молекулярной генетики микроорганизмов. – М.,1968. – С.225.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619: ЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS CEREUS LYTIC ACTIVITY BACTERIOPHAGE BACILLUS CEREUS Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин N.A. Feoktistova, A.I. Kaldirkaev, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article results of researches on studying lytic activity bacteriophage Bacillus cereus are reflected.

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако этот показатель относительный, так как активность фага зависит от различных условий, основными из которых являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят от физических свойств среды, ее химического состава, окружающей температуры и так далее. Поэтому активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях.

Культуры бактерий Bacillus cereus для определения литической активности бактериофагов выращивали на стандартном мясопептонном бульоне в течение часов.

Литическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методу Аппельмана и Грация [1].

Определение литической активности фага по методу Аппельмана [2]: в ряд пробирок из нейтрального стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл бульона. В первую пробирку вносили 0,5 мл исследуемого протейного фага. Затем делали последовательные разведения, перенося отдельными пипетками из пробирки в пробирку по 0,5 мл бактериофага. Использовали 10 пробирок. Из последней пробирки 0,5 мл выливали в дезинфицирующий раствор, затем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной культуры. 11 и 12 пробирки являются контрольными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все 12 пробирок помещали в термостат при 33 0С на 18 часов. Титр фага устанавливали по последней прозрачной пробирке ряда и выражали разведением фага.

Также литическую активность определяли методом агаровых слоев по Грациа [3]. Накануне опыта по чашкам разливали 1,5 % мясопептонный агар. Перед использованием чашки подсушивали в термостате 15-20 минут. Индикаторные выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 33 0С на мясо пептонном бульоне. Стерильно подготовленный 0,7 % мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли и остужали до 46-48 0С. Исследуемый на наличие бактериофага субстрат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7 % мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5 % МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, затем чашки оставляли на горизонтальной Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии поверхности с приоткрытыми крышками на 30 минут до полного застывания агара, затем инкубировали в термостате при 33 0С в течение 18-20 часов.

Рис. Рост бактериофагов на мясо-пептонном агаре (метод Грациа) Результаты исследований представлены в таблице и на рисунке.

Литическая активность протейных бактериофагов по Аппельману и Грациа №/ Название Титр по Аппельману Титр по Грациа № бактериофага 10-6 5,0х 1 Ф-1 УГСХА 10-7 4,0х 2 Ф-2 УГСХА 10-6 8,6х 3 Ф-3 УГСХА 10-8 1,2х 4 Ф-4 УГСХА 10-6 2,8х 5 Ф-5 УГСХА 10-8 2,0х 6 Ф-6 УГСХА 10-6 6,4х 7 Ф-7 УГСХА Из данных таблицы, видно, что выделенные цереусные бактериофаги обладали разной литической активностью в диапазоне от 10–6 до 10-8, оценивая ее по Аппельману. Максимальный титр - 10-8 - отмечен у бактериофагов Ф-4 УГСХА и Ф-6 УГСХА. Изученные фаги характеризовались также различными показателями литической активности, оценивая ее по методу агаровых слоев. Диапазон показателей составил от 2,8х107 до 2,0х109. Максимальный титр был зафиксирован у бактериофагов Ф-4 УГСХА и Ф-6 УГСХА и составил 1,2х109 и 2,0х109 соответственно. Фаги с высокими показателями литической активности необходимо в дальнейшем подвергнуть более глубокому изучению, так как этот показатель чрезвычайно важен при создании экспериментального биопрепарата на основе бактериофагов Bacillus cereus.

Литература 1. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. – Ульяновск. – 1988. – С.45.

2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. – М.: Медгиз,1961. – С. 6-184.

3. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай, 1978. – С. 41-88.

УДК 619: Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619: ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS SUBTILIS ИЗ ОБЪЕКТОВ САНИТАРНОГО НАДЗОРА ALLOCATION OF BACTERIA OF TYPE BACILLUS SUBTILIS FROM OBJECTS OF SANITARY INSPECTION Н.А. Феоктистова, А.Х. Мустафин, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев N.A. Feoktistova, A.H. Mustafin, A.I. Kaldirkaev, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article the way of allocation of bacteria of type Bacillus subtilis from objects of sanitary inspection, a procedure of identification of data бацилл on some biological properties is described.

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий вида Bacillus subtilis из объектов санитарного надзора. В период с 2008 по 2010 годы было исследовано на наличие бактерий вида Bacillus subtilis 74 пробы пищевых продуктов, купленных на продовольственных рынках г. Ульяновска, г. Самары, г.

Геленджика, г. Сочи и г. Сенгилея.

Исследуемые пробы измельчали в ступке при помощи пестика, вносили в физиологический раствор в соотношении 1:10 и прогревали на водяной бане при температуре 70-75 0С в течение 30 минут.

Для выделения и идентификации бактерий группы Baсillus subtilis в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР разработана элективная питательная среда, которая имеет преимущества перед обычными средами, применяемыми для их изолирования [1].

Состав: глюкоза - 10 г., K2HPO4 – 1 г., NaCl – 0,1 г., MgSO4 х7H2O – 0,5 г., CaCl х 6H2O – 0,1 г., CuCl2 х 2H2O – 0,001 г., Na2MoO4 х 2H2O – 0,005 г., CoCl х 6H2O – 0,005 г., MnCl2 – 0,005 г., цитрат натрия – 0,5 г., d,l – – аланин – 2,5 г., d, l – валин – 2,5 г., полимиксин – 120 000 ед., водопроводная вода – 1000 мл.

Для приготовления среды мы использовали рабочие растворы, которые готовили заранее. Глюкозу использовали в 40 % - ной концентрации и стерилизовали при давлении 0,5 атм. Растворы двузамещенного фосфорнокислого калия, хлористого натрия, сернокислого магния (гидрата), хлористого кальция (гидрата) и цитрата натрия готовили в десятикратной концентрации по сравнению с прописью, стерилизовали при 1,5 атм. Отдельно готовили растворы микроэлементов:хлоной меди (гидрат), молибденовокислого натрия (гшидрат), хлористого марганца, где каждое вещество брали в десятикратном количестве. d, l – – аланин и d, l – валин использовали в 4%-ной концентрации. Растворы микроэлементов и аминокислот стерилизовали при 1,5 атм. В стерильную колбу наливали по 10 мл растворов солей, 10 мл раствора микроэлементов, 20-30 мл раствора глюкозы;

по 60 мл растворов d, l – – аланина и d, l – валина;

доводили объем смеси стерильной дистиллированной водой до 1л. Антибиотик полимиксин разводили стерильной дистиллированной водой и добавляли в среду в количестве 0.01-0,013 г/л непосредственно перед использованием. Срок хранения среды составлял пять-семь дней.

Элективную питательную среду разливали стерильно в пробирки по 5 мл и засевали по 0,1 мл. исследуемой пробы. Посевы помещали в термостат при 33 0С на четыре-пять дней. При наличии роста посевы прогревали при 70-75 0С в течение Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии мин. и делали высевы на агаризованные питательные среды для изолирования чистых культур. Прогревание выросших культур было необходимо, так как установлено, что в отдельных случаях на элективной среде наблюдается рост отельных штаммов Pseudomonas, которые при последующем высеве на твердые среды могут подавлять спорообразующие бактерии.

Выделенные культуры - грамположительные короткие палочки с закругленными концами и центрально расположенной спорой.

Рис. 1 – Бактерии вида Baсillus subtilis (рост на мясо-пептонном агаре) Видовую принадлежность культур устанавливали на основе определения морфологических и культуральных, биохимических свойств. Ферментативные свойства изучали у агаровых культур бактерий, выделенных из одного исследуемого материала, на наборе полужидких сред с углеводами и индикатором ВР, куда входят среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, мальтозой, а также на среде с лизином, среде с фенилаланином и т.п. В качестве дополнительных тестов определяли подвижность микроорганизмов. Посевы инкубировали при температуре 33-34 0С в течение 24-48 часов.

Выделенные нами подвижные культуры хорошо росли в среде с 7 % хлористого натрия, разлагали глюкозу, сахарозу, не разлагали лактозу, давали положительную реакцию при взаимодействии с сорбитом, маннозой и арабинозой, уреазой, маннитом;

не взаимодействовали с триптофандезаминазой, лизиндекарбоксилазой и фенилаланиндезаминазой;

разжижали желатин. Также мы наблюдали гидролиз крахмала и разложение казеина;

положительный результат реакции Фогеса-Проскауэра. Тест на лецитиназу не может считаться типовым, так как 55% культур давали положительный результат, а 45% - культур – отрицательный.

Полученные данные по изучению биохимических свойств выделенных нами бацилл были сравнены с результатами исследований биохимических свойств штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА. Выделенные нами из объектов санитарного надзора культуры обладают биохимическими свойствами, аналогичными свойствам музейных культур Bacillus subtilis (УГСХА).

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии В результате проведенных исследований нами было выделено объектов санитарного надзора 30 культур бактерий, которые мы типировали по ферментативным свойствам (на основании тестов, описанных в литературных источниках и результатах изучения биохимических свойств штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА) и отнесли к виду Bacillus subtilis.

Использование элективной среды для выделения бактерий вида Bacillus subtilis позволяет сократить сроки выделения культур, однако, мы считаем, что изучение биохимических свойств выделенных бактерий также обязательно, так как бациллы – это до сих пор малоизученная группа микроорганизмов.

Из данных таблицы видно, что источники выделения бактерий вида Bacillus subtilis различны: это мясо, мясной фарш, специи, молоко, мука, что говорит о широком распространении данных бактерий и их устойчивости к условиям окружающей среды.

Выделенные культуры бактерий вида Bacillus subtilis № Номер культуры и Место получения Объект выделения культуры п.п присвоенное название пробы Прод.рынок №1 - Bacillus subtilis 1. Перец черный г.Ульяновска №2 - Bacillus subtilis 2. Мускатный орех Прод.рынок г.Ульяновска Прод.рынок №3 - Bacillus subtilis 3. Кориандр г.Ульяновска №4 - Bacillus subtilis 4. Смесь специй для плова Прод.рынок г.Ульяновска №5 - Bacillus subtilis 5. Смесь специй для шашлыка Прод.рынок г.Ульяновска №6 - Bacillus subtilis 6. Мука пшеничная Прод.рынок г.Ульяновска Прод.рынок №7 - Bacillus subtilis 7. Мука пшеничная г.Самары №8 - Bacillus subtilis 8. Молоко коровье Прод.рынок г.Сенгилей №9 - Bacillus subtilis 9. Молоко коровье Прод.рынок г.Ульяновска №10 - Bacillus subtilis 10. Молоко коровье Прод.рынок г.Самары №11 - Bacillus subtilis 11. Мясной фарш Прод.рынок г.Ульяновска №12 - Bacillus subtilis 12. Лавровый лист Прод.рынок г.Сочи № 13 - Bacillus subtilis 13. Сухой чеснок Прод.рынок г.Геленджик № 14 - Bacillus subtilis 14. Смесь специй для мяса Прод.рынок г.Ульяновска №15 - Bacillus subtilis 15. Прод.рынок Перец черный г.Ульяновска №16 - Bacillus subtilis 16. Мясо свинина Прод.рынок г.Самары № 17 - Bacillus subtilis 17. Мясной фарш Прод.рынок г.Самары № 18 - Bacillus subtilis 18. Молоко коровье Прод.рынок г.Самары Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии №19 - Bacillus subtilis 19. Смесь специй для плова Прод.рынок г.Геленджик №20 - Bacillus subtilis 20. Лавровый лист Прод.рынок г.Ульяновска №21 - Bacillus subtilis 21. Мясо баранина Прод.рынок г.Самары №22 - Bacillus subtilis 22. Мясной фарш Прод.рынок г.Ульяновска №23 - Bacillus subtilis 23. Мясо говядина Прод.рынок г.Самары №24 - Bacillus subtilis 24. Мука пшеничная Прод.рынок г.Ульяновска №25 - Bacillus subtilis 25. Прод.рынок Перец черный г.Ульяновска №26 - Bacillus subtilis 26. Мука пшеничная Прод.рынок г.Ульяновска №27 - Bacillus subtilis 27. Корица Прод.рынок г.Самары №28 - Bacillus subtilis 28. Молоко коровье Прод.рынок г.Ульяновска №29 - Bacillus subtilis 29. Молоко коровье Прод.рынок г.Ульяновска №30 - Bacillus subtilis 30. Сухой чеснок Прод.рынок г.Сочи В последнее время исследователи обращают внимание на встречаемость в пищевых продуктах токсигенных культур этой группы, наличие у них факторов патогенности. Однако вследствие недооценки возможной роли бацилл в патологии человека и животных большинство авторов не исследовали токсичность выделенных культур.

Нами были проведены исследования по изучению патогенных свойств выделенных культур бактерий. Исследования проводились биопробой на белых мышах методом внутрибрюшинного введения 0,5 млрд. микробных клеток. Для этого использовали суточные бульонные культуры бактерий. Взвесями каждого вида бактерий заражали по три белых мыши. Культуру признавали патогенной в случае гибели двух или более мышей в течение трех суток после заражения и относили ее к возбудителям болезни. Из 30 протестированных штаммов – 34 % - культур были признаны патогенными, так как их воздействие на организм белых мышей было летальным, а после вскрытия изучаемая культура была выделена из ЖКТ мыши.

При исследовании 74 проб на элективной питательной среде нами было выделено 30 штаммов бактерий вида Bacillus subtilis, что составило 41 % случаев.

Этот показатель свидетельствует о высокой степени контаминации объектов санитарного надзора (на территории Ульяновской, Самарской областей и Краснодарского края) бактериями вида Bacillus subtilis, одна треть из которых обладает явно выраженными патогенными свойствами. Употребление в пищу продуктов, обсемененных бактериями вида Bacillus subtilis, может привести к пищевому отравлению.

Литература 1. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ – Киев: Наукова Думка, 1982. – С.106-107.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619: ПОИСК ФАГОВ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS SUBTILIS SEARCH OF PHAGES OF BACTERIA OF TYPE BACILLUS SUBTILIS Н.А. Феоктистова, А.Х. Мустафин, А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев N.A. Feoktistova, A.H. Mustafin, A.I. Kaldirkaev, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article ways of allocation of phages of bacteria of type Bacillus subtilis from objects of an environment, from a prophage, from cultures of bacteria Bacillus subtilis without influence on them of the inducing factor are described.

Первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги бактерий вида Bacillus subtilis из имеющихся 35 штаммов бактерий вида Bacillus subtilis. Мы рассчитывали обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью [2,3].

В первой серии опытов использовали методику, предложенную С. Лурия, Д.

Дарнеллом [4], для выделения бациллярных бактериофагов из бактерий без воздействия на них индуцирующего фактора.

Сущность методики: в 1,0 литровую колбу, содержащую 0,5 литра мясопептонного бульона, добавляли по 1,0 мл 18 часовых культур всех имеющихся у нас штаммов Bacillus subtilis. Колбу ставили в термостат при 33 0С на 24 часа. Затем смесь бактерий центрифугировали при 2000 об./мин в течение 30 минут, затем прогревали на водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут. Надосадочную жидкость исследовали на наличие фага методом агаровых слоев по Грациа [5] на имеющихся у нас штаммах Proteus.

Метод посева агаровыми слоями по Грациа. Накануне опыта по чашкам разливали 1,5 % мясопептонный агар. Перед использованием чашки подсушивали в термостате 15-20 минут. Индикаторные выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 33 0С на мясо-пептонном бульоне. Стерильно подготовленный 0,7 % мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли и остужали до 46-48 0С. Исследуемый на наличие бактериофага субстрат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7 % мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5 % МПА. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, чашки оставляли на горизонтальной поверхности с приоткрытыми крышками на минут до полного застывания агара, затем инкубировали в термостате при 33 0С в течение 18-20 часов.

В результате проведенных исследований было установлено, что выделение бактериофагов из культур бактерий Bacillus subtilis без воздействия на них индуцирующего фактора не приводило к появлению свободного фага.

Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, в течение 15, 30 и 45 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18,0 %, мощности которой приходится на область 254 нм.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Bacillus subtilis методом агаровых слоев по Грациа.

Проведя эти исследования, нам не удалось выделить бактериофаги бактерий вида Bacillus subtilis из имеющихся у нас штаммов бактерий Bacillus subtilis.

В наших исследованиях мы не обнаружили перехода профага в свободный фаг у имеющихся штаммов бактерий вида Bacillus subtilis по вышеизложенным методикам, поэтому дальнейшие исследования были посвящены выделению бактериофагов Bacillus subtilis из объектов внешней среды по методике Л.И.

Адельсона. Для проведения исследований мы брали пробы пищевых продуктов, почвы, сточных вод из частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей.

Сточные воды фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей. Навеску почвы разводили для исследований в соотношении 1:10 физиологическим раствором. Аналогично мы готовили для исследования пробы пищевых продуктов: первоначально пробу растирали в ступке при помощи пестика, затем делали разведения в соотношении 1:10 физиологическим раствором. В 1, литровую колбу, содержащую стерильный, МПБ в количестве 0,5 литра, вносили 50,0 мл фильтрата сточных вод или пробу почвы (пищевых продуктов) в концентрации 10-1 и по 1,0 мл всех имеющихся у нас штаммов бактерий Bacillus subtilis. Таким образом, каждая проба испытывалась на наличие фагов ко всем имеющимся культурам Bacillus subtilis. Колбу помещали в термостат и инкубировали в течение 24 часов при 33 0С. После этого содержимое колбы разливали в стерильные пробирки, центрифугировали при 1000 об./мин в течение 30 минут, затем прогревали в водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут. Исследуемые фильтраты исследовали методом агаровых слоев по Грациа. Чашки ставились в термостат на 18-20 часов при 33 0С. Наличие негативных колоний или зон лизиса на газоне роста индикаторной культуры свидетельствовало бы о присутствии в исследуемом материале бактериофага.

Негативные колонии отвивали в МПБ с индикаторными культурами. Для этого в две пробирки с 4,5 мл мясопептонного бульона (рН 7,4-7,6) добавляли стерильной пипеткой 0,2 мл 18 - часовой бульонной индикаторной культуры Bacillus subtilis. В одну из пробирок отвивали негативную колонию, а вторая пробирка служила контролем. Посевы помещали в термостат и инкубировали их при 33 0С до выраженного помутнения контроля. Затем содержимое опытной пробирки освобождали от микробных клеток прогреванием в водяной бане при 78-80 0С в течение 30 минут. Прогретый фильтрат переносили стерильной пипеткой в пробирку и использовали для проведения пассирования фага. Для получения чистой линии фага проводили до десяти пассажей из изолированных негативных колоний. В результате исследований 10 проб сточных вод, 32 проб почвы и 40 проб пищевых продуктов нам удалось по указанной схеме выявить 22 изолята фагов.

В ходе проведенных исследований бактериофаги субтилиса были выделены в 1 пробе пищевых продуктов (изучались специи, мясные и молочные продукты, мука, хлебобулочные изделия), 8 пробах сточных вод частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей и из 13 проб почвы, взятых в частных хозяйствах Ульяновской и Самарской областей.

Как показали результаты исследований, использование методики выделения бактериофагов из объектов внешней среды, разработанной Л.И. Адельсоном (1962), дало наилучшие результаты.

Литература 1. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам // Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии. – М., 1962. – С. 184-194.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии 2. Бабков В.В., Ленц Э.К. О лизогении среди энтеропатогенных кишечных палочек серологических групп О111: В4, О26:В6 и О124;

В17 // Проблемы бактериофагии и биологии кишечных бактерий: Сб. кафедры микробиологии 1 Лен. Мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова. – Л.,1973. – С.163.

3. Жугова Т.Ч. Бактериофаги Yersinia enterocolitica: // Автореф. дис. … канд.

биол. наук. – Минск, 1985. – 20с.

4. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология – М.: Мир,1970. – С.36-47.

5. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев: Урожай, 1978. – С. 41-88.

УДК 619: БАКТЕРИИ ВИДА BACILLUS MESENTERICUS – ВОЗБУДИТЕЛИ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЙ BACTERIA OF TYPE BACILLUS MESENTERICUS – ACTIVATORS OF FOOD POISONINGS Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина, Д.А. Васильев, И.Р. Хусаинов N.A. Feoktistova, M.A. Udina, D.A. Vasiliev, I.R. Husainov Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article literary data on infection of food stuffs with bacteria of type Bacillus mesentericus are analyzed, or the potato stick, capable to cause food poisonings the person.

В последнее время очень актуальным становится вопрос о здоровой и полезной пище, о способах самозащиты от недобросовестных производителей продуктов питания, о методиках «обезвреживания» еды. Популярные телевизионные передачи много рассказывают о некоторых микроорганизмах, контаминирующих пищевые продукты, названия которых на данных момент знакомы многим рядовым потребителям, например: сальмонелла, кишечная палочка, клостридия ботулинус. Но остается большая группа микроорганизмов, которая не так широко известна рядовому потребителю, но может привести его не только на больничную койку, но и «отправить на тот свет»….

Целью наших исследований является анализ данных по контаминации продуктов питания бактериями вида Bacillus mesentericus, или картофельной палочкой.

«Bacillus mesentericus представляет собой крупную грамположительную палочку с закругленными концами и спорой, расположенной в центре клетки. На мясо-пептонном агаре образуют колонии с морщинистой слизистой поверхностью.

По ферментативным свойствам имеет сходство с сенной палочкой (Bacillus subtilis), поэтому их объединяют в группу картофельно-сенных бацилл. Вегетативные клетки подвижны, грамположительны, образуют овальные споры, при этом клетки не раздуваются, а сохраняют свою цилиндрическую форму. Колонии желто-бурые, сухие, морщинистые. На поверхности жидких сред картофельная палочка образует мощную складчатую пленку, на ломтиках картофеля - складчатый налет (отсюда название). Желатину разжижает, молоко подщелачивает и пептонизирует, образует кислоту из глюкозы, сахарозы и мальтозы, крахмал не разлагает. Картофельная палочка широко распространена в природе (в почве, пищевых продуктах и пр.).

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Споры ее, попадая вместе с мукой или дрожжами в тесто, не погибают при выпечке хлеба и, прорастая, могут вызвать «тягучую», или «картофельную», болезнь хлеба (мякиш хлеба становится слизистым и тягучим, и хлеб приобретает неприятный запах)», - такую характеристику дают Bacillus mesentericus в энциклопедических словарях и на аналогичных сайтах.

Более подробную характеристику данного микроорганизма можно получить, проанализировав работы ученых – микробиологов за последние десятилетия.

Бактерии вида Вас. mesentericus – возбудители широко распространенной микробной порчи хлеба, называемой картофельной болезнью. Чаще ими поражаются хлебобулочные изделия из пшеничной муки, так как они имеют более низкую кислотность. Активно развивается при 30 - 40 °С в зерне, муке, хлебе. Резко ухудшает органолептические свойства хлеба. Споры картофельной палочки выдерживают нагревание до 109 - 113 °С в течение 45 мин, кипячение - нескольких часов. При помоле зерна бактерия попадает в муку. Ее развитие в тесте подавляют повышением кислотности (добавлением уксусной кислоты). Бурно развивается в мякише хлеба при медленном охлаждении после выпечки в условиях хранения при повышенной положительной температуре. Хлеб портится, мякиш становится липким и тягучим, приобретает неприятные запах и вкус. Разрушение хлеба и появление запаха происходят под действием выделяемых бактерией ферментов, гидролизующих белки и крахмал. Такой хлеб непригоден для употребления. Анализ статистических данных за 2000-2003 гг., проведенный Пельц О.В. с соавт., свидетельствует, что в связи с переходом мукомольных производств в России на отечественное продовольственное сырье, отмечается рост картофельной болезни хлеба – процент нестандартных проб в 2003 году вырос по сравнению с 2000 годом на 8,8 %. Также следует отметить, что в критериях оценки качества муки уровень загрязнения муки возбудителями картофельной болезни хлеба отсутствует. Также есть данные, что проблема картофельной болезни хлеба актуальна и для Казахстана [7].

Так, B.А. Мирзоева в своих работах неоднократно подчеркивала существенную роль Bacillus subtilis и Вас. mesentericus в порче молочных продуктов, кондитерских изделий, сахарных сиропов, консервов, зерновых, хлебных и других продуктов [6]. Ее мнение разделяли также C.П. Аскалонов и А. И. Ильченко, которые обращали внимание на то, что Вас. mesentericus может обсеменять различные пищевые продукты (хлеб, мясо и др.), вызывая нередко их порчу [1].

Вас. mesentericus относится к микроорганизмам, вырабатывающим протеолитические ферменты, которые расщепляют белок до конечных продуктов, поэтому называется «микробом гниения». Процесс психрофильного поверхностного гниения протекает в 5 фаз и, как известно, сопровождается сменой микроорганизмов. В первой фазе очень медленно развиваются бактерии рода Bacillus (Bacillus subtilis и Вас. mesentericus) [5]. Sofletea описал «размягчение колбасных изделий». Возбудителями этого процесса они называют бактерии группы Вас. mesentericus-subtilis, которые вызывали порчу колбасных изделий в течение двух - шести дней после изготовления [9]. Микробиологическое исследование большого количества проб мясного фарша провела Е. Динчева в Болгарии. При исследовании более 200 партий фарша установлено, что общее количество бактерий колебалось в пределах 106 - 1010 клеток/г. После хранения фарша при температуре 4° С в течение 48 ч количество бактерий увеличивалось в два - восемь раз. Спорообразующие аэробные бактерии - преимущественно Вас. mesentericus subtilis, Вас. pseudoanthracis (31,5% проб) - обнаружены в трети проб [9].

Проведенные нами исследования по изучению микробиологического пейзажа мяса (свинины, говядины, баранины), реализуемого на продовольственных рынках г.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Ульяновска, подтверждают вышесказанное – бактерии вида Вас. mesentericus выделены в 30 % случаев.

В состав остаточной микрофлоры мясных и мясо-растительных консервов входят бактерии вида Вас. mesentericus. Для выявления остаточной микрофлоры, способной развиваться, после стерилизации консервы подвергают косвенном) микробиологическом) контролю - 5- 10%-ной термостатной выдержке при 37°С в течение 10 сут. Если в консервах перед стерилизацией установлены повышенная общая микробная обсемененность, наличие спор анаэробных клостридий или термофильных аэробов возбудителей плоскокислой порчи, то они подлежат 100% ной термостатной выдержке. За это время сохранившие жизнеспособность споры микроорганизмов могут прорасти. Затем вегетативные формы их будут размножаться и вызовут порчу продукта, определяемую наружным осмотром (бомбаж или течь на лопнувших банках). Однако термостатная выдержка недостаточный критерий для заключения о промышленной стерильности консервов.


При длительном хранении консервов, подвергнутых термостатированию, иногда вновь выявляются бомбажные банки. Это объясняется, во-первых, тем, что температура термостатной выдержки (37°С) не является оптимальной для всех микроорганизмов остаточной микрофлоры консервов, среди которых много термофилов, активно проявляющих свою жизнедеятельность при более высоких температурах. Во-вторых, споры микроорганизмов, ослабленные стерилизацией, часто не успевают прорасти в течение 10 дней и проявляют свою жизнедеятельность значительно позже. Например, споры Вас. subtilis и Вас.

mesentericus споры прорастают при 37°С только после 20 - 27-дневной выдержки [5].

Объектом наших исследований также была группа мясных и мясо-растительных консервов, вырабатываемых различными производителями на территории Российской Федерации – бактерии вида Вас. mesentericus были выделены в 5 % проб.

О выделении бактерий из кондитерских изделий, пищевых дрожжей, консервов, хлебо-булочных изделий и даже алкогольных напитков бактерии группы Вас. mesentericus-subtilis сообщают Л. Ю. Медвинская, Kalember, Рахимберлина [9].

Они отмечают, что иногда даже большие количества этих бактерий могут не менять ни вкуса, ни запаха, ни цвета указанных пищевых продуктов. Проведенные нами исследования по изучению микробного пейзажа хлеба и хлебобулочных изделий, реализуемых на продовольственных рынках г. Ульяновска, подтверждают вышеприведенные данные – нами были выделены бациллы и идентифицированы как Вас. mesentericus в 37 5 случаев. Нередко спорообразующие аэробные бактерии определяются в порченых овощных и фруктовых консервах, и сахаре, кондитерских изделиях. А.Ю. Жвирблянская и О. А. Бакушинская указывают на широкое распространение Вас. subtilis-mesentericus в сахарном производстве [4].

Takacs изучал микрофлору испорченных консервов, включая слабокислые виды (консервированный зеленый горошек и кукуруза) и кислые (томаты, ананасы, персики и груши). Наиболее частой причиной порчи консервов являются термофильные спорообразующие аэробные и анаэробные бактерии и мезофильные бациллы, в их числе на первом месте Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Вас. polymyxa и Вас. macerans [9]. А. Я. Погодаева и Ч. Я. Овруцкая показали, что одной из причин, вызывающих порчу консервированных компотов, фруктовых и ягодных соков является инфицирование этих продуктов Вас. subtilis и Вас. mesentericus. Для предотвращения порчи авторы рекомендуют термическую обработку не ниже чем при 100° С в течение 10 мин. Однако присутствие в готовых консервах вышеназванных сапрофитных аэробных бацилл допускается при отсутствии бомбажа, сохранении нормальных органолептических показателей и нерарушенной герметичности банок [8].

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии Таким образом, приведенные данные литературы свидетельствуют о том, что спорообразующие аэробные бактерии группы Вас. subtilis-mesentericus достаточно часто обнаруживаются в различных пищевых продуктах, в том числе и в употребляемых в пищу без термической обработки.

Также бактерии вида Bacillus mesentericus – это контаминанты растительного сырья для производства косметических препаратов, к которым также относятся водно-спиртовые, пропиленгликолевые и масляные экстракты. Данное обстоятельство обуславливает необходимость поиска различных консервантов и их смесей при изготовлении и хранении разных типов растительных экстрактов.

Исследования Бурлаченко И.В. свидетельствуют, что бактерии вида Bacillus mesentericus являются одним из основных контаминантов корма для молоди осетровых рыб. На метаболитическом уровне хроническая интоксикация, вызываемая вышеуказанными микроорганизмами, приводит к разнонаправленным нарушениям водного и липидного обмена, угнетению синтеза балка и повышенному расходу энергии на нейтрализацию токсического действия: а в поддерживающем обмене – к нарушениям соотношения в утилизации белков и липидов, резкому снижению жизнеспособности рыб, особенно в неблагоприятных условиях [2].

Ряд авторов обращает внимание на встречаемость в пищевых продуктах токсигенных культур этой группы, наличие у них факторов патогенности. Однако, вследствие недооценки возможной роли бацилл в патологии человека и животных, большинство авторов не исследовали токсичность выделенных культур.

Пищевое отравление картофельной палочкой - это заболевание, связанное с употреблением неправильно произведенных, приготовленных или хранившихся пищевых продуктов. Как происходит заражение? Возбудитель передается при употреблении продуктов, где при благоприятных условиях массово размножились бактерии вида Вас. mesentericus. Как развивается пищевое отравление? Попавший с пищей в кишечник токсин нарушает баланс между выделением и всасыванием воды и солей. Избыток жидкого содержимого в просвете кишечника вызывает диарею.

Симптомы пищевого отравления - через 8-16 ч после употребления пищи, зараженной картофельной палочкой, появляются первые симптомы пищевого отравления в виде схваткообразных болей в животе и жидкого стула. Испражнения жидкие, водянистые, без каких-либо примесей. Иногда бывает рвота. Температура тела не повышается. Как распознать пищевое отравление? Вид пищевого отравления определяет врач-инфекционист с учетом пищи, которую заболевший человек ел накануне. Диагноз заболевания подтверждается при лабораторном обнаружении в остатках пищи большого количества картофельной палочки. Чтобы избежать пищевого отравления, следует тщательно обрабатывать пищевые продукты, соблюдать санитарно-гигиенические правила для предотвращения загрязнения готовой пищи, обязательно хранить еду в холодильнике.

Литература 1. Аскалонов С.Л., Ильченко А.И. Пищевые заболевания, вызываемые спорообразующими аэробными бактериями Вас. mesentericus и Вас.cereus // Вопросы питания. – Киев:Госмедиздат УССР, 1962. – С.226-229.

2. Бурлаченко И.В. Теоретические и прикладные аспекты повышения резистентности осетровых рыб в аквакультуре: дисс. док. биол. наук: 03.00.10.

- М., 2007. – 319с. РГБ ОД, 71:07 – 3/190.

3. Динчева Е. Микробиологическое изучение мясного фарша //Научные труды Высшего ветеринарно-медицинского института. – 1970, №22. – С.139-146.

4. Жвирблянская А.Ю., Бакушинская О.А. Микробиология в пищевой промышленности. – М.: Пищевая промышленность, 1966. – С. 134.

5. Итоги науки и техники: микробиология. – М.: ВИНИТИ, 1989. – Т. 22. – С.142 153.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии 6. Мирзоева В.А. Бактерии группы сенной и картофельной палочек (Вас. subtilis и Вас. mesentericus). – М.:Изд-во АН СССР, 1959. – 176с.

7. Пельц О.В., Долгушина Е.Я., Аксенова Н.Н., Ковалева Л.М., Костюкова Е.В.

Гигиеническая оценка контаминации муки возбудителями картофельной болезни //Медицина в Кузбассе, спецвыпуск. – 2003, №5. – С.74-75.

8. Погодаева А.Я., Овруцкая Ч.Я. Микрофлора, вызывающая порчу консервированных компотов и фруктово-ягодных соков из местного сырья//Физиология и биохимия микробов. – Минкс: Наука и техника, 1970. – С.116-120.

9. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ – Киев: Наукова Думка, 1982. – С.117-120.

УДК 619: ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS MESENTERICUS ИЗ ОБЪЕКТОВ САНИТАРНОГО НАДЗОРА ALLOCATION OF BACTERIA OF TYPE BACILLUS MESENTERICUS FROM OBJECTS OF SANITARY INSPECTION Н.А. Феоктистова, М.А. Юдина, Д.А. Васильев, И.Р. Хусаинов N.A. Feoktistova, M.A. Udina, D.A. Vasiliev, I.R. Husaunov Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture In article the way of allocation of bacteria of type Bacillus mesentericus from objects of sanitary inspection, a procedure of identification of data бацилл on some biological properties is described.

Контаминация пищевого сырья и продуктов питания патогенными бациллами, в том числе и Bacillus mesentericus, на этапах технологического процесса – это серьезная проблема не только переработчиков, но и медиков. Бациллы – это почвенные микроорганизмы, имеющие плотную оболочку, не разрушаемую ни воздействием высоких и низких температур, ни применением в качестве консервантов для сохранения продуктов питания, высоких концентраций соли и сахара. Бациллы, в том числе и Bacillus mesentericus, при обсеменении сырья и продуктов питания не значительно изменяют их органолептических свойств, поэтому определить их наличие не всегда возможно до тех пор, пока не появятся симптомы интоксикации. Пищевые токсикозы, вызванные бактериями вида Bacillus mesentericus, характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход.

В настоящее время лабораторная диагностика пищевых отравлений, вызываемых вышеназванными бациллами, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятой схеме – изучение морфологических, тинкториальных и биохимических свойств выделенных микроорганизмов.

За период с мая по сентябрь 2010 года изучалось распространение бактерий вида Bacillus mesentericus в пищевых продуктах.

Питательные среды, использованные для исследований - мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среда для выделения и культивирования Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии сибиреязвенного микроба (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда пептонная с глюкозой по ГОСТ 10444.1-84, агар Хоттингера (pH 7.4), кровяной агар, среда Гисса с маннитом, среда Гисса с лактозой, среда Гиса с сахарозой, среда Гисса с мальтозой, среда Гисса с глюкозой, среда Мосселя (основанная на лецитиназной активности микроорганизма и не способности усваивать маннитол, а элективность обеспечивается добавлением полимиксина), среда Донована, молочный агар, картофельный агар, кровяной агар, желточно-солевой агар;

реактивы для окраски по Граму, физиологический раствор.

Было происследовано на наличие бактерий вида Bacillus mesentericus 60 проб пищевых продуктов:

- 40 проб специй, закупленных на продовольственных рынках г. Ульяновска, - 10 проб муки, - 10 проб грунтовых овощей (огурцы, томаты, баклажаны, кабачки).

Данные пробы пищевых продуктов имели следующее обозначение в журнале протоколов опытов и, соответственно, на пробирках обозначались арабскими цифрами:

- 1-40 пробы специй, - 41-50 – пробы муки, - 51-60 – пробы грунтовых овощей.

Схема исследования проб пищевых продуктов: брали 1 г продукта и при необходимости измельчали в ступке при помощи пестика, далее заливали 9 мл мясо-пептонного бульона (1:10). Затем из этой суспензии после 3-х минутного осаждения из надосадка отбирали 1 мл и добавляли 19 мл мясо-пептонного бульона (1:20).

Исследовали по двум схемам.

Первая схема - прогрели на водяной бане 30 мин (t 66-70°C) исследуемый материал и сразу же делали посев газоном на чашки Петри с приготовленными и разлитыми в них питательными средами (среда Донована, среда Мосселя, среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба). Ставили в термостат на 18 часов для культивирования при температуре 33°С.

Схема 2 - приготовленные суспензии в разведении 1:10 и 1:20 выдерживали в термостате (33°C) 6 часов, прогревали на водяной бане 30 мин (t 66-70°C). Затем делали посев штрихом на чашки Петри с приготовлеными питательными средами (среда Донована, среда Мосселя, среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба).

Оценка результатов посевов на чашки Петри в обоих случаях делалась через 12 часов инкубирования в термостате (33°C).

Оценка результатов велась на основании характеристики, полученной из литературных данных. Bacillus mesentericus представляет собой крупную грамположительную палочку с закругленными концами и спорой, расположенной в центре клетки. На мясо-пептонном агаре образуют колонии с морщинистой слизистой поверхностью. По ферментативным свойствам имеет сходство с сенной палочкой (Bacillus subtilis), поэтому их объединяют в группу картофельно-сенных бацилл. Вегетативные клетки подвижны, грамположительны, образуют овальные споры, при этом клетки не раздуваются, а сохраняют свою цилиндрическую форму.

Колонии желто-бурые, сухие, морщинистые. На поверхности жидких сред картофельная палочка образует мощную складчатую пленку, на ломтиках картофеля - складчатый налет (отсюда название). Желатину разжижает, молоко подщелачивает и пептонизирует, образует кислоту из глюкозы, сахарозы и мальтозы, крахмал не разлагает.

Выделенные в результате исследований бациллы были проверены по морфологическим, тинкториальным, биохимическим свойствам и получены Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии следующие результаты.

Все выделенные бактерии – это грамположительные тонкие палочки, располагаются одиночно, в виде нитей или цепочек. Размер клеток 0,5-0,7 х 3-4 мкм.

Они содержат овальные споры, не превышающие в поперечнике ширины микробной клетки.

Нами отбирались колонии, которые на плотной питательной среде образовывали колонии мучного цвета, мелко складчатые. На мясо-пептонном бульоне культуры Bacillus mesentericus растут в виде морщинистой пленки. Поэтому для исследований были взяты колонии, которые на мясо-пептонном бульоне образовывали морщинистую пленку.

Таким образом, для дальнейшего изучения биохимических свойств были отобраны 5 выделенных штаммов бактерий, которые по тинкториальным и морфологическим свойствам сходны с описанием бактерий вида Bacillus mesentericus.

Результаты исследований проб пищевых продуктов №/ объект Биохимические тесты лецитиназ № выделе Сахароза мальтоза желатин крахмал гемолиз глюкоза лактоза маннит молоко пр ния о а бы 5 Смесь + + + + + + - + + + перцев 27 Мак + + + + - + - + + + 56 Томаты + + + + + + - + + + 44 Мука + + + + + + - + + + 48 Мука + + + + + + - + + + Комплексное изучение морфологических, тинкториальных и биохимических свойств выделенных бактерий свидетельствует, что из 60 исследованных проб пищевых продуктов, 5 – контаминированы бактериями вида Bacillus mesentericus.

На метаболитическом уровне хроническая интоксикация, вызываемая вышеуказанными микроорганизмами, приводит к разнонаправленным нарушениям водного и липидного обмена, угнетению синтеза балка и повышенному расходу энергии на нейтрализацию токсического действия: а в поддерживающем обмене – к нарушениям соотношения в утилизации белков и липидов, резкому снижению жизнеспособности, особенно в неблагоприятных условиях.

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии УДК 619: РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ УСКОРЕННОЙ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ ВИДА E.FAECALIS С ПОМОЩЬЮ РНФ A WORKING OUT OF THE FACTORS OF INDICATION OF THE BACTERIA E.FAECALIS USING OF THE REACTION OF THE INCREASE OF THE TITRE OF THE PHAGE Е.Н. Ковалева, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев E.N. Kovaleva, S.N. Zolotukhin, D.A. Vasiliev Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновской ГСХА The research innovation centre of microbiology and biotechnology Ulyanovsk state academy of Agriculture The technological parameters of the increase of the titre of the phage using phage EF – 4 and EF – 5 significantly reduce the time of the indication of homologous bacteria in the test sites.

В настоящее время исследователи уделяют большое внимание разработке простых и надежных методов индикации различных патогенных бактерий в объектах внешней среды. Бактериофаги могут быть использованы для обнаружения возбудителя без выделения чистых культур – в реакции нарастания титра фага (РНФ).

Сущность РНФ заключается в том, что, если в исследуемом материале присутствует искомый возбудитель, то добавленный к такому материалу гомологичный фаг, вступив во взаимодействие с ним, размножится, и последующее увеличение концентрации свободного внеклеточного фага укажет на присутствие в исследуемом материале гомологичного возбудителя. Целью исследования была разработка параметров ускоренной индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды с помощью реакции нарастания титра фага.

Объектами исследования являлись энтерококковые бактериофаги EF – 4 и EF – 5 серии УГСХА, выделенные нами из объектов внешней среды.

В качестве индикаторного использовали штамм E.faecalis, полученный из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА № 189.

Реакцию нарастания титра фага для индикации бактерий вида E.faecalis в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом [2], С.Н. Золотухиным [1].

Определение количественного показателя РНФ Для определения уровня нарастания титра, при котором РНФ можно считать положительной, были проведены эксперименты по обнаружению культур E.faecalis разных заражающих концентраций (от 105 до 101 м.к./мл) в мясопептонном бульоне.

Установлено, что результат реакции является положительным, т.е.

увеличение количества корпускул фага EF – 4 УГСХА более чем в 5 раз, в пробах, при контаминации мясопептонного бульона бактериями E.faecalis в концентрации 103 м.к./мл, для фага EF – 5 УГСХА – при контаминации мясопептонного бульона бактериями E.faecalis в концентрации 104 м.к./мл.

Установление оптимального времени РНФ В разработку оптимальных условий постановки реакции входит установление времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие бактериофага с бактериями. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

Том 3. Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, 16, часов при температуре 37оС, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37оС;

увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 10, 16, 24 часов при температуре 37оС.

В результате исследований было установлено, что после предварительного подращивания исследуемого материала в течение 5 часов удалось обнаружить энтерококки, гомологичные фагу EF – 4 УГСХА в концентрации 102 м.к./мл, фагу EF – 5 УГСХА – 103 м.к./мл (табл. 1,2).

Таблица Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала с фагом EF – 4 УГСХА Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл Время на Время контакта, 101 102 103 104 105 исследование, часов часов Результат РНФ 5 – + + + + 16 + + + + + 24 + + + + + Таблица Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала с фагом EF – 5 УГСХА Концентрация индикаторной культуры, м.к./мл Время на Время контакта, 101 102 103 104 105 исследование, часов часов Результат РНФ 5 – – + + + 16 – + + + + 24 + + + + + Увеличение времени предварительной инкубации до 16 часов повысило чувствительность РНФ на один порядок для обоих фагов. Подращивание материала при 24-часовой экспозиции существенно не повлияло на результаты РНФ.

Во второй серии опытов изучали чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагами.

В результате проведенных исследований было установлено, что при инкубировании материала в течение 7 часов бактерии были обнаружены с помощью РНФ гомологичными фагами EF – 4 УГСХА и EF – 5 УГСХА в концентрации 102 и м.к./мл исследуемого материала соответственно. Увеличение времени контакта материала с фагами позволило обнаружить исходные бактерии в концентрации 10 всеми фагами. 16 и 24-часовой контакт исследуемого материала с фагами не повлиял на чувствительность РНФ (табл. 3,4).



Pages:     | 1 | 2 || 4 |
 

Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.