авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
-- [ Страница 1 ] --

Материалы международной

научно-практической конференции

«Бактериофаги:

Теоретические и практические аспекты

применения в медицине, ветеринарии

и пищевой

промышленности»

Том I

Ульяновск - 2013

Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Тео-

ретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой про-

мышленности» / - Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. I - 184 с.

ISBN 978-5-905970-14-6 Редакционная коллегия:

д.б.н., профессор Д.А. Васильев д.б.н., профессор С.Н. Золотухин д.б.н., А.В. Алешкин Технический редактор Д.Н. Хлынов Авторы опубликованных статей несут ответственность за достоверность и точ ность приведенных фактов, цитат, экономико-статистических данных, собственных имен, географических названий и прочих сведений, а также за разглашение данных, не подлежащих открытой публикации.

Отпечатано в типографии «Ульяновской ГСХА им. П.А.Столыпина»

432063, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

© ФГбОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», Биология фагов Биология фагов УДК 578. СИСТЕМНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ФАГОВЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПЕПТИДОГЛИКАНГИДРОЛАЗ, НОВОГО КЛАССА АНТИСТАФИЛОКОККОВЫХ ЭНЗИБИОТИКОВ Абаев И.В., кандидат медицинских наук, тел. 7(4967) 36-00-03, abaev@obolensk.org Скрябин Ю.П., тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org Печерских Э.И., тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org Шишкова Н.А., кандидат биологических наук, тел. 7(4967) 36-00-03, info@obolensk.org Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор, тел. 7(4967) 36-00-79, svetoch@obolensk.org ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Ключевые слова: пептидогликангидролазы, эндолизины, аутолизины, бактериаль ный лизис, стафилококки.

Работа посвящена анализу известных структурных типов бактериальных и бакте риофаговых пептидогликангидролаз, рассматриваемых в качестве основы для разработки перспективных антистафилококковых препаратов, прежде всего, против антибиотикоре зистентных штаммов. ункциональные характеристики доменов пеп.

тидогликангидролаз позволяют создание рекомбинантных белков узконаправленного спектра действия против одного или более родов грамположительных бактерий, например, только стафилококков и стрептококков.

Патогены с множественной лекарственной устойчивостью являются актуальной про блемой здравоохранения во всем мире. Бактериальные и бактериофаговые пептидогликанги дролазы (ПГ) в виде очищенных рекомбинантных белков способны убивать грамположитель ные бактерии в результате осмотического лизиса и оцениваются как новый класс антибактери альных веществ, расщепляющих различные ковалентные связи пептидогликана бактерий. ПГ представляют собой потенциальный источник нового поколения антимикробных препаратов для лечения лекарственно-устойчивых форм возбудителей.

ПГ разрушают пептидогликан - основной компонент бактериальной стенки [1]. Ха рактерными свойствами ПГ по сравнению с другими возможными источниками новых анти бактериальных препаратов являются ) низкая вероятность возникновения резистентности па ) тогенов к ПГ, b) узкий спектр литического действия – способность разрушать только целевые бактерии, c) эффективный лизис бактериальных биопленок.

Фаговые ПГ (эндолизины) - продукт ко-эволюция бактерий и фагов. Выживание фага основывается на его способности деградировать пептидогликан и высвобождать новые фа говые частицы. Аналогично, бактериальные ПГ (аутолизины) необходимы для обеспечения Биология фагов процессов роста клеточной стенки, деления клеток, споруляции самой бактериальной клетки.

Случаи возникновения бактериальной устойчивости к эндолизинам не были выявлены, не смотря на неоднократные попытки [2]. Вполне вероятно, что ко-эволюция бактерий и фагов сделала мишенью ПГ неизменяемые связи пептидогликана.

Родо – или даже видоспецифичность ПГ по отношению к патогенам позволяет целе направленно воздействовать только на инфекционный агент, не затрагивая широкий спектр сопутствующей микрофлоры. Специфичность ПГ позволяет избежать многих ошибок, свя занных с использованием антимикробных препаратов широкого спектра действия, которые приводят к селекции резистентных штаммов не только у целевого возбудителя, но и у коммен салов, на которые препарат воздействует. Согласно рекомендациям ВОЗ для снижения уровня распространения антибиотикорезистентности следует избегать воздействия антибиотиков ши рокого спектра действия на бактериальные сообщества комменсалов. ПГ, вследствие родовой и видовой специфичности, выгодно отличаются в этом отношении от антибиотиков.

Высокая степень резистентности к антибактериальным препаратам многих возбуди телей и понижение их восприимчивости к фагоцитозу, как известно, обусловлена множествен ными изменениями в клетках патогена, сопровождающими рост биопленки. Благодаря фикси рованным формам бактериальных колоний, биопленки могут закрепляться на поверхности ме ханических или протетических устройств, или прикрепляться к слою клеток млекопитающих.

Бактерии в биопленке могут быть на несколько порядков более устойчивыми к воздействию антибиотиков, чем в жидкой культуре [3]. Использование ферментов, способных разрушать биопленки, делает более эффективным лечение стафилококковых инфекций [4]. Для стафило кокковых ПГ показана эффективная способность разрушать биопленки S. ureus [5].

Перечисленные характеристики стафилококковых ПГ во многом определяются мо дульной структурой этих ферментов. По локализации гены стафилококковых ПГ разделяют на два типа: 1) гены эндолизинов, которые входят в состав фагов/профагов, 2) гены аутолизинов, которые локализуются в бактериальной хромосоме и плазмидах. Эндолизины и аутолизины обладают доменной структурой: один-два каталитических домена и субстрат-связывающий домен, который может быть в нескольких повторах. Организация доменной структуры имеет различные варианты по составу и локализации доменов.

По каталитической активности выделяют три основных класса ПГ стафилококков, способные расщеплять пептидные, амидные или гликозидные связи пептидогликана. Со ответственно, выделяют эндопептидазные, амидазные и гликозаминидазные каталитиче ские домены [1]. Каждый каталитический домен состоит из коротких последовательностей в 100-200 аминокислот. Среди субстрат-связывающих доменов наиболее часто встречаются два типа: SH3_5 домен и LysM домен. Для эндолизинов наиболее характерны три основных типа структуры – ) -концевая эндопептидаза (цистеин-гистидин-зависимой амидогидро ) -концевая лазы (CHAP) (pfm 05257;

GO:0008745)), второй каталитический домен – амидаза-2 (pfm 01510;

GO:0008745), и С-терминальный 3_5 домен (pfm0840);

) -концевая эндопеп 3_ _ _5 ) -концевая тидаза (CHAP) и С-терминальный SH3b_5 домен;

c) -концевая эндопептидаза (CHAP) и домен гликозаминидазы (cl00743). Отсутствие в составе ряда опубликованных эндолизинов С-терминального 3_5 домена, возможно, связано со сложностями идентификации нестан 3_ дартных вариантов данного домена.

Принципиальным отличием известных аутолизинов от эндолизинов является локали зация эндопептидазного домена на С-конце. Всего выделяются три основных варианта структу ры: ) -концевой LysM домен и С-терминальная эндопептидаза;

) С-терминальная эндопеп ) -концевой ) тидаза без идентифицированного LysM домена;

и c) домен гликозаминидазы и С-терминальная эндопептидаза.

На сегодняшний день идентифицировано, как минимум, шесть различных вариантов эндопептидазного () домена, один вариант эндопептидазного M23 домена, и два вари )) анта амидазного домена.

Биология фагов Информация о наличии доменного разнообразия у ПГ стафилококков важна в свете задач по получению рекомбинантных ферментов, обладающих набором новых свойств, непри сущих природным пептидогликангидролазам. Как правило, получению новых слитых белков предшествует стадия идентификации ПГ, способных лизировать живые клетки стафилокок ков, и стадия делеционного анализа и идентификации функциональных литических доменов, сохраняющих активность в виде отдельных белков.

Большинство ПГ, способных лизировать живые клетки., представляют собой классический вариант эндолизина, состоящего из трех доменов – двух каталитических (CHAP и амидаза) и SH3_5 домена. Это эндолизин (LysK) фагаК, эндолизин фага phi11, эндолизин фага SH2 и эндолизин lysWMY фага M [, 5, 7, 8] и др. Структуры из двух каталитических доменов - гликозаминидазы и С-терминальной эндопептидазы, к которым относится белок вириона фага 8 и белок gp1 фага MR11, также проявляли активность против живых клеток клинических изолятов. [9;

10].

Данные делеционного анализа показали исключительный вклад доменов в ли тическую активность эндолизинов, тогда как амидазный домен в одиночку, как правило, не имеет литической активности против живых клеток. Известен только один случай доминирую щего положения амидазного домена [11], способного в виде изолированного белка эффектив но убивать живые клетки стафилококков. Этот факт представляется важным в свете создания химерных белков, состоящих из трех активных синергетически действующих каталитических доменов.

Способ осуществления субстрат-специфичной функции ПГ остается неясным. Изо лированные каталитические домены стафилококковых эндолизинов в полной мере сохраняют специфичность, присущую полному белку [, 7, 11]. При этом наличие субстрат-связываю щего домена, как правило, мало влияет на литическую активность рекомбинантного белка, но оказывает сильное влияние на такое свойство, как растворимость. Неожиданным фактом является литическая активность против стрептококков и стафилококков рекомбинантной ПГ, полученной на основе слияния каталитического пептидазного домена из стрептококкового эн долизина и субстрат-связывающего домена стафилококкового фага [12]. Таким образом, функ циональные характеристики доменов ПГ позволяют создание рекомбинантных белков узкона правленного спектра действия против одного или более родов грамположительных бактерий, например, только стафилококков и стрептококков.

Терапевтический потенциал ряда стафилококковых рекомбинантых ПГ уже продемон стрирован результатами экспериментов на мышах in vivo [10;

13, 14]. Защитное действие но вых антимикробных препаратов in vivo свидетельствует о высоком потенциале слитых белков, обладающих антимикробным действием, в качестве новых терапевтических средств лечения инфекций, вызванных MR, а также других стафилококковых заболеваний.

Библиографический список 1. Lopez R, Grci E. Recent trends on the moleculr iology of pneumococcl cpsules, lytic enzymes, nd cteriophge // FEM Microiol Rev, 2004;

28: 553-580.

2. Fischetti V. Bcteriophge lytic enzymes: novel nti-infectives // Trends Microiolб 2005;

13: 491-49.

3. moren B, Grci E, Monzon M, Leiv J, Oteiz, erez M, lrt JL, ernndez Ygo J. ntiiotic susceptiility ssy for tphylococcus ureus in iofilms developed in vitro // J ntimicro hemother, 1999;

44: 43-55.

4. Otto M. Bcteril evsion of ntimicroil peptides y iofilm formtion // urr Top Mi croiol Immunol, 200;

30: 251-258.

5. ss, Bierum G. Lytic ctivity of Recominnt Bcteriophge {phi}11 nd {phi} Endolysins on Whole ells nd Biofilms of tphylococcus ureus // ppl Environ Microiol, 2007;

73, 347-352.

Биология фагов. Becker, Dong, Bker JR, Foster-Frey J, ritchrd DG, Donovn DM. LysK endopeptidse domin is required for lysis of live stphylococcl cells // FEM Microiology letters, 2009;

294, 52-0.

7. chmelcher M, Koroov O, chischkov, Kiselev, Kopylov, rymchuk, Donovn DM, ev I. mi prophge 2 endolysin relies on cys teine, histidine-dependent midohydrolses/peptidses ctivity for lysis ‘from without’ // J Biotech nol, 2012;

12(2-3):289-98.

8. Yokoi KJ, Kwhigshi, Uchid M, ughr K, hinohr M, Kwski K, kmur, Tketo & Kodir K. The two-component cell lysis genes holWMYnd lysWMYof the tphy lococcus wrneri M phge vr phiWMY: cloning, sequencing, expression, nd muttionl nlysis in Escherichi coli // Gene, 2005;

351: 97–108.

9. Tkc M, nd Blsi U. hge 8 Virion-ssocited rotein 17 Displys ctivity ginst linicl Isoltes of tphylococcus ureus // Microiology. ntimicro gents hemother, 2005;

49(7): 2934–2940.

10. Rshel, M., J. Uchiym, I. Tkemur,. oshi, T. Ujihr,. Tktsuji, K. onke, nd. Mtsuzki. Til-ssocited structurl protein gp1 of phge phi MR hs ifunctionl lytic ctivity // FEM Microiol. Lett, 2008;

284:9-1.

11. ev I, Foster-Frey J, Koroov O, hishkov, Kiselev, Kopylov, rymchuk, chmelcher M, Becker, Donovn DM. tphylococcl hge 238 endolysin is lytic for tphylococcus ureus nd hrors n inter-lytic-domin secondry trnsltionl strt site // ppl Microiol Biotechnol, 2012;

[Epu hed of print] 12. Becker, Foster-Frey J, todol J, ncker D, Donovn DM. Differentilly con served stphylococcl 3_5 cell wll inding domins confer incresed stphylolytic nd strepto lytic ctivity to streptococcl prophge endolysin domin // Gene, 2009;

443:32– 41.

13. Dniel, Euler, ollin M, hhles, Gorelick KJ, Fischetti V. ynergism etween novel chimeric lysin nd oxcillin protects ginst infection y methicillin-resistnt tphylococcus ureus // ntimicro gents hemother, 2010;

54(4):103-12.

14. Fenton M, sey G, ill, Ghn G, Ross R, Mculiffe O, O’Mhony J, Mher F, offey. The truncted phge lysin (k) elimintes tphylococcus ureus in the nres of mice // Bioeng Bugs, 2010;

1():404-407.

SYSTEM ANALYSIS OF GENETIC STRUCTURE OF PHAGE AND BACTERIAL PEPTIDOGLYCAN HYDROLASES, A NEW CLASS OF ANTISTAPHYLOCOCCAL ENZYBIOTICS Abaev IV, Skryabin YuN, Pechrskich EI, Shishkova NA, Svetoch EA Key words: idgn d, ndin, in, bi i, i.

T im f d i nz knwn bi nd big idgn d bi f dving nv nimibi gin i i gin MRA. Fnin i f idgn d dmin w digning nw mbinn ifi in gin n v gn f gm-iiv bi,.g. gin i nd i n.

Биология фагов УДК 578:612.017. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ ПЕПТИДНЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЭПИТОПОВ, УЗНАВАЕМЫХ НЕЙТРАЛИЗУЮЩИМИ ВИЧ-1 АНТИТЕЛАМИ ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ Z13E1, VRC03 И VRC Ильичев А. А., Чикаев А. Н., Щербаков Д. Н., Федина Н. В., Бакулина А. Ю., Карпенко Л. И.

ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская обл., 630559, Россия Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение 8278 от 10.08.12), РФФИ (грант № 12-04-91452-НИЗ_а и грант № 12-04-31948 мол_а) Ключевые слова: фаговый дисплей, эпитопы, антитела, фаовые пиптидные библи отеки Благодаря работам Дж.Смита в 1985 г. и А. Ильичева в 1989 г. был разработан ме тод, впоследствии названный фаговым дисплеем, который основан на способности нитчатых бактериофагов М13 экспонировать на поверхности вириона случайные пептидные последова тельности в составе белка p3 или p8 без потери инфекционности [1, 2].

Фаговый дисплей получил свое развитие как мощный метод для изучения белок-бел ковых взаимодействий, обеспечивающий прямую физическую связь между пептидной после довательностью, экспонированной на поверхности бактериофага и фрагментом ДНК, коди рующий данный пептид в фаговом геноме. Комбинаторные фаговые библиотеки состоят из бактериофагов, в ген оболочечных белков которых встраиваются случайные (рандомизирован ные) олигонуклеотидные последовательности определенной длины. В результате получается пул (библиотека) бактериофагов, экспонирующих рандомизованные последовательности ами нокислот в составе одного из поверхностных белков. Библиотеки используются для селекции специфических фагов, взаимодействующих с целевым лигандом. По окончании последнего раунда селекции полипептиды, экспрессированные на поверхности фага, могут быть иденти фицированы путем секвенирования ДНК индивидуальных клонов [3].

Технология фагового дисплея достаточно экономична и не требует дорого оборудова ния, однако при этом позволяет решить вопросы, которые не всегда удается решить с помощью рентгеноструктурного анализа [4].

Одним из интересных применений технологии фагового дисплея является идентифи кация эпитопов, узнаваемых антителами, обладающими повышенной эффективностью ней трализовать вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Эти особые антитела были обнаруже ны у ВИЧ-инфицированных долгожителей относительно недавно и были названы нейтрали зующими антителами широкого спектра действия [5]. В настоящее время известно несколько десятков таких антител. Среди них особый интерес представляют моноклональные антитела (МКА) 13e1, VR03 и VR01, для которых показана нейтрализующая активность в отноше 13e1, e1, 1, R01, нии 91 % всех известных штаммов ВИЧ-1 [].

Цель исследования – получить пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, взаимодейству ющих с антителами 13e1, VR03 и VR01, с использованием фаговых пептидных библиотек.

Биология фагов Материалы и методы Моноклональные антитела (МКА) VR01, VR03 и 13e1 были получены в рамках программы I ID Reserch nd Reference rogrm (США). В работе использовались ком мерческие фаговые библиотеки h.D-12, h.D-7, h.D-c7c hge Disply eptide Lirry Kit («ew Englnd Biols», США). Данные наборы содержат комбинаторную библиотеку случай ew », ных пептидных фрагментов длиной 12 или 7 аминокислотных остатков соответственно, объ единенных с минорным белком оболочки pIII фага M13. Библиотека содержит приблизительно 3 109 индивидуальных фаговых клонов.

Аффинная селекция фаговых пептидных библиотек проводилась в соответствии с протоколом, описанным в руководстве к наборам фаговых библиотек («ew Englnd Biols», США). Проводилось три цикла аффинной селекции, после чего из отобранных индивидуаль ных бактериофагов выделялась ДНК (в соответствии с рекомендациями производителя фаго вой библиотеки) и определялась ее нуклеотидная последовательность. Секвенирование прово дили по методу Сэнгера в центре секвенирования ДНК ИХБФМ СО РАН. Иммуноблотинг (дот блот) бактериофагов с соответствующими МКА проводили по методике, описанной в статье [3].

Для определения соответствия между отобранными последовательностями пептидов и антигеном gp120 использовались сервер epitope (http://pepitope.tu.c.il/) и собственное про граммное обеспечение. Также использовалась разработанная нами программа pdMp, напи санная на языке python с использованием библиотеки Bioython [7]. Она реализует аналогич ный метод, но вместо пар остатков используются отдельные остатки, а район поиска эпитопа на антигене задается пользователем.

Результаты и обсуждения Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ-1, узнаваемые МКА VRC МКА VR01 принадлежат к классу IgG1, несут легкую цепь типа (каппа) и взаимо действуют с областью белка gp120, являющейся сайтом связывания вируса с D4-клетками.

VR01 обладают нейтрализующей активностью против большинства субтипов ВИЧ-1 [].

Отбор фаговых клонов, специфично связывающихся с антителами VRC01. Методика аффинной селекции (биопэннинг) позволяет отбирать из пептидной библиотеки бактериофа гов те из них, которые несут пептиды, обладающие наибольшим сродством к молекулам-ми шеням. На первом этапе МКА иммобилизуются на пластиковой поверхности планшетов, по сле чего к ним добавляется фаговая пептидная библиотека. Далее, после наступления кинети ческого равновесия, несвязавшиеся с антителами фаги отмываются промывочным буфером, оставшиеся специфично связанные фаговые клоны элюируются и размножаются для нового цикла селекции. Обычно достаточно проведения трех раундов аффинной селекции, чтобы по лучить обогащенную популяцию фагов, содержащих целевые последовательности. Из обога щенной таким образом фаговой библиотеки после проведения нескольких раундов аффинной селекции отбирают индивидуальные фаговые клоны и определяют специфичность их связы вания с соответствующими МКА с помощью ИФА или иммуноблоттинга. Аминокислотный состав специфичных к МКА пептидов, расположенных на поверхности фаговых частиц, опре деляют путем секвенирования фаговых ДНК в кодирующей пептид области.

Было проведено два независимых эксперимента, включающих 3 раунда аффинной се лекции, с использованием антител VR01 и библиотеки h.D-12. В результате отобраны инди видуальные фаговые клоны и определены структуры их рандомизированных вставок (табл.1).

Биология фагов Таблица 1 - Аминокислотные последовательности, узнаваемые МКА VRC01, ото бранные из фаговых пептидных библиотек. Цветом выделены совпадающие аминокис лотные остатки (общие структурные мотивы) Аминокислотная Номер фагового Количество повторов последовательность клона экспонированного пептида Характеристика антигенных свойств отобранных клонов. Специфичность связыва ния выделенных бактериофагов с МКА подтверждали с помощью дот-блот анализа. Резуль таты взаимодействия фаговых клонов с МКА VR01 представлены на рис. 1. Показано, что фаготопы № 15, 1, 2, 28, 3, 42, 49, 3 и 5 связываются с МКА VR01 c наибольшей аффин ностью. Большинство полученных фаговых клонов экспонируют пептиды, которые содержат общий мотив вида UOXXJUXXWXXX, где X – любой аминокислотный остаток;

U – гидро фобный неароматический (Leu, Ile либо Vl);

O – er либо Thr;

J – отрицательно заряженный (sp либо Glu).

Биология фагов Рис. 1 - Иммуноблот-гибридизация исследуемых фаговых клонов с антителами VRC01.

На нитроцеллюлозную мембрану наносили последовательные пятикратные разведе ния фаговых частиц, суспендированных в 2 мкл B Идентификация района связывания пептидов с VRC01. С целью определения воз можного района связывания пептидов с VR01 нами проанализирована структура комплекса антитела VR01 с gp120, которая получена методом рентгеноструктурного анализа. В данном комплексе в структуре gp120 отсутствуют петли V3 и V1 / V2, так как они препятствуют кри сталлизации gp120. В состав эпитопа входят следующие фрагменты gp120: остатки 123, 124 и 198 (остаток 198 в структуре следует непосредственно за 124, это район удаленной петли V1 / V2), районы 27–283 (петля D), 35–371 (D4-связывающая петля), 427–430, 455–474 (петля V5). Мы предположили, что найденные методом фагового дисплея пептиды способны имити ровать какие-либо фрагменты эпитопа VR01 на поверхности gp120.

Сервер epitope не смог правильно определить соответствие пептидов и gp120, все найденные варианты лежали за пределами известного эпитопа. Причиной этого могут быть особенности структуры эпитопа либо пептидной библиотеки.

Программа pdMp обнаружила наилучшее соответствие консенсусной последователь ности пептидов с gp120 в районе D4-связывающей петли. Поиск соответствующего района gp120 был изначально ограничен остатками, входящими в состав эпитопа антитела VR01.

На рис. 2 представлено выравнивание фрагмента gp120 c пептидами из клонов, взаимодей ствие которых с VR01 подтверждено методом иммуноблоттинга. В литературе отмечено, что остатки sp38 и Ile371 входят в число пяти ключевых остатков, вносящих наибольший вклад в связывание gp120 с VR01 (Wu et l., 2012). Эпитоп VR01 не включает в себя ни одного бокового радикала триптофана, фенилаланина или тирозина, поэтому С-концевая половина пептидов XXWXXX, по всей видимости, не имитирует районы gp120, а связывается с анти телом каким-то другим образом.

Биология фагов Рис. 2 - Выравнивание пептидов из клонов, показавших наибольшую аффин ность связывания в иммуноблотинге с VRC01 и фрагмента 365-371 gp120.

Выделены а.о., соответствующие консенсусной последовательности Чтобы подтвердить возможность связывания пептидов с антителом VR01 в райо не взаимодействия с D4-связывающей петлей, нами построена модель фрагмента пептида VWELYKWTW из наиболее распространенного клона отобранного в результате аффинной селекции. В результате выявлено, что фрагмент WEL способен имитировать район 35– gp120 без каких-либо стерических ограничений (рис. 3).

Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ-1, узнаваемые МКА VRC С использованием антител VR03 в качестве молекулы-мишени после проведения процедуры аффинной селекции из пептидных библиотек h.D-12, h.D-C7C и h.D-7 было отобрано 8, 20 и 12 фаговых клонов соответственно. Секвенирование и последующий ком пьютерный анализ с использованием онлайн инструмента MimoDB позволили выявить уни кальные аминокислотные последовательности среди пептидов, полученных с помощью всех трех библиотек (табл. 2). При сравнении пеп тидных последовательностей, полученных с помощью библиотек h.D-12 и h.D-C7C были выявлены критические для связывания аминокислоты (ro) иL(Leu).Таким обра зом, общий мотив выглядит следующим об разом: (ro), X, L(Leu)/V(Vl). В результа те аффинной селекции из библиотеки h.D 7 был получен несколько отличный мотив вида (ro)/L(Leu)/(l), W(Trp), Y(Tyr), K (Lys)/R(rg), L(Leu)/V(Vl)/I(Ile), (ro). При сравнении пептидных последовательностей, полученных с помощью библиотек h.D- и h.D-C7C были выявлены критические для связывания аминокислоты (ro) и L(Leu).

Т.о., общий мотив выглядит следую щим образом: (ro), X, L(Leu)/V(Vl). В ре зультате аффинной селекции из библиотеки Рис. 3 - Модель взаимодействия h.D-7 был получен несколько отличный мо.D- D- - фрагмента пептида SWPEL с VRC01. Анти тив вида (ro)/L(Leu)/(l), W(Trp), Y(Tyr), тело показано в виде поверхности, gp120 – в K (Lys)/R(rg), L(Leu)/V(Vl)/I(Ile), (ro).

Пептиды-имитаторы эпитопа ВИЧ- виде линии, соединяющей атомы основной цепи, у фрагмента 365–371 показаны боко 1, узнаваемые МКА Z13е В результате аффинной селекции с вые радикалы, пептид изображен толстой использованием антител 13e1 было отобрано полупрозрачной линией.

Биология фагов Таблица 2 - Уникальные аминокислотные последовательности, полученные для моноклонального антитела широкого спектра действия VRC 12 мерная библиотека с7с мерная библиотека 7 мерная библиотека 0 фаговых клонов из библиотеки h.D-12 и 10 клонов из h.D-7. Секвенирование и после.D- D- - дующий компьютерный анализ позволили выявить уникальные аминокислотные последова тельности среди пептидов, полученных с помощью этих библиотек (табл. 3). Специфичность связывания всех полученных бактериофагов с МКА 13e1 подтверждали с помощью Вестерн блот анализа. Результаты взаимодействия антител и фаговых клонов, отобранных в результате аффинной селекции из библиотеки h.D-12, приведены на рис. 4. В результате было показано, что из всех фаготопов c наибольшей аффинностью с МКА 13e1 связываются фаги №№1, 7, 9 3, 23, 2, 28, 25, 37, 24, полученные в результате проведения биопэннинга с использованием фаговой библиотеки h.D-12. При сравнении пептидных последовательностей был выявлен мотив длиной а.о. следующего вида: (sn), Y(Tyr)/W(Trp), X, D(sp), I(Ile)/L(Leu)/V(Vl), T(Thr). Полученную пептидную последовательность сравнили с литературными данными об аминокислотной последовательности эпитопа на поверхности gp41, с которым связывается МКА 13e1 [8].

Таблица 3 - Уникальные аминокислотные последовательности, полученные для моноклонального антитела широкого спектра действия Z13e 12 мерная библиотека 7 мерная библиотека Биология фагов Рис. 4 - Результат Вестерн-блот анализа фаговых клонов с антителами Z13e1.

На нитроцелюллозную мембрану наносили последовательные десятикратные разве дения фаговых частиц, суспендированных в 2 мкл PBS. В качестве отрицательного контроля был использован бактериофаг №8, не содержащий искусственную пептид ную встройку.

Данный эпитоп является линейным, в его состав входят следующие а.о. : WWFDIT.

Было обнаружено, что последовательность gp41 ВИЧ-1 почти полностью совпадает с моти вом отобранных фаговых пептидов. Единственным заметным отличием отбираемых фаговых пептидов является очень низкая встречаемость F (фенилаланина) в позиции между W и D. В то же время в данной позиции он присутствует в пептидных встройках, экспонированных в составе поверхностного белка фаговых частиц. Возможно, это связано с тем, что регион gp находится в альфа-спиральной конформации, и данный аминокислотный остаток находится на противоположной стороне альфа-спирали, максимально удаленной от антигенсвязывающего участка антитела. Поэтому нахождение в этой позиции фенилаланина не является строгим.

Эти результаты свидетельствуют о том, что с использованием фагового дисплея получены пеп тиды имитаторы эпитопа gp 41, с которыми связывается МКА 13e1.

Библиографический список 1. mith G.. Filmentous fusion phge: novel expression vectors tht disply cloned ntigens on the virion surfce // cience. – 1985. – V. 228(4705). –. 1315–1317.

2. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И., Карпышев Н.Н., Ерошкин А.М., Пе тренко В.А., Сандахчиев Л.С. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным чужеродным пептидом в основной белок оболочки // Доклады Академии Наук. – 1989. – Т.307.

- 481-483.

3. mith G.., cott J. K. Lirries of peptides nd proteins displyed on filmentous phge // Methods in enzymology. 1993. Vol. 217.. 228–257.

4. oll-zner. Identifying epitopes of IV-1 tht induce protective ntiodies // t.

Rev. Immunol. 2004. Vol. 4, № 3.. 199–210.

5. Mscol J. R., Montefiori D.. The Role of ntiodies in IV Vccines // nnul Review Immunology. 2010. Vol. 28.. 413–444.

. Wu X., Wng., O’Dell., Li Y., Keele B. F., Yng., Immichi., Dori-Rose., oxie J.., onnors M., hw G. M., Wytt R. T., Mscol J. R. election ressure on IV-1 En velope y Brodly eutrlizing ntiodies to the onserved D4-Binding ite // J. Virol. 2012. Vol.

8, № 10.. 5844–585.

7. ock. J., nto T., hng J. T., hpmn B.., ox. J., Dlke., Friederg I., mel ryck T., Kuff F., Wilczynski B., oon M. J. de. Biopython: freely ville ython tools for compu ttionl moleculr iology nd ioinformtics // Bioinformtics. 2009. Vol. 25, № 11.. 1422–1423.

8. wick M.B., Bonnycstle L.L., Menendez., Irving M.B., Brs.F. 3rd, rren.W., Биология фагов Burton D.R., cott J.K. Identifiction nd chrcteriztion of peptide tht specificlly inds the humn, rodly neutrlizing nti-humn immunodeficiency virus type 1 ntiody 12 // J. Virol. – 2001. – V. 75(14). -. 92-9.

УДК 578. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБРАЗЦОВ КАРТОФЕЛЯ Андрийчук Е.Н., кандидат биологических наук Киевский национальный университет им. Тараса Шевченка, Украина +380675045549, aom502@ukr.net Ключевые слова: Бактериофаги, фитопатогенные бактерии, литическая актив ность, БОЕ.

Работа посвящена исследованиям фагов фитопатогенных бактерий Х. xndi v. bi 7325, Pdmn fln 8573, Pnibi mx 9034 с целью изучения их влияния на патогенную микрофлору. Изучено морфологию негативных колоний, определен спектр литической активности фагов до 20 штаммов бактерий. За особенностями строения фаги были отнесены к таксономическим группам.

Введение. При выращивании и хранении сельскохозяйственных продуктов специали сты постоянно сталкиваются с проблемой поражения растений бактериальными заболевания ми. В связи с длительным использованием химических средств для защиты растений в Украине, чрезвычайно важной является задача разработки новых, экологически чистых средств защиты растений. Традиционные методы химической защиты растений не позволяют избирательно воздействовать на отдельные микроорганизмы, не уничтожая нормальную микрофлору агро ценозов. Бактериофаги (вирусы бактерий) не имеют этого существенного недостатка. Про являя специфичность и поражая только определенные группы бактерий, фаги предотвращают как распространение инфекционных заболеваний у растений, так и истощение черноземов.

Внедрение новой экологически обоснованной системы ведения сельского хозяйства и защиты растений является важной научной задачей, что позволит получить полноценную конкуренто способную продукцию сельскохозяйственного производства без остатков ядохимикатов. Их основным преимуществом является безопасность для человека и окружающей среды, а также более дешевое производство.

Целью работы было - получить и охарактеризовать изоляты фагов к бактериям - пато генов olnum tuerosum и проведение их сравнительного анализа для дальнейшей разработ ки высокоэффективного и экологически безопасного антибактериального препарата на основе вирусов микроорганизмов для борьбы с бактериальными болезнями растений.

Материалы и методы исследований. Объектом исследований были изоляты фа гов, выделены к Х. xndi v.bi 7325- туберкулез сахарной свеклы;

Pdmn fln 8573- мягкая гниль;

Pnibi mx 9034 - гниль картофеля. В работе ис пользовали индикаторные культуры фитопатогенных бактерий, полученных из коллекции музея Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, отдела фитопатогенных бактерий (штаммы: Х. xndi v. вi 7325;

Pdmn fln Биология фагов 8573;

Pnibi mx 9034;

Cvib miignni m. dni 7750;

Ewini v (Pbim vm) 8982;

Ewini v b. аi (Pbim vm b. im 844);

Pdmn ing v. bi 223;

Ewini v 21;

Pdmn ing v. fin1025;

Pdmn ing v. - 185;

Pdmn ing v. bi 84;

Pdmn i 812;

Bkdi gdii v. i 8494;

Pdmn vni v. i 4228;

Pdmn vni v. i 4013;

Pdmn viidiflv 887;

Pdmn ing v. 8545;

Pdmn ing v. ing 853;

Cvib miignni m. dni 7750;

Ewini v b. i 844.

Чистые линии бактериофагов получали путем шестикратного пассирования с исполь зованием методом выкалывания отдельных негативных колоний. Были получены изоляты бак териофагов, которые использовали в дальнейшем для работы.

Для выращивания бактерий и титрования фагов использовали готовые коммерческие агаризованные питательные среды, на основе рыбного гидролизата. Разведение фагов прово дили на 0,9% растворе l (физиологический раствор) или коммерческом мясном бульоне, приготовленном согласно инструкции предприятия-изготовителя. Титр определяли по Грациа и методом spot-test в бляшкообразующих единицах на мл (БОЕ / мл).

Концентрирования и очистку фагов проводили методами высокоскоростного цен трифугирования в градиенте плотности sl. Дальнейшая очистка вируса (от остатков цезия sl) проводилась методом дифференциального центрифугирования.

Контроль чистоты выделенных вирусных препаратов определяли спектрофотометри ческим, электронномикроскопическим методами. Электронномикроскопический анализ об разцов проводили по общепринятым методикам.

Морфологию вирусных частиц изучали с помощью электронного микроскопа Jeol JEM - 1400. Препараты готовили методом негативного контрастирования уранилацетатом.

Анализ електроннограмм показал, что исследуемые фаги отличались по строению вирионов и размеру.

Результаты исследований и их обсуждение.

Выделение бактериофагов проводили с проб корнеплодов картофеля, которые отби рали из отдельных овощехранилищ разных регионов Украины. Бактериофаги выделяли до фитопатогенных бактерий семейств Pdmn, Pnibi, Xnmn. Выбор инди каторных культур был обусловлен высоким удельным весом фитопатогенных бактерий этих семейств среди возбудителей, вызывающих болезни картофеля.

Образцы отбирали из клубней картофеля за характерными симптомами бактериально го заболевания. В основном бактериальные болезни проявляются во время хранения. И имен но поэтому образцы отбирали после хранения их в овощехранилищах. При поражении карто фель размягчается и увлажняется, превращаясь в слизистую массу темно-бурой или розовой окраски с неприятным запахом. В хранилище заболевание чаще наблюдается в верхнем слое (20 - 25 см), где сохраняется повышенная влажность воздуха. Болезнь обостряется при резких колебаниях температуры, повышенной влажности воздуха, переохлаждении или подморажи вании клубней, механическими повреждениями, а также при заражении их другими болезнями - бурой бактериальной гнилью, черной ножкой, мягкой гнилью, кольцевой гнилью. Для пре дотвращения заболевания необходимо своевременно и бережно убирать продукцию, тщатель но отбирать здоровый посадочный материал и поддерживать оптимальный режим хранения.

В отдельных агроценозах было обнаружено колебание эффективности выделения фа гов по числу положительных проб в зависимости от региона. О распределении положительных результатов по регионам Украины, то можно акцентировать, что бактериофаги к Pnibi Биология фагов mx 9034 и Pdmn fln 8573 встречались чаще других. К бактерии Х.

xndi v.bi 7325 было обнаружено лишь один положительный результат.

Кроме этого, еще было замечено сильное колебание биологической активности вы деления бактериофагов из природных биоценозов. Было очень тяжело выделить из почвы изо ляты фагов. Этот факт свидетельствует о низкой вероятности распространения и сохранения популяции бактериофагов именно в почве. Это может объясняться коротким сроком хранения бактерий в почве и применением севооборотов на опытных полях [1].

Для получения чистых линий проводили не менее шести пассажей.

Сравнительная характеристика титров бактериофагов проводили с помощью тест культур (Х. xndi v.bi 7325;

Pdmn fln 8573;

Pnibi mx 9034, проведенных по разным методикам: титрование по Грация и титрования методом spot test.

Для дальнейшей работы были отобраны образцы с определенными симптомами гнили - кольцевая гниль картофеля, мягкая гниль.

Изучены и исследованы негативные колонии бактериофагов, которые были получены в лаборатории, различались по размерам, особенностями морфологии и скорости формирова ния их негативных колоний.

Для первого цикла исследований отбирали фаги 8573, 8573/гр, 8573/5 - чувстви тельная культура Pdmn fln 8573, они образовывали прозрачные бляш ки диаметром от 1 до 3 мм;

фаги 7325\1 - чувствительная культура Х. xndi v.

bi 7325 образовывали прозрачные бляшки диаметром от 0,1 до 0,5 мм (рис. 1).

Фаги 9034/1, 9034/4, 9034/5, 9034/8 - чувствительная культура Pnibi mx 9034 - об разовывали прозрачные бляшки диаметром от 1 до 7 мм (рис. 2).

Рис. 1. - Морфология негативных колоний группы фагов: 1 – 7325 чувствительная культура - Х. xndi v. bi 7325;

2 - 8573 чувствительная культура - Pdmn fln Биология фагов Рис. 2 - Морфология негативных колоний группы фагов 9034 - чувствительная культура - Pnibi mx Сравнение морфологии негативных колоний исследуемых фагов показывает их раз личие. Более детальное изучение их свойств является важным для анализа распространения фагов в агроценозах, изучение их спектра литической активности.

При изучении репродукции вирусов бактерий в экосистемах важным свойством явля ется спектр их литической активности, определение которого позволяет учитывать возможные пути переноса генетической информации в природе.

По спектру литической активности фаги были проверены на 20 штаммах бактерий, которые относились к четырем семействам Pdmn, Bi, Xnmn и Ewiniа.

В пределах определенного штамма бактерий по спектру литической активности бак териофаги 9034\2, 9034\3, 9034\4, 8573\1, 7325\1 были узкоспецифические и не лизировали другие штаммы фитопатогенных бактерий, кроме к тем, к которым они были и выделены, то есть они являются моновалентными.

Широкий спектр литической активности имели фаги 9034\1, 8573\2, 8573\3. Они ли зировали фитопатогенные бактерии родов Pdmn, Xnmn, относящихся к разным видам. Изоляты фагов оказались поливалентными.

Среди исследуемых изолятов фагов три проявляли литическую активность по отно шению к культурам, которые являются довольно широко распространенным в природе пато генами картофеля, возможно в процессе эволюции вирусы приспособились к репродукции на различных чувствительных культурах.

Среди изолятов выявлено группу фагов, с икосаэдрической головкой и длинным хво стовым отростком, который несокращается, и относятся к семейству iviid, порядка Cdvi, с размерами: диаметр головки - 7 ± 2 нм, длина хвостового отростка - 120 ± нм.

Биология фагов а) б) в) Рис. 3 - Електрономикроскопическое изображение фагов: а) 7325 №1;

б) 9034;

в) Другая группа фагов с икосаэдрической головкой и маленьким отростком, которые от носятся к семейству Pdviid, порядка Cdvi и имели размеры: диаметр головки - ± 1 нм, длина хвостового отростка - 1нм [2]. Фотографии представлены на рис. 3.

Заключение.

Исследования, посвященные предупреждению развития бактериозов еще требуют дальнейшего развития, однако показана перспективность проведения биологического контро ля численности бактерий с помощью фагов на практике.

Библиографический список 1. Семчук Л.И. Токарчук Л.В. Распространение и специфичность бактериофагов фито патогенных бактерий в природних биоценозах // Микробиологический журнал. –1994. –№5.

–c.102.

2. ckermnn H.-W., lendr nd S.T. edon (eds.). lssifiction of cteriophges. T Big, 2nd edn. Oxford: Oxford University ress. - 200. – p. 8–1.

CHARACTERIZATION ISOLATED PHAGES OF PHYTOPATHOGENIC BACTERIA ISOLATED FROM POTATO Andriychuk E.N.

Key words: big, gni bi, i ivi, PFU.

Pg f gni Х. xndi v. bi 7325, Pdmn fln 8573, Pnibi mx 9034 w did v i infln n gni bi. d mg f ngiv ni. T ng f i i ivi 20 bi in w d mind. Ding i mgi ii g w fd xnmi g.

Биология фагов УДК 578.52.

ДЕТЕКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУЛЕНТНОСТИ В ГЕНОМАХ БАКТЕРИОФАГОВ Баннов В.А.*, тел. 8(4967) 36-00-79, bannov@online.stack.net;

Фурсова Н.К. *, кандидат биологических наук, тел. 8(4967) 31-19-11, fursova@obolensk.org;

Воложанцев Н.В.*, кандидат биологических наук, тел. 7-4967-36-01-47;

nikvol@obolensk.org Коровкин С.А.**, доктор медицинских наук, профессор, тел. 8(495) 917–41–49, korovkin09@mail.ru;

Светоч Э.А. *, доктор ветеринарных наук, профессор, тел. 8(4967) 36-00-79, svetoch@obolensk.org *ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии»

Роспотребнадзора **Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН Ключевые слова: бактериофаги, горизонтальный перенос генов, гены вирулентно сти Представлены данные литературы о роли бактериофагов в горизонтальном и вер тикальном переносе генетических детерминант вирулентности у патогенных бактерий и ре зультаты собственных исследований по выявлению генов токсинов в геномах бактериофагов.

Введение. Бактериофаги, в качестве мобильных генетических элементов (МГЭ), играют чрезвычайную роль в эволюции бактерий. Профаги зачастую содержат генетические детерминанты факторов вирулентоности, например: пирогенные и апирогенные токсические суперантигены стрептококков группы А [1];

фитнес-факторы mn ni серова ра Typhimurium;

остров патогенности Vibi ;

шига-токсин Eii i серотипа O157:7;

бактериоцины Pdmn gin;

нейротоксин Cidim binm;

фитнес факторы gn, дифтерийный токсин Cnbim dii и др. [2].

Наличие в геноме большого количества профагов привносит в бактериальную клетку ряд эво люционных преимуществ: (i) повышенную генетическую мобильность и большую степень представленности факторов вирулентности в популяции бактерий;

(ii) эпистатическое взаи модействие между генами вирулентности и генами бактериофага;

(iii) амплификацию генов вирулентности в экосистеме за счет их переноса в бактерии-комменсалы, находящиеся в од ном сайте инфекции с патогеном;

(iv) повышение дарвиновского фитнеса бактерий в резуль тате проявления свойств, модифицирующих экосистему [3]. Таким образом, взаимодействие между умеренными фагами и бактериями-хозяевами характеризуется как симбиотическая ас социация [4].

Показано, что профаги встречаются в геномах бактерий не равномерно, а локализуют ся в «горячих точках», в соответствии со статистически достоверно установленной адаптацией к хромосомному генетическому окружению [5]. Именно встраивание профагов, несущих гены вирулентности, является основным механизмом конверсии свободноживущих бактерий в па тогены у представителей разных таксонов: Gmmbi (Eii и Pdmn), Bbi (Bkdi) и Fimi (Bi) [].

Ярким примером ключевой роли бактериофагов в горизонтальном переносе генов и Биология фагов возникновении новых штаммов является эволюция E. i. Геномный анализ показал, что в ДНК эпидемического штамма E. i O157 ki присутствует множество мобильных генети ческих элементов (98 копий I-элементов), большое число генов, кодирующих факторы виру лентности (энтерогемолизин, Esp протеазу и большой клостридиально-подобный токсин), профагов или следов профагов, шесть больших хромосомных сегментов, которые представ ляют собой профаго-подобные генетические элементы [7]. Кроме того, бактериофаги играют очень важную роль в контроле бактериальной плотности природных популяций, на основе постоянно протекающей коэволюции фагов и бактерий-хозяев. Например, фаги играют ключе вую роль в остановке эпидемий холеры [8].

В последние годы все более реальной становится возможная перспектива использова ния бактериофагов в качестве средств контроля инфекционных заболеваний. Предполагается, что фаговая терапия будет основана на использовании безопасных (только литических), хоро шо охарактеризованных (на геномном и протеомном уровнях) и наработанных в соответствии с требованиями производства конвенциональных медицинских продуктов [9].

Целью данной работы является детекция генов вирулентности в препаратах ДНК литических бактериофагов.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследований явились 24 пре парата ДНК литических бактериофагов, специфичных к mn Enteritidis (n = 3), mn holeresuis (n = 3), mn Infntis (n = 3), ig spp. (n = 2), Yini dbi (n = 2), Eii i (n = 11), в том числе серотипов O157:H7 (n = 4) и O104:H4 (n = 7).

C целью удаления бактериальной ДНК фаголизаты, полученные при размножении бактериофагов на культуре чувствительных бактерий, подвергали обработке ДНКазой и РНКа зой в течение 2 ч при температуре 37 °С. Затем в фаголизат вносили хлористый натрий до кон центрации 1 М и выдерживали в течение 2 ч на ледяной бане, центрифугировали, отбрасывали осадок, а к супернатанту добавляли ПЭГ 8000 до концентрации 10 % и инкубировали еще 2 ч на ледяной бане. После повторного центрифугирования осадок растворяли в 1 мл M буфера, обрабатывали протеиназой К в присутствии 0,5 % ДСН с последующей экстракцией фенолом в буфере TE (p 8,0). Водную фазу переосаждали изопропиловым спиртом. Дальнейшую от мывку проводили этиловым спиртом. Подсушенный осадок ресуспендировали в 0,3 мл буфе ра ТЕ. Количество и качество выделенной ДНК контролировали электрофоретически в 0,8 % агарозном геле и спектрофотометрически при длине волны 20 нм. Кроме того, подтвержда ли отсутствие генетического материала бактерий-хозяев с помощью мультипраймерных ПЦР тест-систем TЭK-104 и ТЭК-157 (Оболенск, Россия), КОЛИПОЛ (Литех, Россия), АмплиСенс lmonell spp.-Eh (Интерлабсервис, Россия), АмплиСенс Эшерихиозы–FL (Интерлабсервис, Россия), АмплиСенс EE-FL (Интерлабсервис, Россия).

Детекцию генов вирулентности проводили с помощью полимеразной цепной реак ции в классическом режиме на термоциклерах T 100 (MJ Reserch, США) и Genemp (pplied Biosystems, США), а также в формате реального времени на приборе FX9 (BioRd, США). Для проведения реакции использовали 10 сульфатный буфер для ПЦР (50 mM Tris l (p = 8,9), 10 mM (4)2O4, 15 mM Mgl2, 0,5 % Tween 20). Реакционная смесь со держала 200 µM ДНТП, 0,25-0,5 µM праймеров и 1 ед. активности Tq-полимеразы. Режим проведения ПЦР: начальная денатурация при 95 °С -5 мин;

затем 30-35 циклов, включающих в себя денатурацию при 95 °С -1 мин, отжиг праймеров при 50-0 °С – 1 мин и элонгацию при 72 °С – 1 мин;

затем завершающая элонгация при 72 °С - 5 мин. Температура отжига прайме ров определялась характеристикой используемых праймеров (таблица 1).

Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле в Трис-боратном буфере. Визуализацию ДНК проводили после окрашивания агарозных гелей Биология фагов в течение 20 мин в растворе (1 мг/л) бромистого этидия. Для документирования полученных результатов использовали систему DORIT (Viler Lourmt, Франция).

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты ПЦР-детекции показали, что во всех 24 исследованных образцах ДНК литических бактериофагов, специфичных к. En teritidis,. holeresuis,. Infntis, ig spp., Y. dbi и E. i, отсутствуют гены, детерминирующие синтез шига-подобных токсинов tx1 и tx2, термолабильного эн tx1 tx2, теротоксина LT, термостабильных энтеротоксинов ST и Еst, а также гены гемолизина Hly.

Полученные данные позволяют считать соответствующие литические бактериофаги достаточ но безопасными с точки зрения возможной передачи генов токсинов при их использовании в качестве средств контроля плотности бактериальных популяций энтеробактерий у сельскохо зяйственных животных и в окружающей среде.

Заключение. Проведенные молекулярно-генетические исследования показали отсут ствие генов, детерминирующих синтез шига-подобных токсинов I- и II-типов, термолабиль - -типов, ного энтеротоксина, термостабильных энтеротоксинов St и Еst, а также гемолизина (Hly) в геномах 24 литических бактериофагов, специфичных к. Enteritidis,. holeresuis,. Infntis, ig spp., Y. dbi и E. i.

Таблица 1 – Праймеры, использованные для детекции генов бактерий Праймер Олигонуклеотидная последова- Tm, Ген- Примечание тельность, 5’— 3’ °С мишень invA Идентификации ДНК саль inv GTGTGTTTG GGTGGTTGTG монелл fbO157 Идентификация ДНК E. i rfO157 GGTGGGTGGTGGTTG GGTTTGGTGTGTGG O157:H fbO104 Идентификация ДНК E. i rfO104 TGTTGGTG O104:H TTTGTGGG x stx1 TGTGGGGGTGTTG 0 Выявление гена шига-подоб TGGGTGGG ного токсина типа I, синтези руемого штаммами TE x stx2 TGTGTGTTGGG 0 Выявление гена шига-подоб TGGTTTGGTGG ного токсина типа II, синте I, зируемого штаммами TE B ltB TTTGGGTTTTT 58 Выявление гена субъедини TTTTGGTTGGTGTTG цы В термолабильного энте ротоксина, синтезируемого штаммами ETE A st GTTGTTT 5 Выявление гена субъедини TGGTGGTGTG цы А термостабильного эн теротоксина, синтезируемого штаммами ETE A est TGTGTGGG 5 Выявление гена термоста TTGGGG бильного энтеротоксина, синтезируемого штаммами EАE A hly GTGGTGG 5 Выявление гена гемолизина TTTGGGGTGG Биология фагов Библиографический список 1. Bnks D.J., Beres.B., Musser J.M. The fundmentl contriution of phges to G evolution, genome diversifiction nd strin emergence. // Trends Microiol. – 2002. - Vol. 10. – o.


11. – P. 515-521.

2. Brssow., nchy., rdt W.D. hges nd the evolution of cteril pthogens:

from genomic rerrngements to lysogenic conversion. // Microiol. Mol. Biol. Rev. – 2004. – Vol.

8. – o. 3. –. 50-02.

3. edon.T., Lejeune J.T. Why cteriophge encode exotoxins nd other virulence fc tors. // Evol. Bioinform. Online. – 2007. – Vol. 1. – P. 97-110.

4. Roossinck M.J. The good viruses: virl mutulistic symioses. // t. Rev. Microiol. – 2011. - Vol. 9. – o. 2. –. 99-108.

5. Boy L.M., Roch E.., Touchon M. The dpttion of Temperte Bcteriophges to Their ost Genomes. // Mol. Biol. Evol. – 2013. - Jn 15. [Epu hed of print]. Busy B., Kristensen D.M., Koonin E.V. ontriution of phge-derived genomic islnds to the virulence of fculttive cteril pthogens. // Environ. Microiol. – 2013. – Vol. 15. – o. 2.

P. 307-312.

7. Ohnishi M., Kurokw K., yshi T. Diversifiction of Eii i genomes: re cteriophges the mjor contriutors? // Trends Microiol. – 2001. – Vol. 9. – o. 10. –. 481-485.

8. Fruque.M., ser I.B., Islm M.J. et l. esonl epidemics of choler inversely corre lte with the prevlence of environmentl choler phges. // roc. tl. cd. ci. U – 2005. - Vol.

102. – o. 5. –. 1702–1707.

9. irny J.-., Vereken G., Rose T., Jennes., izi M., uys I., Lvigne R., Merishvili M., Vneechoutte M., Buckling., DeVos D. Introducing yesterdy’s phge therpy in tody’s medi cine. // Future Virol. – 2012. – Vol. 7. – o. 4. –. 379–390.

DETECTION OF THE VIRULENCE DETERMINANTS IN THE BACTERIOPHAGE GENOMES Bannov V.A., Fursova N.K., Volozhantsev N.V., Korovkin S.A., Svetoch E.A.

Key words: big, izn gn nf, vin gn T d n viw f biin nd ximn d nning f big in izn nd vi gn nf f vin dminn f mn gn.

Биология фагов УДК 619: ПОИСК И СЕЛЕКЦИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PROVIDENCIA Барт Н. Г., ассистент, тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart 1967@mail.ru Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: fvm.zol@yandex.ru Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, бактерии рода Pvidni, выделение, селекция, пассирование, методики, индукция.

В данной статье представлены результаты работы по выделению бактериофагов Pvidni, используя методики по выявлению профага и выделению фагов из обектов внеш, ней среды. Профаги методом индукции не выделены. Из обектов внешней среды выделено фагов.

Актуальность исследования. Бактерии рода Pvidni ранее относились к одному из видов рода P семейства Enbi. Самостоятельное название род Pvidni он получил лишь в 193 году на основе Международной классификации Enbi. В 9-ом издании «Определителя бактерий Берджи» (1997) род Pvidni представлен 5 видами:

P.gifin, P.gi, P.ii, P.imb, P.iginii, отличающиеся друг от друга неко торыми биохимическими свойствами [2].

Бактерии рода Pvidni широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормаль ной микрофлоры кишечника, однако среди них встречаются и варианты, способные вызывать вспышки гастроэнтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей, желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [1, 3].

При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной которых являются представители рода Pvidni, существует ряд трудностей. Одна из них состоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их культуральные и био химические свойства, сходные с бактериями рода P. Трудоемкость и материалоемкость делают бактериологический метод неэффективным в современных условиях. В связи с этим возникла необходимость в поиске ускоренного метода индикации и идентификации Pvidn i с использованием специфических бактериофагов [4, 5]. Исходя из этого, цель наших иссле дований – выделение и селекция фагов Pvidni.

Материалы и методы. Индикаторными культурами при выделении изолятов фагов служили штаммы Pvidni. Исследование материала на присутствие фагов и изучение их биологических свойств проводили по методикам: М. Адамс [1], Д.М. Гольдфарба [2], С.Н. Зо лотухиным [4], И.П. Ревенко [5].

Результаты исследований. Выделение фагов бактерий рода Pvidni из исследуемо го материала проводили, используя несколько методик. В первой серии опытов использовали методику выделения фагов из бактерий без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на культуры Pvidni, исследуемые как «лизогенные», мы воздейство вали индуцирующим фактором. Использовалась методика Гольдфарба (192). На подсушен ный газон 18-ти часовой культуры воздействовали ультрафиолетовыми лучами в течение 5- минут (интервал составил 2 минуты) при помощи бактерицидной лампы, 80 % энергии кото рой приходится на длину волны 2537, на расстоянии 50 см между лампой и объектом). Затем делали смыв культуры Pvidni стерильным физиологическим раствором, смыв фильтрова Биология фагов ли и полученный фильтрат исследовали на наличие фага на индикаторной культуре Pvidn i методом агаровых слоев по Грациа. Поиск профага в исследуемых культурах Pvidni методом индукции не привел к положительным результатам.

Поэтому, третьим этапом наших исследований было использование методики по вы явлению фагов из объектов внешней среды по Адамсу (191). Первоначально готовили смесь мясо-пептонного бульона с исследуемым объектом (почва, сточные воды, фекалии) в соот ношении 10:1, добавляли индикаторные культуры и термостатировали посевы 2-3 суток при температуре 37 0С. Затем смесь очищали от механических примесей фильтрованием, центри фугировали при 3000 об./мин, прогревали при 0 0С в течение 30 минут и исследовали на на личие фага методом «стекающая капля».

На поверхность 1,5 % мясо-пептонного агара в чашках Петри наносили пипеткой 3– капли 18–ти часовой бульонной культуры Pvidni, которую стерильным шпателем расти рали по поверхности среды. Чашки ставили в термостат при 37 0С для подсушивания газона на 20-30 минут. Чашку делили на два сектора при помощи маркера. На поверхность засеянной среды наносили исследуемый на наличие бактериофага субстрат и наклоняли чашку Петри так, чтобы капля стекла, на вторую половину таким же образом наносили мясо-пептонный бульон (для контроля). Посевы ставили в термостат (температура 37 0С), учет результатов про водили через 18 часов. Наличие зон лизиса на газоне роста свидетельствовало о присутствии в исследуемом материале бактериофага Pvidni.

Выделение чистых линий фага и их селекцию проводили путем последовательных десяти пассажей морфологически однотипных негативных колоний на плотных питательных средах на индикаторной культуре Pvidni в соответствии с методикой, описанной и ис пользованной Золотухиным [5].

В результате проведенных исследований по выявлению специфичных бактериофагов рода Pvidni, было установлено, что имеющиеся у нас 28 штаммов культур рода Pvidn i не проявляли лизогенных свойств. Феномен профага выявлен не был. Используя методику выделения фагов из объектов внешней среды, нами было выделено 1 специфичных для рода Pvidni фагов, являющихся заведомо вирулентными. «Чистые линии» выделенных фагов Pvidni мы десятикратно пассировали на индикаторных культурах, что значительно повы шало титр их литической активности.

Библиографический список 1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) М., 191. С. 521.

2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз, 191. С.297.

3. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных.

Ульяновск, 2004. С. 125.

4. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. Ульяновск, 2005. С.48-51.

5. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев:

«Урожай», 1978. С.20-21.

SEARCH AND SELECTION OF BACTERIOPHAGES PROVIDENCIA Bart N.G., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.

Кey words: big, bi f gn Pvidni, in, in, ging, md, indin.

Ti i n f wk n in f big Pvidni, ing md f idnifiin f g nd in f g fm bj Биология фагов f nvinmn. T g wn’ igigd b md f indin. 16 g w d fm nvinmn bj.

УДК 619: ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ РОДА PROVIDENCIA Барт Н. Г., ассистент, тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: bart 1967@mail.ru Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: fvm.zol@yandex.ru Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, E-mail: dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, Pvidni, литическая активность, терморези, стентность, специфичность.

В данной статье представлены результаты работы по выделению и изучению неко торых биологических свойств бактериофагов Pvidni. В результате исследований были изучены: литическая активность, терморезистентность и специфичность.

Бактерии рода Pvidni широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий и мочи животных и человека [4].

Некоторые штаммы, вероятно, входят в состав нормальной микрофлоры кишечника, однако среди них встречаются и патогенные варианты, способные вызывать вспышки гастро энтеритов, токсикоинфекций мочевых инфекций у детей и взрослых людей, раневые послеопе рационных инфекций, желудочно-кишечных заболеваний у молодняка животных [5].

Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременности диа гностики болезни, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики заболева ний, вызываемых указанными микроорганизмами, является актуальной проблемой.

При постановке диагноза бактериологическим методом на заболевания, причиной ко торых являются представители рода rovidenci, существует ряд трудностей. Одна из них со стоит в том, что основой идентификации этих бактерий являются их биохимические свойства.


Трудоемкость и длительность изучения ферментативных свойств не позволяют быстро и точно идентифицировать названные микроорганизмы.

В связи с этим возникла необходимость в поиске альтернативных методов лаборатор ной диагностики, которые были бы менее трудоемкими, более быстрыми и доступными для лабораторий любого уровня. Одним из таких методов является фагодиагностика [1- 3, 5-8].

Поэтому целью наших исследований явилось изыскание активных бактериофагов, лизирующих патогенные штаммы бактерий рода rovidenci.

Материал и методы исследования.

Источником для выделения бактериофагов служили сточные воды взятые из животно водческих помещений разных хозяйств Ульяновской и Самарской областей и больниц города Ульяновска.

В качестве индикаторных культур были использованы 2 патогенных штаммов рода rovidenci, полученные из музея кафедры и выделенные нами из патологического материала и объектов внешней среды.

В основу метода для поиска фагов положена схема, предложенная Грациа [1-3]. Ис Биология фагов следуемый материал (сточные воды) засевали с бактериями rovidenci на МПБ. Бульон инку бировали при 37°С в течение 14-18 часов, затем фильтровали через бумажные фильтры. Полу ченный фильтрат подогревали при 0°С в течение 30 минут для инактивации сопутствующей микрофлоры. Наличие фага в фильтрате выявляли при его посеве на плотные питательные среды (1,5% мясопептонный агар) методом агаровых слоев.

Селекцию штаммов фагов производили методом пассирования штаммов на индика торных культурах с последующим клонированием однородных негативных колоний, типич ной для каждого изолята.

Активность выделенных фагов определяли по методам Грациа и Аппельмана [1- 3].

Результаты и выводы исследования В результате проведенных исследований нами было выделено 1 термостабильных изолята бактериофагов, образующих прозрачные колонии различного диаметра от 1,0 до 5, мм (рис.1) или стерильные пятна в виде зон лизиса, диаметром от 5,0 до 9,0 мм (рис.2). Ли тическая активность выделенных фагов по методу Аппельмана составляет от 10- до 10-9, по методу Грациа – от 2,1х108 до 1,2х1011 фаговых корпускул в 1 мл среды.

Рис.1- Негативные колонии бактериофагов рода Pvidni (штамм фага F-67 УГСХА) Рис.2 - Негативные колонии бактериофагов рода Pvidni (штамм фага F-87 УГСХА) Изучение специфичности двух бактериофагов (F-7 УГСХА, F-87 УГСХА), имеющих высокую активность и широкий диапазон литического действия проводили по отношению к Биология фагов представителям других родов семейства Enteroctericee: Escherichi spp., roteus spp., Mor :.,., gnell spp., itrocter spp., lmonell spp., Enterocter spp., Yersini enterocolitic, а также родов других семейств: tphylococcus spp., treptococcus spp., seudomons spp. на плотном питательном агаре методом нанесения капель фагов на газон исследуемой культуры [1- 3].

Для этого на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3 – 4 капли 18 ча совой бульонной культуры исследуемых микроорганизмов. Затем равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на – 20 минут. После чего, дно чашки маркером разделили на два сектора: на первый сектор засеянного агара, пипеткой легким прикосновением капли, наносили исследуемый фаг;

на второй - по центру в качестве контроля наносили стерильный МПБ. Чашку наклоняли, чтобы капли стекли, а затем ин кубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили через 24 часа.

В результате проведенных исследований было установлено, что селекционированные фаги неактивны по отношению к представителям бактерий других родов и семейств, тоесть явились специфичными для бактерий гомологичного рода.

Таким образом, нами было выделено и селекционировано 1 термостабильных изо лятов фагов, активных в отношении бактерий вида rovidenci rettgeri (табл.1).

Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов рода Pvidni Активность фагов № Название фага Индикаторная культура пп по Аппельману по Грациа P.gi Н 1 F-7 УГСХА 10-9 1 х P.gi С 2 F-87 УГСХА 10 1,5 х - P.gi Н 3 F-3 УГСХА 10-8 7 х P.gi С 4 F-4 УГСХА 10 5 х - P.gi М 5 F-5 УГСХА 10-8 1 х P.gi Н F- УГСХА 10 1,1 х - P.gi С 7 F-7 УГСХА 10-8 1 х P.gi С 8 F-8 УГСХА 10 7 х - P.gi М 9 F-9 УГСХА 10-8 2 х P.gi Н 10 F-10 УГСХА 10 4 х P.gi Н 11 F-11 УГСХА 10-8 1 х P.gi Д 12 F-12 УГСХА 10 2 х - P.gi К 13 F-13 УГСХА 10-8 2,5 х P.gi К 14 F-14 УГСХА 10 2,5 х - P.gi Н 15 F-15 УГСХА 10-8 8 х P.gi М 1 F-1 УГСХА 10 5 х - Были отобраны два специфичных штамма фагов с наиболее выраженными биологи ческими свойствами, которые позволяют использовать их для изготовления диагностических биопрепаратов.

Библиографический список 1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с английского) // - М., - 191. -521С.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии // Учеб ное пособие – Ульяновск. – 1988. – С.45.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// -М.: Медгиз. -191. – С.297.

4. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. 125 с., Ульяновск., -2004.

5. Золотухин С.Н., Каврук Л.С., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят Биология фагов и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. – Ульяновск. – 2005. – С.48-51.

. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:

«Урожай», 1978. –С.20-21.

CHARACTERISTICS OF BACTERIOPHAGES OF GENUS PROVIDENCIA Bart N.G., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.

Кey words: big, Pvidni, i ivi, min, ifii.

Ti i n f wk n in nd d f m bigi i f big Pvidni. A f w did: i ivi, min nd ifii.

УДК 578.81:579. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И СЕЛЕКЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ BORDETELLA BRONCHISEPTICA Васильева Ю.Б., кандидат ветеринарных наук, доцент 8(8422) 55-95-47, vet_yulua@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Семанина Е.Н., научный сотрудник НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Bd bnii, выделение фагов, свойства бактериофа, гов В статье освещён вопрос по разработке методов выделения бактериофагов, актив ных в отношении Bd bnii. Приведены результаты собственных научных ис.

следований биологических свойств выделенных бактериофагов: морфология негативных коло ний, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, тем пературная устойчивость, устойчивость к действию хлороформа и изменение литической активности при хранении.

Введение. В настоящее время отечественные и зарубежные исследователи особое вни мание уделяют диагностике малоизученных инфекционных заболеваний животных и людей, характеризующихся затяжным течением, а нередко и летальным исходом. К таким инфекциям относится бордетеллёз - коклюшеподобное заболевание собак, кошек и других домашних и сельскохозяйственных животных, возбудитель которого, Bd bnii, может вы зывать и у людей респираторные заболевания по типу ОРВИ [2,8,10].

Учёными НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи охарактеризованы бактериофаги микроорганиз мов рода Bd, выделенные из бактерий коллекции ВОЗ и клинических штаммов, бак териофаги B-1, BM-1 и BI-1 B.bnii. Эти данные использованы для разработки тест-систем для идентификации ДНК возбудителя коклюша и его фазовых вариантов с помо щью полимеразной цепной реакции. Метод рекомендуется для диагностики коклюша у детей с симптомами затяжного кашля, а также выявления атипичных, бессимптомных форм заболе Биология фагов вания [9].

Научно-исследовательской группой НИИМиБ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им.

П.А. Столыпина разработаны полимеразно-цепная реакция для идентификации возбудителя бордетеллёза животных и бактериологическая схема выделения B.bnii с примене нием селективно – диагностической питательной среды УГСХА BBR 57, позволяющая поста вить диагноз в течение 9 часов [2,3].

Эти современные и эффективные методы диагностики также имеют и ряд недостатков в практическом применении. Для проведения генетической диагностики необходимо наличие специализированной лаборатории с дорогостоящей приборной базой и высококвалифициро ванными работниками. Микробиологические методы диагностики бордетеллёза достаточно трудоёмки (выделение культуры возбудителя на селективных средах, биохимическая иденти фикация и т.п.), дорогостоящи и малопроизводительны.

Поэтому остро встает задача создания высокочувствительных и специфичных средств и методов диагностики бордетеллёза не требующих больших затрат времени и труда, а также экономически выгодных.

Мы считаем, что заслуживает пристального изучения разработка методов выделе ния бактериофагов B. bnii с перспективой создания биопрепарата для диагностики бордетеллеза животных. Данное научное направление, по нашему мнению, весьма актуально, представляет научный и практический интерес.

В связи с вышесказанным целью данной научной работы явилась разработка методов выделения фагов B. Bnii с изучением их основных биологических свойств.

Для решения поставленной цели перед нами стояли следующие задачи:

1. Апробировать различные схемы выделения бактериофагов, активных в отношении B. Bnii и подобрать наиболее эффективный метод.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфоло гию негативных колоний, литическую активность и её спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу.

3. Провести селекцию выделенных фагов и подобрать оптимальный набор для даль нейшего конструирования на их основе нового диагностического биопрепарата.

Материалы и методы исследований. Объектами для наших исследований послужи ли 5 референс-штаммов B. bnii № 1, № 7, № 214, № 2207, № 8344 и штамм Bd i № 119;

24 референс-штамма бактерий других родов (Yini db i № 0630, Mgn mgnii, № АТСС 25923, Eii i № 4, № АТСС 25922, P mibii № 1, № 523, № 491, mn imim № 82, Cib fndii, Kbi nmni, En fi № 189, Pvidni gi № 104а, № 102д, № 175, Amn di № 01, № 02, Pdmn id № 12633, № 901, Enb № 1487, № 10005, Bi № 2527, Bi bii № 6633), полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экс пертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА» им. П.А. Столыпина, которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами;

48 штаммов B. bnii, выделенных от собак и кошек (с клиническими проявлениями респираторных заболеваний);

8 штаммов фагов B. bnii.

Обекты внешней среды: сточные воды, смывы с глотки больных животных, патоло гический материал от больных и павших животных.

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар, среда Эндо, казеиново-угольный агар, бордетелл-агар, кровяной агар и среда Борде-Жангу, среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом, биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов, агар-агар, натрий хлорид, мочевина, пере кись водорода, желатин, среда УГСХА BBR 57.

Биология фагов В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и идентификации бактерий [4].

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили с помощью методов, предложенных М. Адамсом (191), Д.М. Гольдфарбом (191), И.М. Га бриловичем (1973), С.Н. Золотухиным (200) [1,4,5,,7]. Постановку РНФ для индикации B.

bnii в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным Д.М. Голь дфарбом (191) [].

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследований штаммов B. bnii на наличие профага нами установлено, что культуры без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Проведено 17 опытов, без положи тельных результатов.

Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов B. bnii из объектов внешней среды и от животных. Всего нами исследовано 104 пробы, бактериофаги среди них не обнаружены.

В третьей серии опытов на культуры B. bnii воздействовали индуцирующим фактором (ультрафиолетовыми лучами).

Опыты по облучению бактерий УФЛ проводили с изменением параметров экспозиции в минутах и расстояния до объекта в см. В результате исследований по выделению профага из бактериальных клеток наиболее эффективной показала себя следующая схема:

1 день: посев газоном суточной культуры B. bnii на мясопептонный агар, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с рас стояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек Петри с обработанными бакте риями в термостате при 37С в течение суток.

2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. По мещение чашек Петри в термостат (37С) на сутки.

3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. По мещение чашек Петри в термостат (37С) на сутки.

4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.

день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон ли зиса.

После выделения бактериофаги пассировали для повышения их литической активно сти. В процессе работы по выделению бактериофагов с применением УФЛ в общей сложности нами было проведено 29 экспериментов. Описанным выше методом нам удалось выделить фагов B. bnii из 14 штаммов бактерий. штаммов бактерий B. bnii не про явили лизогенных свойств.

Далее мы изучили биологические свойства выделенных бактериофагов.

Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизи са, вторичного роста и величине колоний мы разделили на два типа. К первому типу отнесли негативные колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по периферии 0,5 – 4 мм или без неё: B.r. – 7 УГСХА, B.r. –2207 УГСХА, B.r. – 214 УГСХА.

Ко второму типу причислили круглые, прозрачные или полупрозрачные колонии, с ровными краями, диаметром до 2 мм: B.r. – 1 УГСХА, B.r. – 10 УГСХА, B.r. – 11 УГСХА, B.r. – УГСХА и B.r. – 8344 УГСХА.

Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 5,3 х 107 до 4,3 х Биология фагов 109. По исследованным параметрам для конструирования диагностического набора фагов ото браны наиболее активные их них: B. bnii - 1 УГСХА по Аппельману 10-7, по Грациа 3,1 х 108 и B. bnii - 7 УГСХА по Аппельману 10-8, по Грациа 4,3 х 109.

Для изучения спектра литического действия выделенных фагов мы использовали культуры бактерий B. bnii.

По результатам исследований наибольшим совместным спектром литического дей ствия обладали бактериофаги B. bnii - 1 УГСХА и B. bnii - 7 УГСХА. Они лизировали 92,5 % имеющихся штаммов.

Учитывая литическую активность и спектр литического действия бактериофагов B.

bnii для дальнейших исследований нами было отобрано 2 фага – B. bnii – УГСХА и B. bnii – 7 УГСХА.

При изучении специфичности действия исследуемых фагов B. Bnii в каче стве гетерологичных культур использовали микроорганизмы указанные в материалах и мето дах. Нами было установлено, что бактериофаги B. r. - 1 УГСХА и B. r. - 7 УГСХА не вызы....

вали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий.

В результате исследований температурной устойчивости было установлено, что про гревание фагов B. r. – 1 УГСХА и B. r. – 7 УГСХА при температуре 0С в течении 30 минут не оказало влияния на активность фагов, бактерии погибали при данной температуре. Нагре вание бактериофагов свыше 5С приводило к потере их активности.

В результате проведенных исследований по изучению устойчивости бактериофагов к воздействию хлороформом установлено, что бактерии инактивируются при 10 минутной обра ботке. Бактериофаги B.r. – 1 УГСХА и B.r. - 7 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут. Наблюдалось снижение активности фагов при обработке хлороформом свыше 30 минут с 2,2 х 108 до 3,2 х 107 у B.r. – 1 УГСХА и с 2,1 х до 5,3 х 107 у B.r. - 7 УГСХА по методу Грациа. Активность бактериофагов B.r. – 1 УГСХА и B.r. – 7 УГСХА восстанавливалась после одного пассажа.

Затем мы провели селекцию выделенных бактериофагов по основным биологическим свойствам для дальнейшего использования в конструировании диагностического биопрепа рата. Отобранные фаги имели прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром 0,5-4,0 мм, литическую активность более 10- по Аппельману, и 5,3 х 107 по Грациа корпускул в 1 мл фаголизата.

Заключение. Мы рекомендуем к применению разработанный нами метод выделения фагов B. bnii путём многократного воздействия ультрафиолетовыми лучами на бак териальную клетку по схеме: 1 день: t = 5-7 мин;

= 1м. 2 день: t = 7-10 мин;

= 1м. 3 день: t = 7-10 мин;

= 0,5м), где t – экспозиция, – расстояние от лампы до объекта. По данной схеме нами было выделено 8 штаммов бактериофагов B. bnii со следующими свойствами:

литической активностью от 10- до 10-9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по ме тоду Грациа, спектром литического действия от 20,8 % до 81,1%. Выделенные бактериофаги были строго специфичны по отношению к B. Bnii, не лизировали бактерии других видов и родов;

проявляли устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживали 30 минутное нагревание при 0С.

Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать бактериофаги B.r. – 1 УГСХА и B.r. – 7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой литической активностью по Аппельману 10-7 – 10-8, по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл. Результаты исследований могут быть рекомендованы для дальнейшего кон струирования диагностического биопрепарата.

Библиографический список 1. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 191. – 521 с.

2. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Применение по Биология фагов лимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных. // Есте ственные и технические науки. – 2010. - № 5 – С. 230-232.

3. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Выделение и идентификация Bd bnii от животных // Естественные и технические науки.

– 2010. - № 5 – С. 233-235.

4. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Никишина Н.М. Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии. -Ульяновск, 1998. – 151 с.

5. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.

. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 191. – 225 с.

7. Золотухин С.Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С.Н. Золотухин, Л.П.

Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. – 2004. – № 12. – С. 50-53.

8. Bjornstd O.. Evolution nd emergence of Bordetell in humns / O.. Bjornstd, E.T.

rvill // Trends Microiol. – 2005. – 13. – Р. 355-359.

9. Krtev G.I., Lpjev I.., Ryinin O.., Meel. Detection of new cteriophge in Bordetell.//FEM- symposium ertussis. Berlin, GDR.- 1988.- p.20.

10. Mttoo. Role of Bd bnii fimrie in trchel coloniztion nd devel opment of humorl immune response /. Mttoo, J.F. Miller,.. otter // Infect. Immun. – 2000.

– 8. – Р. 2024-2033.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 



Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.