авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 |
-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ

ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И

БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

«ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ»

РОСПОТРЕБНАДЗОРА (ФГУН ЦНИИЭ РОСПОТРЕБНАДЗОРА)

НАЦИОНАЛЬНОЕ НАУЧНОЕ ОБЩЕСТВО ИНФЕКЦИОНИСТОВ

VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА – 2010»

СБОРНИК ТРУДОВ Под редакцией академика РАМН В.И. Покровского ГЕНЕРАЛЬНЫЙ СПОНСОР: ООО «ИнтерЛабСервис»

ТОМ V Москва УДК 577.21 ББК 28.04 М75 СОСТАВ РЕДАКцИОННОЙ КОЛЛЕГИИ:

Покровский В.И. (главный редактор) Шипулин Г.А. (ответственный секретарь) Альварес Фигероа М.В.

Астахова Т.С.

Гущин А.Е.

Карань Л.С.

Куевда Д.А.

Маркелов М.Л.

Подколзин А.Т.

Чуланов В.П.

Шипулина О.Ю.

Яцышина С.Б.

М75 Молекулярная диагностика. сб. трудов/колл. авт., под. ред. В.И. Покровс кого. – т. V – М.: ООО «Рекламное Агентство «ЭйВиДжи», 2011. – 168 c.

В пятом томе представлены результаты научных исследований российских и зарубежных специалистов в области молекулярной диагностики социально значимых инфекционных болезней человека. Освещаются вопросы использова ния молекулярно-биологических методов в диагностике и изучении ВИЧ и ВИЧ ассоциированных инфекций, вирусных гепатитов, туберкулеза, особо опасных инфекций. Отдельные разделы сборника включают работы, посвященные исполь зованию молекулярных методов диагностики для обеспечения инфекционной без опасности в трансфузиологии и трансплантологии, работы, посвященные вопросам молекулярной диагностики оппортунистических инфекций.

Для специалистов в области лабораторной диагностики и научных работников.

Сборник будет интересен врачам-лаборантам, инфекционистам, гинекологам, урологам, дермавенерологам, гепатологам, пульмонологам, трансфузиологам и трансплантологам, генетикам, судебно-медицинским экспертам, эпидемиологам, врачам общей практики, ветеринарным врачам, а так же студентам медицинских и ветеринарных учебных заведений Издано в Российской Федерации по решению Организационного комитета VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010».

® Редакционная коллегия СОСТАВ ОРГАНИзАцИОННОГО КОМИТЕТА VII ВСЕРОССИЙСКОЙ НАУчНО-ПРАКТИчЕСКОЙ КОНфЕРЕНцИИ «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА – 2010»

СОПРЕДСЕДАТЕЛИ:

Онищенко Г.Г. – руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благо получия человека, Главный санитарный врач России, академик РАМН Покровский В.И. – директор Федерального государственно го учреждения науки «Центральный научно исследовательский институт эпидемиологии»

Федеральной службы по надзору в сфере защи ты прав потребителей и благополучия человека, академик РАМН ОТВЕТСТВЕННЫЙ СЕКРЕТАРЬ:

Шипулин Г.А. – заведующий отделом молекулярной диагно стики и эпидемиологии ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемио логии» Роспотребнадзора, кандидат медицин ских наук чЛЕНЫ ОРГАНИзАцИОННОГО КОМИТЕТА:

Борисевич И.В. – директор ФГУН «Государственный научно исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препа ратов им. Л.А. Тарасевича» Роспотребнадзора, доктор медицинских наук, профессор Вороненко Ю.В. – ректор Национальной медицинской акаде мии последипломного образования имени П.Л. Шупика, Киев, Украина, член корреспондент АМН Украины Гинцбург А.Л. – директор Учреждения РАМН «Научно исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи», академик РАМН 4 Молекулярная диагностика Дятлов И.А. – директор ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехно логии» Роспотребнадзора, профессор, доктор медицинских наук Ежлова Е.Б. – начальник Управления эпидемиологического надзора Роспотребнадзора Жебрун А.Б. – директор ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпи демиологии и микробиологии им. Пастера»

Роспотребнадзора, член-корреспондент РАМН Иванов П.Л. – руководитель Специализированного центра молекулярно-генетических экспертиз РЦСМЭ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор био логических наук, профессор Игнатьев Г.М. – директор Республиканского научно практического центра эпидемиологии и микро биологии, Минск, Беларусь, доктор медицин ских наук, профессор Куевда Д.А. – заместитель заведующего отделом молеку лярной диагностики и эпидемиологии ФГУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора Куличенко А.Н. – директор ФГУЗ «Ставропольский научно исследовательский противочумный институт»

Роспотребнадзора, доктор медицинских наук, профессор Кутырев В.В. – директор ФГУЗ «Российский научно исследовательский противочумный инсти тут «Микроб» Роспотребнадзора, член корреспондент РАМН Меньшиков В.В. – заведующий лабораторией проблем клинико-лабораторной диагностики Научно исследовательского центра Московской меди цинской академии имени И.М. Сеченова, доктор медицинских наук, профессор Том V.

Михайлов М.И. – директор Учреждения РАМН «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.

М.П. Чумакова», доктор медицинских наук, про фессор Мусабаев Э.И. – директор Научно-исследовательского института вирусологии, Ташкент, Республика Узбекистан, доктор медицинских наук, профессор Панин А.Н. – директор Федерального государственного учреждения «Всероссийский государствен ный Центр качества и стандартизации лекар ственных средств для животных и кормов»

Федеральной службы по ветеринарному и фито санитарному надзору, академик РАСХН Покровский В.В. – руководитель Федерального научно методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом Федерального государ ственного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемио логии» Роспотребнадзора, академик РАМН Поляков А.В. – руководитель лаборатории ДНК-диагностики Медико-генетического научного центра РАМН, доктор биологических наук, профессор Сергиев В.П. – директор Института медицинской пара зитологии и тропической медицины им.

Е.И. Марциновского Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, академик РАМН Скрябин К.Г. – директор Центра «Биоинженерия» Российской академии наук, академик РАН и РАСХН Тутельян В.А. – директор Учреждения РАМН «Научно исследовательский институт питания», акаде мик РАМН Шевырева М.П. – директор Департамента охраны здоровья и санитарно-эпидемиологического благополучия человека Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, доктор медицинских наук Раздел 1.

ВИч И ВИч-АССОцИИРОВАННЫЕ ИНфЕКцИИ Том V. Раздел 1. ВИЧ и ВИЧ-ассоциированные инфекции ИзУчЕНИЕ ГЕНЕТИчЕСКИХ И БИОЛОГИчЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ИзОЛЯТОВ CRF02_AG ВИч-1, цИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ Гашникова Н.М., Тотменин А.В., Сафронов П.ф., Богачев В.В., Барышев П.Б., Никонорова Ю.В., Унагаева Н.В., Лаптева Т.А., 1 Мещерякова Ю.В., 1черноусова Н.Я., Ставский Е.А.

ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Новосибирская область, Россия;

1ГБУЗ Новосибирский областной Центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, Кольцово, Новосибирская область, Россия Введение. Необычайно высокая изменчивость ВИЧ создает колос сальные проблемы диагностики и лечения. Существующие на сегод няшний день методические подходы для создания кандидатных вакцин, противовирусных препаратов, алгоритмов для анализа био логических свойств ВИЧ основаны на знаниях и разработках приме нительно к ВИЧ-1 субтипа В. Тем не менее существуют определенные отличия в патогенезе ВИЧ-инфекции, вызванной разными субтипами вируса, значимость которых до сих пор не определена. Поэтому выде ление изолятов ВИЧ не В субтипов и изучение их генетических осо бенностей и биологических свойств остается актуальным.

Целью исследования было выделение и изучение свойств изолятов ВИЧ-1 циркулирующей рекомбинантной формы 02_AG, быстро рас пространяющейся на территории Новосибирской области.

Материалы и методы. Для выделения первичных изолятов ВИЧ- в работе использовали венозную кровь от пациентов, инфицирован ных ВИЧ-1 в 2008-2010 годах. Сбор образцов крови осуществляли на базе Новосибирского областного Центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями. Выделение первичных изолятов ВИЧ-1 проводили согласно протоколу ВОЗ. Генетическую характеризацию ВИЧ-1 осуществляли путем определения и анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса, коди рующих области гена полимеразы (pol) и основного белка оболочки (env).

Основные результаты. Проведено исследование 21 изолята CRF02_AG ВИЧ-1. Все изоляты относятся к CCR5-тропным вирусам, большая часть (19) изолятов ВИЧ является быстро реплицирующи мися вирусными вариантами, характеризующимися способностью к накоплению высокой концентрации вирусного белка р24 в культу 8 Молекулярная диагностика ральной жидкости. Установлено, что варианты ВИЧ, выделенные до 2008 г., генетически близки к референс-штаммам, циркулирующим в Африке и в странах Средней Азии. Изоляты CRF02_AG, выделенные в конце 2009 – начале 2010 гг., формируют отдельную ветвь филоге нетического дерева.

Выводы. Филогенетический анализ выделенных в Новосибирской области вариантов CRF02_AG ВИЧ-1 показал, что на данной тер ритории сформировался собственный очаг эпидемии, вызванный проникновением в человеческую популяцию генетических вариан тов CRF02_AG ВИЧ-1, которые обуславливают дальнейшее рас пространение ВИЧ-инфекции. Инфицирование CRF02_AG ВИЧ- выявлено при употреблении наркотических препаратов внутривенно, при гетеросексуальных половых контактах и при рождении ребёнка от инфицированной ВИЧ матери. Созданная коллекция генетически и биологически охарактеризованных изолятов CRF02_AG ВИЧ- позволит провести углубленные исследования особенностей биологии циркулирующей рекомбинантной формы 02_AG ВИЧ-1, не распро странявшейся ранее на территории России.

РАзРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В ЛАБОРАТОРНУЮ ПРАКТИКУ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АЛЛЕЛИ HLA B*5701 ГЛАВНОГО КОМПЛЕКСА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ С цЕЛЬЮ ИСКЛЮчЕНИЯ СЛУчАЕВ ВОзНИКНОВЕНИЯ РЕАКцИИ ГИПЕРчУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПРИ ИСПОЛЬзОВАНИИ АБАКАВИР-СОДЕРЖАЩЕЙ ТЕРАПИИ Киреев Д.Е., Куевда Д.А.

ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия.

Введение.

В настоящее время во многих странах, в том числе и в России, широ ко используется антиретровирусный препарат абакавир. Абакавир является нуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы и применяется совместно с другими антиретровирусными препаратами для лечения ВИЧ-инфекции. Несмотря на его эффективность, суще ствует серьезное ограничение при назначении пациенту вследствие возможного возникновения реакции гиперчувствительности (РГЧ).

РГЧ к абакавиру – это мультиорганный клинический синдром, обыч но проявляющийся в течение первых 6 недель после начала приема Том V. Раздел 1. ВИЧ и ВИЧ-ассоциированные инфекции абакавира. В случае отмены препарата симптомы РГЧ пропадают, однако в случае повторного применения, более серьезные, они воз никают вновь и могут явиться причиной смерти пациента. В году была обнаружена связь между возникновением РГЧ и наличием у пациента аллели B*5701 главного комплекса гистосовместимости I-го класса. Дальнейшие клинические исследования, проведенные в Западной Австралии, Великобритании и Франции, подтвердили сильную корреляцию РГЧ и носительства HLA-B*5701. Для оконча тельного подтверждения гипотезы было проведено широкомасштаб ное исследование PREDICT. Это было проспективное двойное слепое исследование, включавшее 1660 пациентов, которым планирова лось назначение схемы антиретровирусной терапии с абакавиром.

Пациенты были разделены на две группы: контрольную и исследуе мую. Всем пациентам контрольной группы была назначена абакавир содержащая терапия, в то время как пациентам исследуемой группы сначала был проведен анализ на наличие аллели B*5701 и только в случае ее отсутствия назначалась терапия, содержащая абакавир.

По результатам исследования прогностическая ценность отрицатель ного результата анализа составила 100%. В настоящее время по аме риканским, европейским и российским рекомендациям по лечению ВИЧ-инфицированных анализ на наличие аллели В*5701 необходимо проводить перед назначением абакавир-содержащей терапии.

Цель и задачи.

Целью нашей работы являлось создание теста для обнаруже ния аллели HLA B*5701, его валидация относительно референсных методик и клиническая апробация в соответствующих медицинских учреждениях.

Материалы и методы.

Материалом при разработке и валидации теста служили 13 рефе ренсных образцов ДНК и зашифрованная панель, содержащая образца ДНК. Обе группы были заранее охарактеризованы рефе ренсной методикой SSP (sequence specific primers), а образцы содер жащие аллель B*5701 дополнительно проанализированы методом секвенирования. Образцы были любезно предоставлены доктором E.

Hammond (Murdoch University, Австралия). Клиническая апробация набора реагентов проводилась на 300 образцах крови, либо соскобах со слизистой ВИЧ-инфицированных и здоровых доноров, собранных на территории России.

Основные результаты.

На первом этапе разработки теста, на основании выравнива ния нуклеотидных последовательностей аллелей главного комплек са гистосовместимости человека 1-го и 2-го классов были подо 10 Молекулярная диагностика браны специфические олигонуклеотиды. Данные олигонуклеотиды были расположены таким образом, чтобы происходила эффективная амплификация фрагмента ДНК аллелей, относящихся к группы В*57.

Дальнейшая дискриминация производилась с помощью меченого олигонуклеотида (зонда). Такая система с помощью метода ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме “реального времени” позволяла обнаруживать только аллель В*5701 и несколько других редко встре чаемых аллелей группы В*57 и дискриминировать все остальные аллели.

Результаты тестирования ДНК от 13 референсных образцов, содержащих следующие варианты аллелей 08**, 0801, 15**, 1502, 25**, 27**, 3701, 40**, 4001, 4201, 44**, 4403, 51**, 5101, 5301, 55**, 5701, 5703, 5704, 5801, 61**, показали 100%-ную специфичность методики. Были получены флуоресцентные кривые, свидетельствующие о положи тельном результате, у 3-х образцов, содержащих аллель В*5701. Для остальных 10 образцов, в том числе образцов, содержащих близ кородственные аллели 5703 и 5704, были получены отрицательные результаты.

На следующем этапе разработанный тест валидировался с помо щью зашифрованной панели, содержащей 384 образца ДНК. После получения результатов тестирования разработанной методикой панель была расшифрована. Данная панель содержала 317 отри цательных образцов, 34 положительных образца и 33 невалидных образца для проверки отсутствия контаминации во время анализа.

Результаты тестирования панели разработанным тестом полностью совпали с результатами, полученными в университете Австралии с помощью референсной методики.

Необходимо было также подобрать эффективный метод ДНК из клинического материала. Основными видами клинического матери ала для разрабатываемого теста являются цельная кровь и соскоб со слизистой, как быстрый и неинвазивный способ получения кле ток пациента. Для таких видов клинического материала наиболее хорошо подходит преципитационный метод выделения нуклеи новых кислот (например, набор реагентов «РИБО-преп» произ водства ФГУН Центрального НИИ эпидемиологии). Результаты экспериментов показали, что данный набор отлично подошел для вышеуказанных целей, позволяя менее чем за час провести каче ственное выделение ДНК из 10 образцов. Для повышения надеж ности теста одновременно с амплификацией мишени – аллели В*5701, в пробирке производится амплификация гена b-глобина, позволяя проводить оценку качества взятия материала и выделе ния ДНК.

Том V. Раздел 1. ВИЧ и ВИЧ-ассоциированные инфекции На заключительном этапе разработки тест был валидирован на образцах крови, либо соскобах со слизистой ВИЧ-инфицированных и здоровых доноров, собранных на территории России. Из 300 про тестированных образцов было выявлено 17 положительных, наличие аллели В*5701 в которых было затем подтверждено с помощью мето дики SSP. Таким образом, распространенность аллели HLA B*5701 в наших исследованиях составила 5,67%. Эти результаты согласуются с данными по распространенности HLA B*5701 в Европе (5-8%).

После окончания разработки в ГИСК им. Л.А. Тарасевича были проведены испытания набора реагентов. В результате успешных испытаний набор был разрешен к производству и применению в РФ и получено регистрационное удостоверение в МинЗдравСоцРазвития (№ФСР 2009/06189 от 3 декабря 2009 года).

Заключение.

Использование антиретровирусного препарата абакавир огра ничивается необходимостью проведения тестирования ВИЧ инфицированных на наличие аллели HLA B*5701 перед его назначе нием. Проведение анализа с помощью референсных методов, таких как SSP и секвенирование, в лечебно-профилактических учрежде ниях затруднено вследствие отсутствия стандартизации процедуры анализа и учета результатов. Велика необходимость в наличии про стого и надежного метода, не уступающего по качеству “золотому” стандарту. Разработанный в Центральном НИИ эпидемиологии набор реагентов позволяет менее чем за три часа провести подобный анализ и для его использования необходимо оборудование, доступное в боль шинстве лабораторий центров СПИД. Данный метод прошел несколь ко этапов валидации, зарегистрирован в Российской Федерации и может быть использован в клинико-диагностических лабораториях центров по борьбе и профилактике со СПИД и других профильных учреждениях.

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕчЕНИЯ И ПРОфИЛАКТИКИ ОНКОзАБОЛЕВАНИЙ У ВИч-ИНфИцИРОВАННЫХ ОСУЖДЕННЫХ Кусая В.В., Сивак В.П.

ООО МФО «Клиника «На Здоровье», Краснодар, Россия При ВИЧ – инфекции максимально повышен риск развития рака шейки матки. Риск данной онкопатологии связан, прежде всего, с установлением этиологической роли вирусов папиллом человека 12 Молекулярная диагностика (HPV) и возможностью создания специфических вакцин. Группа вирусов папиллом (ВЧП) высокого риска включает в первую очередь HPV 16 и HPV 18 типы.

Нами проанализированы сведения о 325 ВИЧ-инфицированных осужденных. Рак шейки матки (РШМ) выявлен у 128 больных, у (26,4%) он был первым признаком ВИЧ-инфекции. РШМ оказался наиболее часто встречающимся при СПИД злокачественной опухоли (55%), за ним следовали лимфома и саркома Капоши.

Вирус папилломы человека (ВПЧ), интраэпителиальная неопла зия шейки матки и иммунносупрессия увеличивали риск развития рака шейки матки. Оказалось, что вирусы папилломы человека (ВПЧ), связанные с раком шейки матки, гораздо чаще встречались у ВИЧ положительных женщин (52%) чем у ВИЧ-отрицательных (15%), диа гностировались методом ПЦР. Вероятность наличия этих видов ВПЧ зависела также от вирусной нагрузки и состояния иммунного статуса женщин. Дисплазия шейки матки также гораздо чаще встречалась у женщин с ВИЧ инфекцией, то есть риск рака связан с длительно стью иммунносупрессии, даже если иммунодефицита в этот период не наблюдалось. ВИЧ-инфекция у них перестает прогрессировать, но часто остается продолжительная иммунносупрессия. Таким образом, даже при применении терапии есть вероятность развития ВПЧ в сли зистой шейки матки, что может приводить к развитию рака. Это еще раз говорит о том, что ВИЧ-положительным необходимы регулярные и внимательные осмотры, которые могли бы выявить патологические изменения шейки матки и что способствовало бы, предотвращению развития онкологических заболеваний.

Один раз в 6 мес в течение 3 лет проводили скрининговые осмо тры, включающие взятие мазков и кольпоскопию. При первом осмо тре ЗППП выявлены у 18 (9%) больных, при последующих осмотрах ЗППП не определялись. При взятии мазков изменения шейки матки обнаружены у 87 больных, при кольпоскопии у 110. Частота лож ноотрицательных результатов при взятии мазков составила 14,2%, а применительно к дисплазии эндоцервикса 2 и 3 степени 3,1%. Среди женщин с дисплазией 1 степени при повторном осмотре у 10% отме чен переход в дисплазию 2 и 3 степени. Из исследований проведен ных нами в пенитенциарной системе видно, что ВЧП-инфекция чаще появлялась у симптоматичных, чем у асиптоматичных ВИЧ - пози тивных женщин. В основном риску инфекции онкогенного вируса и развития злокачественного заболевания подвергались женщины с серьезными поражениями иммунной системы (За, 4 стадии СПИДа).

В исследовании о наличии клеток Лангерганса (биопсии эндо) в шейки матки ВИЧ-серопозитивных женщин (354 осужденных) оказалось, Том V. Раздел 1. ВИЧ и ВИЧ-ассоциированные инфекции что количество этих клеток, играющих антигенпредставляющую роль в иммунном ответе, у них уменьшено по сравнению со здоровыми женщинами (пациентки клиники). Из-за этого местный иммунитет в шейки матки является менее действенным, что дает возможность проявить себя онкогенному ВЧП. Влияние ВЧП подозревалось также при развитии других форм рака половых органов у осужденных (вульва, влагалище). Вирусы могут становиться активными в этих местах при поражении иммунной системы;

однако они остаются латентно присутствующими у женщин с интактной иммунной систе мой. На большом количестве исследований 400 серопозитивных жен щин, находящихся в пенитенциарной системе было определено различие между проявлениями РШМ у тех, которые подвергались заражению ВИЧ путем гетеросексуального контакта, и у тех, кото рые заразились при внутривенном использовании наркотиков ( женщин). В группе гетеросексуальной трансмиссии 7% женщин стра дали тяжелой формой рака, в группе использовавших внутривенные наркотики – 40%. При менее тяжелых формах рака различий в обеих группах не было (обе 7%). Поскольку женщины, употреблявшие вну тривенно наркотики (в основном проститутки) в этом исследовании имели значительно больше половых партнеров, кажется возможным, что различие в частоте встречаемости РШМ связано с повышенной подверженностью лиц внутри этой группы онкогенным, переноси мым половым путем вирусам. Женщины с ВИЧ или ВЧП-инфекцией имели, повышенный риск возникновения карциномы шейки матки.

Женщины с обеими инфекциями подвергались наибольшему риску.

Далее, женщины с ВИЧ-инфекцией в поздней стадии подвергались большему риску рака шейки матки, не позднее чем через 6 мес гинекологическое обследование, при котором брался мазок, кото рый необходим у ВИЧ-серопозитивных женщин для своевременного выявления ВПЧ-инфекции. При этом должно быть отмечено, что при помощи мазка (так называемая онкоцитология) часто не обнаружива ют ВПЧ-инфекцию. Чтобы проверить результат, необходимо наряду с мазком также регулярно (например, ежегодно) проводить кольпо скопическое обследование;

этот метод в данном случае дает более высокую достоверность. Хотя еще не существует оптимальной тера пии больных со связанными с ВИЧ ВЧП-инфекцией и раком шейки матки, предполагается, что их лечение должно быть агрессивнее, чем иммуносостоятельных женщин. К сожалению, женщины с иммунной недостаточностью часто плохо реагируют на общепринятую терапию.

Уже имеющийся в наличии ВЧП никогда не может быть ликвидиро ван путем лечения, и остающиеся вирионы вызывают после лечения новые поражения шейки матки или прилегающих тканей. Для борьбы 14 Молекулярная диагностика с инфекиями вируса папиллом мы применяли различные способы.

Антивирусное, иммунорегулирующее и антипролиферативное дей ствие интерферона определило его роль в лечении ВЧП-инфекции.

Местная терапия предпочтительней, чем системная терапия, так как отсутствуют тяжелые побочные явления. Бородавки, которые возникают в первую очередь, удалялись с помощью лазерного лече ния. Недостатками лазерного лечения в условиях пенитенциарной системы являются высокие затраты на аппаратуру, дополнительная анестезия и госпитализация. Риск возвращения инфекции доста точно высок, потому что лазерное лечение действует только местно.

Podofylline являлся наиболее распространенным средством для мест ного лечения генитальных бородавок;

он прост в применении и затра ты по его использованию относительно низки. Процент излечения, однако, незначителен и, безусловно, у ВИЧ-серопозитивных женщин от этого средства большого эффекта не ожидали. Криотерапия явля лась альтернативным лечением, при котором бородавка и небольшая часть окружающей ткани замораживались. Закись азота является часто используемым криогенном. В некоторых исследованиях было показано, что после перечисленных методов лечения ВЧП все еще присутствовало. Риск возникновения рака шейки матки, оставался большим, последней возможностью оставалась хирургия, часто в ком бинации с химиотерапией.

СОзДАНИЕ КОЛЛЕКцИИ СОВРЕМЕННЫХ, ЭПИДЕМИОЛОГИчЕСКИ зНАчИМЫХ ДЛЯ РОССИЙСКОЙ фЕДЕРАцИИ ИзОЛЯТОВ ВИч- Никонорова Ю.В., Сафронов П.ф., Унагаева Н.В., Лаптева Т.А., Богачев В.В., Барышев П.Б., Тотменин А.В, 1Мещерякова Ю.В., 1черноусова Н.Я., Ставский Е.А., Гашникова Н.М.

ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Новосибирская область, Россия 1Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями, Кольцово, Новосибирская область, Россия Введение. Разработка эффективных вакцин и антиретровирусных препаратов является одним из приоритетных направлений в борьбе распространением ВИЧ-инфекции. Для создания новых противови русных средств необходимо иметь набор инструментов для адекват ной оценки их эффективности. Такими инструментами могут являться Том V. Раздел 1. ВИЧ и ВИЧ-ассоциированные инфекции специфические панели охарактеризованных изолятов ВИЧ-1, обла дающих различными генетическими и биологическими свойствами, позволяющие производить исследование противовирусной активно сти препаратов in vitro. До настоящего времени в России отсутствова ла коллекция эпидемиологически значимых изолятов ВИЧ-1.

Целью данной работы было создание коллекции современных эпи демиологически значимых для России изолятов ВИЧ-1 для оценки антиретровирусной эффективности кандидатных химиотерапевтиче ских и иммунотерапевтических препаратов.

Материалы и методы. Работы по созданию коллекции включали выделение первичных изолятов ВИЧ-1 и последующее изучение их генетических и биологических характеристик. Образцы крови от ВИЧ-инфицированных пациентов были предоставлены специалистами Новосибирского областного центра по борьбе со СПИДом. Донорами ВИЧ являлись пациенты с разными сроками инфицирования и клиническим статусом, получающие и не получавшие антиретровирусную тера пию. Выделение изолятов осуществлялось путем сокультивирования мононуклеаров периферической крови (МПК) ВИЧ-инфицированного пациента со стимулированными фитогемагглютинином МПК от серо негативного донора. Исследование биологических свойств изолятов ВИЧ-1 включало оценку их репродуктивных характеристик и троп ности. Изучение генетических свойств проводили с помощью опреде ления нуклеотидных последовательностей фрагментов генома ВИЧ-1, кодирующих области генов pol и env и последующего анализа с исполь зованием специализированных программ.

Основные результаты. За период с ноября 2008 по июль 2010 года был выделен 41 изолят ВИЧ-1: 14 изолятов субтипа A, 6 – субтипа B и 21 изолят CRF02_AG ВИЧ-1. Установлено, что большинство выделен ных изолятов обладают сродством к CCR5-рецепторам (38), 2 ВИЧ- субтипа A и 1 ВИЧ-1 субтипа B являются CXCR4–тропными. Анализ участков гена pol показал, что 8 изолятов содержат мутации устой чивости к ингибиторам ревертазы и протеазы ВИЧ-1. Исследование репликативных способностей выделенных изолятов выявило значи тельные отличия в динамике роста и высокую вариабельность зна чений максимального накопления вирусспецифического белка p внутри групп всех субтипов (от 1,98 нг/мл до 1523,5 нг/мл).

Выводы. Создана охарактеризованная коллекция изолятов эпиде миологически значимых для России субтипов А, В и CRF02_AG ВИЧ 1. Наличие такой коллекции позволяет сформировать специализи рованные панели для исследования широты вируснейтрализующих свойств кандидатных вакцин и для оценки эффективности анти-ВИЧ препаратов, в том числе в отношении резистентных к существующим Раздел 2.

ВИРУСНЫЕ ГЕПАТИТЫ Том V. Раздел 2. Вирусные гепатиты РАзРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА A (HAV) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАзНОЙ цЕПНОЙ РЕАКцИИ (ПцР) С ГИБРИДИзАцИОННО фЛУОРЕСцЕНТНОЙ ДЕТЕКцИЕЙ «АМПЛИСЕНС® HAV-FL»

Карандашова И.В., Неверов А.Д., Долгин В.А., чуланов В.П.

ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия Введение. Вирусный гепатита А (ВГА) - острое заболевание печени, передающееся фекально-оральным путем, возбудите лем которого является вирус гепатита А (HAV), относящийся к семейству Picornaviridae. Основными серологическими маркерами вирусного гепатита A являются специфические антитела к виру су гепатита А класса IgM и IgG. Антитела класса IgM (anti-HAV IgM) начинают вырабатываться в конце инкубационного периода, который длится в среднем в течение 30 дней, и служат маркером острой инфекции. Синтез специфических антител класса IgG (anti-HAV IgG) начинается в конце первой – начале второй недели болезни. Антитела этого класса являются маркером перенесенного ВГА или поствакцинального иммунитета. Антиген вируса гепатита А (HAV-Ag) обнаруживают в фекалиях в инкубационном перио де и, как правило, в течение первых двух-трех недель болезни.

Данный маркер также используется для выявления вируса гепа тита А в объектах окружающей среды. Первым диагностическим маркером, обнаруживаемым в крови заболевшего ВГА, является РНК вируса гепатита А, которая определяется в крови на третьей неделе от момента заражения. Аnti-HAV IgM обнаруживаются в крови от нескольких дней до нескольких недель после появления РНК HAV. Определение РНК HAV имеет значительное преимуще ство в чувствительности (как минимум в 10000 раз) по сравнению с детекцией HAV-Ag при выявлении вируса гепатита А в объектах окружающей среды. Определение РНК вируса гепатита А мето дом ПЦР наиболее целесообразно использовать для выявления заболевших ВГА среди контактных и для тестирования объек тов окружающей среды на наличие вируса гепатита А. ЦЕЛЬЮ настоящей работы была разработка и апробация набора реагентов для выявления РНК вируса гепатита A в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реак ции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией.

18 Молекулярная диагностика Материалы и методы. Выбор праймеров для амплификации и зонда для детекции фрагмента 5’-нетранслируемого региона генома вируса гепатита А, вычисление температуры их отжига определяли с помощью программного обеспечения, разработан ного в ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Предварительная про верка специфичности праймеров и зонда проводилась в поис ковой системе Blast в банке нуклеотидных последовательностей GenBank. Выделение РНК из 100 мкл исследуемого образца проводили с использованием комплекта реагентов «РИБО-преп»

(«ФГУН ЦНИИЭ», Россия) и с помощью автоматической станции для выделения нуклеиновых кислот «NucliSENS® easyMAGTM»

(«BioMerieux», Франция), из 200 мкл и 1000 мкл - с использова нием комплекта реагентов «МАГНО-сорб» («ФГУН ЦНИИЭ»).

ОТ-ПЦР проводили с использованием реагентов производства ФГУН ЦНИИЭ. Аналитическую специфичность набора реагентов оценивали, добавляя в реакцию геномную ДНК/РНК следующих организмов и вирусов: вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита D, вирус гепатита E, вирус гепатита G, вирус иммуноде фицита человека, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса 1 и 2 типов, вирус герпеса человека 6 и 8 типов, энтеровирус (Coxsakie B1, B2, B3, B4, B5, B6, Polio I, II, III), рота вирус человека WA, астровирус, норовирус I и II типов, аденови рус (типы 2, 3, 7), Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter, Escherichia coli, Staphylococcus.aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens. Для определения диа гностической чувствительности и специфичности использовали 200 образцов плазмы (сыворотки) крови и 50 образцов фекалий, полученных от 200 пациентов, госпитализированных с диагнозом острый вирусный гепатит или острый ВГА в стационары гг. Москва, Калининград, Рязань, Уфа, Радужный (Ханты-Мансийский АО), Махачкала, Южно-Сахалинск и Республики Тыва в период с 10.01.08 по 01.07.09 г (опытная группа). В контрольную группу вошли 100 пациентов больных гепатитами другой этиологии, от которых было проанализировано 100 образцов плазмы (сыворот ки) крови и 20 образцов фекалий. Для определения аналитической чувствительности разработанного набора реагентов проводили модельный эксперимент, добавляя стандартный образца пред приятия (СОП) «Положительный контрольный образец содер жания РНК вируса гепатита А (FL, рекомбинантный)» («ФГУН ЦНИИЭ») в отрицательный контрольный образец (ОКО) («ФГУН ЦНИИЭ») и HAV-отрицательные образцы плазмы крови, фека лий и воды. Разведения готовили согласно инструкции по при Том V. Раздел 2. Вирусные гепатиты менению соответствующего СОП. В качестве системы сравнения использовался набор реагентов для выявления РНК вируса гепа тита А в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоре тической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле «АмплиСенс® HAV» (№ ФСР 2007/00578).

Результаты. В ФГУН ЦНИИЭ был разработан набор реагентов «АмплиСенс® HAV-FL» для выявления РНК вируса гепатита А в клиническом материале и объектах окружающей среды мето дом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно флуоресцентной детекцией. Набор реагентов содержит реком бинантный неконкурентный внутренний контрольный образец (ВКО), позволяющий проводить контролировать основные про цессы ПЦР-анализа (выделение РНК, проведение реакции обрат ной транскрипции и амплификации кДНК) и оценивать влияние ингибиторов ПЦР на результаты исследования.

В наборе реагентов используются 1) праймеры, комплиментар ные наиболее консервативной области генома вируса гепатита А - 5’-нетранслируемой области (5’UTR), с которых осуществляется амплификация участка кДНК вируса гепатита А всех его геноти пов, встречающихся у людей (I, II и III) и 2) праймеры, с которых осуществляется амплификация ВКО. В наборе реагентов использу ются зонды, которые позволяют осуществлять гибридизационно флуоресцентную детекцию амплификации кДНК вируса гепатита А (HAV) по каналу флуоресценции JOE (HEX), и экзогенного ВКО - по каналу флуоресценции – FAM. Разработанный набор реаген тов позволяет проводить реакцию обратной транскрипции (ОТ) выделенной РНК и ПЦР-амплификации синтезированной кДНК в одном реакционном буфере (one step ОТ-ПЦР). Разработанный набор реагентов адаптирован для использования как на амплифи каторах с детекцией флуоресцентного сигнала в режиме реально го времени (FRT), так и на флуоресцентных детекторах (FEP).

При проверке аналитической специфичности перекрестных реакций для тестируемых организмов и вирусов зарегистриро вано не было. При тестировании образцов плазмы (сыворотки) крови и фекалий от опытной и контрольной групп пациентов показатели диагностической специфичности и диагностической чувствительности составили 100% для каждого вида исследо ванного клинического материала. Аналитическая чувствитель ность разработанного метода выявления РНК вируса гепатита А составила не менее 5х102 копий вируса гепатита А в 1 мл плазмы (сыворотки) крови, фекалий и воды (при выделении из 100 мкл 20 Молекулярная диагностика исследуемого образца);

не менее 250 копий вируса гепатита А в мл плазмы (сыворотки) крови и воды (при выделении из 200 мкл исследуемого образца) и не менее 50 копий вируса гепатита А в 1 мл плазмы (сыворотки) крови и воды (при выделении из мкл исследуемого образца).

Заключение: Разработанный набор реагентов «АмплиСенс® HAV-FL» для выявления РНК вируса гепатита А в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детек цией пригоден для использования в клинической лабораторной диагностике и научной практике.

РАзРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК HBV И РНК HDV В КЛИНИчЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Коновалов А.С., Карандашова И.В., Куевда Д.А.

ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия Введение. Вирусный гепатит В (ВГВ) – широко распространен ная инфекция человека, вызываемая ДНК-содержащим вирусом, относящимся к семейству Hepadnaviridae. Заражение вирусом гепатита В происходит при непосредственном попадании вируса в кровь (при парентеральных вмешательствах или при гемотранс фузиях) или через слизистые оболочки, повреждения кожного покрова (при половых контактах, вертикальной передаче, тесном бытовом контакте).

Вирусный гепатит В представляет собой серьезную пробле му здравоохранения ввиду его повсеместного распространения.

Выявление ДНК HBV и определение вирусной нагрузки в плазме крови являются ценными диагностическими тестами, которые используются в совокупности с другими серологическими мар керами и биохимическими методами для диагностики вирусного гепатита В и мониторинга терапии.

Однако, весьма важно распознавание HDV-инфекции на фоне гепатита В, поскольку течение болезни, терапевтические подходы и прогноз при гепатите D отличаются от таковых при ВГВ.

Том V. Раздел 2. Вирусные гепатиты Вирус гепатита D (HDV) является РНК содержащим, гепа тотропным вироидом (несовершенным вирусом), относящимся к семейству Deltavirus. HDV нуждается в хелперной функции вируса гепатита В, который обеспечивает вирус гепатита Дельта белками поверхностной оболочки (HBsAg). Поэтому HDV способен к эффективной репликации только в присутствии HBV.

Пути передачи HDV-инфекции аналогичны путям передачи гепа тита В. В мире насчитывается около 500 миллионов человек, инфици рованных вирусом гепатита В. Их инфицированность HDV в эндемич ных районах может достигать 60%. В России максимум регистрации ВГД приходится на зоны, эндемичные по HBV - Туву, Якутию.

Коинфекция - одновременное заражение вирусами гепатитов B и D носит характер острого тяжелого заболевания с высоким риском развития фульминантного гепатита (до 20%). Заражение вирусом гепатита D больного хроническим гепатитом В или носителя вируса гепатита В (суперинфекция) в 70-80% случаев ведет к быстрому раз витию цирроза.

Для диагностики дельта-инфекции наиболее целесообразно использовать тест-системы на основе ПЦР. РНК HDV является пер вым диагностическим маркером, обнаруживаемым в крови пациента, антитела к D-Ag появляются на 2-3 недели позже, к тому же, наблю дается высокая частота серонегативной HDV-инфекции. Выявление РНК HDV c помощью ПЦР позволяет надёжно и максимально рано обнаруживать возбудителя.

Вирус гепатита D подавляет репликацию вируса гепатита В. Как правило, показанием к исследованию на наличие HDV является отсут ствие ДНК вируса гепатита В или низкая концентрация ДНК HBV в плазме крови у хронически инфицированного пациента при наличии синдрома цитолиза (или других признаков поражения печени).

Из вышесказанного следует, что всех пациентов с вновь выявлен ным ВГВ, необходимо тестировать на наличие HDV. Наиболее логич ным и правильным является формат одновременного выявления ДНК HBV и РНК HDV как с целью скрининга, так и дифференциальной диагностики. Данный формат максимально оперативен, информати вен, позволяет более точно определить прогноз течения заболевания и немедленно внести коррективы в схему лечения.

Целью данной работы является разработка и апробация набора реагентов для одновременного выявления ДНК HBV и РНК HDV в клиническом материале.

Результаты. В ЦНИИ Эпидемиологии был разработан набор реа гентов «АмплиСенс HBV/HDV-FL». Данный набор реагентов предна значен для одновременного выявления РНК вируса гепатита D и ДНК 22 Молекулярная диагностика вируса гепатита В в одной пробирке методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. ДНК HBV, РНК HDV и экзогенный внутренний контроль детектируются неза висимо по 3 каналам. Реакция обратной транскрипции совмещена с реакцией амплификации, что упрощает процесс работы врачей лаборантов и сокращает количество ошибок при подготовке реакци онных смесей. ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени позволяет добиться максимальной чув ствительности и специфичности выявления.

Набор реагентов адаптирован под универсальную програм му амплификации, что позволяет одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов (например, совместно с тестами для количественного определения ДНК HBV, выявления РНК HCV, генотипирования HCV и др.). Набор реагентов «АмплиСенс HBV/ HDV -FL» адаптирован под автоматические станции пробоподготов ки и неавтоматизированные методы выделения нуклеиновых кислот (сорбционные и преципитационные) с различным объёмом исследуе мого образца от 100мкл до 1000мкл.

Аналитическую чувствительность разработанного набора реа гентов определяли на международной панели стандартов NIBSC (в случае HBV) и на стандартном образце предприятия (СОП) HDV (концентрация СОП измерена методом лимитирующих разведений).

Аналитическая чувствительность «АмплиСенс HBV/HDV-FL» ука зана в Таблице 1.

Таблица 1. Определение аналитической чувствительности набора реагентов «АмплиСенс HBV/HDV-FL»

Объём образца Метод Аналитическая чувствительность для выделения, выделения HBV, МЕ/мл HDV, копий/мл мкл 100 Ручное выделе- 100 ние с реагентами «РИБО-сорб» и «РИБО-преп»

200 Ручное выделение 50 с реагентами «МАГНО-сорб»

1000 Ручное выделе- 10 ние с реагентами «МАГНО-сорб»

Автоматические станции пробо подготовки Том V. Раздел 2. Вирусные гепатиты Аналитическую специфичность набора реагентов исследова ли посредством добавления в реакцию нуклеиновых кислот сле дующих организмов и вирусов: вирус гепатита А, вирус гепати та С, вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус ветря ной оспы, вирус герпеса человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens и др. Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не были.

Клинические испытания проводились на образцах ранее проте стированных референс методами. В качестве референс тест-систем использовали наборы реагентов разрешенные к производству и при менению на территории РФ «АмплиСенс HBV-FRT» и «АмплиСенс HDV-EPh».

Испытания диагностической специфичности набора реагентов «АмплиСенс HBV/HDV-FL» проводили на 70 образцах здоровых доноров, не содержащих РНК HDV и ДНК HBV. Для всех 70 образцов положительные сигналы зарегистрированы не были (отсутствовали значения пороговых циклов (Ct)). Таким образом, специфичность исследуемого набора реагентов составила 100%.

Испытания диагностической чувствительности проводили на 75 образцах положительных по содержанию ДНК HBV и РНК HDV. Из 75 исследуемых образцов 35 содержали только ДНК HBV, 11 только РНК HDV (не детектируемый уровень ДНК HBV) и 29 образцов содержали одновременно ДНК HBV и РНК HDV.

Дискордантных результатов с референс методами обнаружено не было. Таким образом, чувствительность исследуемого набора реа гентов составила также 100%.

Вывод. Таким образом, разработанный во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора набор реагентов «АмплиСенс HBV/HDV-FL» пред ставляет собой удобный и надежный инструмент для выявления и оценки устойчивого ответа на лечение как моноинфекции HBV, так и коинфекции/суперинфекции с HDV.

24 Молекулярная диагностика ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ИзОЛЯТОВ ВГВ В РАМКАХ РАзРАБОТКИ РОССИЙСКОЙ РЕфЕРЕНС ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК HBsAG Максютов Р.А., Гаврилова Е.В., Канев А.Н.

ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово, Россия Введение. Вирус гепатита В вызывает острый и хронический вирусный гепатит. Приблизительно 5% мировой популяции инфи цировано ВГВ и более чем 1 млн пациентов с хроническим ВГВ умирает каждый год. На основе высокой гетерогенности, ВГВ под разделяется на 8 (A-H) генотипов с четким географическим распро странением. Антигенные детерминанты поверхностного антигена ВГВ (HBsAg) подразделяются на десять иммунологических сероти пов: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adw2, adw3, adw4, ayr, adrq–, adrq+.

Присутствие HBsAg в сыворотках крови является четким серологи ческим маркером инфекции ВГВ и, к настоящему времени, разра ботано множество ИФА тест-систем для выявления поверхностного антигена. Однако, у некоторых пациентов с острым и хроническим гепатитом В или бессимптомных пациентов уровень HBsAg может быть слишком низок для детекции большинством диагностических наборов. Разработка референс панели сывороток ВГВ с известными концентрациями HBsAg определенных серотипов необходима для контроля качества диагностических тест-систем и качество вакцин против гепатита В, которые должны быть строго стандартизованы по HBsAg составу. Представление серотипов в референс панели должно соответствовать встречаемости различных серотипов ВГВ в той географической территории, в которой планируется использова ние референс панели. Национальная референс панель для РФ долж на включать лиофилизированные сыворотки, содержащие образцы ВГВ серотипов ayw2, ayw3, adw2.

Цель и задачи. Главной целью исследования было определить генотипы и серотипы ВГВ в образцах сыворотки, собранных из различных географических регионов РФ для конструирования референс панели, содержащей все варианты HBsAg, циркули рующие в РФ. Референс панель необходима для государственного контроля качества сертифицированных HBsAg тест-систем и для сертификации вновь разрабатываемых диагностикумов. Данная работа также необходима, т.к. предоставит дополнительные зна ния о распределении ВГС генотипов и серотипов в РФ.

Материалы и методы. Было исследовано 343 образца сыворо ток крови, полученных от хронических носителей ВГВ из шести Том V. Раздел 2. Вирусные гепатиты городов, расположенных в различных регионах РФ: Краснодар, Нижний Новгород, Горный Алтай, Санкт-Петербург, Новосибирск, Хабаровск.

Выделение ДНК ВГВ проводили из 200 мкл сыворотки набором QIAamp DNA Mini kit (Qiagen) с последующей постановкой двух раундовой ПЦР. Секвенирование нуклеотидной последовательности фрагмента S гена, включающего детерминанту А, проводили по обеим цепям на автоматическом секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Филогенетический анализ фрагмента S гена проводили с использованием прототипных последовательностей ВГВ с помощью программы MEGA2.0.

Основные результаты. ДНК ВГВ была выявлена в 262 из HBsAg-положительных образцов (76.4%). Нуклеотидная последо вательность фрагмента S гена была определена для 72 произвольно выбранных образцов: 20 из Краснодара, 5 из Нижнего Новгорода, из Горно-Алтайска, 8 из Санкт-Петербурга, 9 из Новосибирска, из Хабаровска. Последующий филогенетический анализ фрагмента S гена длиной 404 п.н. показал принадлежность всех 20 изолятов ВГВ из Краснодара, 15 из Горно-Алтайска и 8 из Санкт-Петербурга генотипу D. 4 и 1 ВГВ изолят из Нижнего Новгорода, 8 и 1 из Новосибирска, 14 и 1 из Хабаровска были определены как генотипы D и A, соответственно. Таким образом, распределение генотипов ВГВ среди 72 образцов сыворотки составило: 69 (95.8%) для генотипа D и 3 (4.2%) для генотипа A (таблица 1). Генотипы B, C, E, F, G и H не были выявлены. Существует точная корреляция между иммуно логическим серотипом ВГВ и аминокислотным составом HBsAg. В нашей работе, основываясь на выявленных аминокислотных остат ках в 122, 127, 140, 159 и 160 позициях HBsAg, были субтипированы все 72 образца сыворотки с определенной последовательностью S гена. Распределение серотипов ВГВ среди 69 образцов сыворотки с генотипом D было следующим: 38 были серотипа ayw2 (55.1%), – ayw3 (43.5%), 1 – adw2 (1.4%). Все 3 образца сыворотки генотипа A были определены как серотип adw2 (100%). Таким образом, рас пределение серотипов ВГВ различалось в нескольких городах РФ.

Распределение серотипов ВГВ было схожим в Санкт-Петербурге и Хабаровске с доминированием серотипа ayw3 (87.5% и 93.3%, соответственно), тогда как серотип ayw2 был уникальным в Горно Алтайске. Все три серотипа ayw2, ayw3 и adw2 были выявлены в Нижнем Новгороде и Новосибирске с доминированием серотипа ayw2.

26 Молекулярная диагностика Таблица 1. Распределение генотипов и серотипов ВГВ Город Генотип A Генотип D adw2 ayw3 ayw2 adw Санкт-Петербург – 7 (87.5%) 1 (12.5%) – Краснодар – 7 (35%) 13 (65%) – Нижний Новгород 1 (20%) 1 (20%) 3 (60%) – Новосибирск 1 (11.1%) 1 (11.1%) 6 (66.7%) 1 (11.1%) Горно-Алтайск – – 15 (100%) – Хабаровск 1 (6.7%) 14 (93.3%) – – Всего 3 (4.2%) 30 (41.7%) 38 (52.7%) 1 (1.4%) Заключение/выводы. Было определено распределение геноти пов и серотипов 72 образцов ВГВ из городов, расположенных в раз личных географических регионах. Все 72 образца сыворотки были включены в референс панель. Национальная референс панель, состоящая из лиофилизированных сывороток, содержащих образ цы ВГВ с D/ayw2, D/ayw3, A/adw2 и D/adw2 комбинациями генотипов и серотипов, предназначена для государственного кон троля специфичности и чувствительности сертифицированных тест-систем как для выявления концентрации HBsAg, так и для детекции его различных серотипов. Также в нашей работе впер вые был обнаружен образец сыворотки с комбинацией генотипа D и серотипа adw2. Ранее такая комбинация генотипа и серотипа не выявлялась.


Раздел 3.

ТУБЕРКУЛЕз 28 Молекулярная диагностика ОСОБЕННОСТИ АПОПТОзА ЛИМфОцИТОВ КРОВИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЁзНЫХ ПРЕПАРАТОВ ОСНОВНОГО РЯДА IN VITRO Васильева О.А.

ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, Томск, Россия В последние годы во многих странах, независимо от уровня их экономического развития, отмечается увеличение заболеваемости и распространенности туберкулёза лёгких. Одной из главных причин недостаточной эффективности лечения являются побочные реакции на противотуберкулёзные препараты. Возникая в процессе комби нированной химиотерапии, они существенно ограничивают её воз можности и снижают эффективность лечения больных туберкулёзом лёгких по основным показателям – срокам прекращения бактериовы деления и частоте закрытия каверн. Несмотря на большой опыт при менения противотуберкулёзных препаратов, проблема их побочного действия на макроорганизм до настоящего времени остаётся актуаль ной. Поскольку доклинические и клинические испытания не позво ляют выявить весь спектр возможных нежелательных побочных реакций на препараты, очевидна необходимость продолжения иссле дований и оценки негативных реакций на лекарственные средства и после внедрения их в практику. В соответствии с современными пред ставлениями о патогенезе туберкулеза процессы внутриклеточного метаболизма, митохондриальные, тиоловые и кальций-зависимые механизмы участвуют в реакциях апоптоза, приводящих к развитию остропрогрессирующих форм микобактериальной инфекции.

В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования яви лось изучение прямого действия основных противотуберкулёзных препаратов (ПТП) (изониазид, рифампицин, этамбутол) на апоптоз лимфоцитов крови у здоровых доноров и больных инфильтративным туберкулёзом лёгких с лекарственной чувствительностью и устойчи востью возбудителя.

Материалы и методы.

В основу исследования положены результаты обследования впервые выявленных больных с инфильтративным туберкулёзом лёгких (ТЛ) в возрасте от 18 до 55 лет (47 мужчин и 13 женщин) и здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и воз расту. Материалом исследования служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл. Уровень Том V. Раздел 3. Туберкулез апоптоза лимфоцитов у больных туберкулёзом лёгких оценивали до начала проведения специфической противотуберкулёзной химио терапии. Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови осуществляли методом градиентного центрифугирования. Для оценки влияния ПТП на апоптоз лимфоцитов субстанции химиопре паратов («Sigma», США) добавляли в среду для культивирования клеток (RPMI-1640) в дозах, сопоставимых с сывороточной концен трацией этих препаратов с учетом фармакокинетических сведений.

Конечная концентрация исследуемых ПТП в культуральной среде составила 10 мкг/мл – для изониазида и рифампицина и 25 мкг/ мл – для этамбутола. В контрольные пробы вносили полную среду RPMI-1640. Для оценки апоптоза клетки культивировали при 37°С и 5% СО2 в течение 20 ч. После инкубации пробирки встряхивали, центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин, осадок использова ли для подсчета CD95+ и annexin V положительных лимфоцитов.

Определение CD95+ клеток производили с помощью моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Москва, Россия) в лимфоцитотоксическом тесте. Детекцию апоптотических лимфоцитов периферической крови осуществляли с помощью набора Annexin V Fitc [«Beckman Coulter», Франция] методом люминесцентной микроскопии. Для оценки досто верности различий выборок, распределение которых не соответство вало нормальному закону, использовали непараметрический Mann Whitney U test для независимых выборок и Wilcoxon matched pairs test для зависимых выборок.

Результаты исследования.

В результате определения уровня фоновой экспрессии моле кул CD95 на поверхности лимфоцитов обнаружили, что исходное количество клеток, предуготовленных к апоптозу, у больных с лекарственно-чувствительным туберкулезом легких (ЛЧТЛ) в 1, раза превышало их уровень в группе сравнения, а у больных с лекарственно-устойчивым туберкулезом легких (ЛУТЛ) было сопо ставимо с контролем. При этом уровень спонтанного апоптоза лимфо цитов (по количеству annexin V+ клеток) у больных инфильтратив ным ТЛ оставался в пределах нормы. После инкубации с изониазидом среднее количество CD95+ и annexin V-презентирующих лимфоцитов у больных ТЛ и у здоровых доноров в среднем увеличивалось в 2 раза (р0,05) относительно исходного его уровня. При этом существенных различий между величинами показателя апоптоза в сравниваемых группах установлено не было. Добавление в культуру клеток рифам пицина также приводило к значительному увеличению числа CD95+ и annexin V-положительных лимфоцитов в сравнении с их фоновым количеством во всех группах исследования. Наряду с этим, у больных 30 Молекулярная диагностика с лекарственно-чувствительным вариантом ТЛ число CD95+ лим фоцитов превышало норму. В результате оценки количества клеток, вступивших в раннюю фазу апоптоза, при действии рифампицина у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ регистрировались значения, превышающие соответственно в 1,5 (р0,05) и 1,6 (р0,05) раза аналогичные показа тели у здоровых доноров. Воздействие этамбутола сопровождалось статистически достоверным увеличением числа лимфоцитов, пред уготовленных к апоптозу и вступивших в раннюю фазу клеточной гибели, как у пациентов с ТЛ вне зависимости от чувствительности возбудителя к ПТП, так и в группе контроля. Сравнительный анализ представленных результатов у больных ТЛ в зависимости от иссле дуемого ПТП не выявил достоверных различий между группами.

Заключение.

Таким образом, результаты проведенного исследования свиде тельствуют о том, что противотуберкулёзные препараты основно го ряда способствуют индукции апоптоза лимфоцитов in vitro, что может приводить к нарушению формирования антигенспецифиче ского ответа при туберкулёзе легких вследствие дефицита специфи ческих Т-клеток и нарушения их функциональной активности. При достаточной выраженности этих иммуноингибирующих воздействий отсутствие радикального и стойкого антибактериального эффекта данных препаратов делает больного беззащитным перед лицом неис корененной инфекции.

Раздел 4.

ВИРУСЫ ПАПИЛЛОМЫ чЕЛОВЕКА И РШМ 32 Молекулярная диагностика ВЫЯВЛЕНИЕ ВПч ВЫСОКОГО КАНцЕРОГЕННОГО РИСКА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОзРАСТА Андосова Л.Д., Конторщикова К.Н., Куделькина С.Ю., Михалева О.В., Блатова О.Л.

ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия»

Росздрава, Медицинский центр «Тонус», Нижний Новгород, Россия Проблема диагностики и лечения заболеваний, обусловленных вирусом папилломы человека (ВПЧ) продолжает привлекать внимание врачей раз личных специальностей в виду достоверного резкого роста заболеваемости во всем мире, значительной контагиозности и доказанной высокой онкоген ности определенных типов ВПЧ. В связи с этим вопрос ранней диагностики ВПЧ остается актуальным и в настоящее время. Одним из наиболее удобных на сегодняшний день методов, позволяющих обнаружить вирус, а также дать ответ на вопрос, каким генотипом ВПЧ произошло заражение, сколько гено типов присутствует одновременно, какова вирусная нагрузка, является метод ПЦР в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ).

В данной работе представлены результаты ПЦР-диагностики формат «реальное время» вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР), отмечены частота встречаемости, кратность инфициро вания, вирусная нагрузка у женщин репродуктивного возраста в г. Нижнем Новгороде.

Материалом для исследования служили соскобы эпителия цервикально го канала, взятые с использованием одноразовых универсальных зондов в транспортную среду торговой марки «АмплиСенс» для материала из уро генитального тракта женщин. Для выявления и определения генотипа ВПЧ использовали тест-систему «Ампли Сенс ВПЧ ВКР генотип-Fl», «Ампли Сенс ВПЧ ВКР скринтитр-Fl». Наборы данных реагентов предназначены для выявления, дифференцации и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией.

Принцип метода основан на одновременной амплификации (мультиком плекс – ПЦР) в одной пробирке участков ДНК трех типов ВПЧ и участка ДНК -глобинового гена, используемого в качестве эндогенного внутрен него контроля. ПЦР-анализ на наличие ДНК двенадцати типов ВПЧ прово дится в четырех пробирках. Каждый тип регистрируется по своему каналу флуоресценции, что позволяет не только выявлять, но и определять генотип обнаруженного ВПЧ ВКР. Концентрацию ДНК ВПЧ в исследуемых пробах определяли с помощью стандартных кривых, построенных с использова нием ВПЧ клонов данных типов. Вирусную нагрузку рассчитывали как Том V. Раздел 4. Вирусы папилломы человека и РШМ количество копий ДНК ВПЧ, выраженное в lg на 105 клеток. Полученный материал исследовали методом ПЦР-РВ с использованием анализатора «iQ5» Cycler («Bio-RAD», США), комплекта тест-систем ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. За период с декабря 2009 года по август 2010 года на генотипы ВПЧ ВКР было обследовано 1026 женщин в возрасте от 16 до 50 лет. Анализ частоты выявления различных генотипов ВПЧ показал, что 56, 51 и 16 типы были обнаружены чаще других, в 30 и 15 процентах случаев, соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Частота выявления различных генотипов ВПЧ ВКР Типы ВПЧ 56 51 16 31 39 52 58 18 45 33 59 ВКР Частота 29,8 15,4 15,2 7,8 6,5 6,2 4,8 4,0 3,3 3,2 2,5 1, выявле ния, % Доминировали геноварианты 31 (7,8%), 39 (6,5%), 52 (6,2%). Частота рас пространения остальных генотипов варьировала от 1% до 5%. В материале у 54,8% обследованных пациенток присутствовал только один генотип ВПЧ ВКР, у 26,2% было выявлено два генотипа. Три и более генотипов вируса папилломы выявлено при обследовании 104 женщин (19%): 3 типа – 62 паци ентки (11,3%), 4 типа – 26 (4,8%), 5 типов – 12 (2,2%), 6 типов – 3 (0,5%), типов – 1 человек (0,2%).

При исследовании распределения вирусной нагрузки среди ВПЧ позитивных лиц, группа 780 человек, показано, что количество женщин, содержащих клинически значимую концентрацию ВПЧ, составляет 56,9% - 444 человека, чаще всего встречается концентрация 3 – 5 lg на 100 тыс.


клеток 275 (35,2%), далее следует 2 – 3 lg – 165 (21,1%), концентрация 5 – lg – 87 женщин (11,1%). Количество пациенток, содержащих клинически значимую концентрацию ВПЧ больше группы с клинически малозначимой концентрацией 444/272, в процентном отношении 57% против 35%. Группа 169 женщин – (21,7%) содержит ВПЧ с вирусной нагрузкой обозначаемой как «порог прогрессии» – 5 lg и более на 100 тыс. клеток, т.е. это группа, которая требует дальнейшего обследования и наблюдения.

Среди обследованных пациенток в 73,4% случаев ДНК ВПЧ была обнару жена у лиц, в возрасте от 16 до 30 лет, в 26,6% – у лиц 30 лет и старше.

Выводы. Генодиагностика папилломавирусной инфекции позволяет быстро с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять этиоло гический фактор возможной патологии, определять группы риска по онкоза болеваниям урогенитального тракта у женщин.

Раздел 5.

ИНфЕКцИИ ОРГАНОВ РЕПРОДУКцИИ Том V. Раздел 5. Инфекции органов репродукции ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАцИЙ УСТОЙчИВОСТИ MYCOPLAsMA GENITALIUM К МАКРОЛИДАМ В ПРОцЕССЕ ЛЕчЕНИЯ ДЖОзАМИцИНОМ ПАцИЕНТОВ С УРЕТРИТОМ Гущин А.Е.1, Рыжих П.Г.1, Гомберг М.А. 2, Бурцев О.А. 3, Шипулин Г.А1.

1ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва 2Московский государственный медико-стоматологический университет, г. Москва 3ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», г. Москва В настоящее остается проблема выбора наиболее эффективной терапии инфекции вызванной M.genitalium. Клинические наблюдения показывают, что использование тетрациклиновых препаратов в большинстве не эффективно и препаратами первого ряда при лечении инфекции, вызванной M.genitalium, являются макролиды.

Однако режим и дозировка препаратов остаются предметом изучения, поскольку возникают случаи рецидивов инфекции. На сегодня установлено, что при лечении макролидами рецидив инфекции связан с возникновением устойчивых к этим препаратам изолятов микроорганизмов. Устойчивость развивается в результате появления точечных мутаций в различных участках генома микроорганизмов и преимущественно в гене 23S рРНК. Известно, что антибиотик в клетке блокирует синтез белка, связываясь с 23S-субъединицей рРНК, а возникающие точечные мутации препятствуют данному взаимодействию и, тем самым, обеспечивают микроорганизму устойчивость. Ранее в работе J.Jensen (CID 2008:47/1547) было установлено, что резистентность M.genitalium к азитромицину связана с мутациями в V домене гена 23S рРНК. Устойчивость данного возбудителя к другим представителям класса макролидов не исследовалась.

Цель исследования. Становить связь между генотипом M.genitalium в области гена 23S рРНК с результатами лечения джозамицином.

Материалы и методы.

В исследование были включены 49 пациентов с диагнозом уретрит, у которых была установлена инфекция, вызванная M.genitalium с помощью метода ПЦР с использованием набора реагентов «Амплисенс M.genitalium-Fl». У данных пациентов лабораторные исследования, включая метод ПЦР с использованием наборов реагентов «Амплисенс N.gonorrhoeae screen-Fl», «Амплисенс C.trachomatis-Fl, «Амплисенс T.vaginalis Fl», показали отсутствие других возбудителей ИППП. Пациентам 36 Молекулярная диагностика была назначена стандартное лечение джозамицином 500 мг раза в день в течение 10 дней. Пациентам проводили мониторинг клинических и лабораторных показателей, включая наличие ДНК M.genitalium, до начала лечения, в процессе терапии (на 3 и на день), и после окончания терапии (на 2-й и 38 дни). Все образцы, в которых на протяжении исследования обнаруживалась ДНК возбудителя, повторно исследовались методом ПЦР с праймерами, предложенными J.Jensen, к фрагменту 23S рДНК. Полученный продукт амплификации размером 147 п.о. секвенировали и анализировали на наличие точечных мутаций.

Результаты.

Из 49 обследованных пациентов у 3-х на разных сроках после окончания лечения наблюдался рецидив инфекции, сопровождавшийся возвращением клинических проявлений уретрита, повышением уровня лейкоцитов при микроскопии на фоне положительных результатов ПЦР. Молекулярно-генетический анализ показал, что у всех обследованных пациентов, включая тех, что не ответили на лечение, до начала терапии была обнаружена M.genitalium «дикого» генотипа». Кроме того, у всех пациентов, ответивших на терапию джозамицином, «дикий» генотип сохранялся до момента исчезновения M.genitalium. У 3 пациентов, которые не ответили на лечение, «дикий» генотип сохранялся до поздних сроков терапии.

При рецидиве инфекции были обнаружены точечные мутации в гене 23SрРНК, в положениях, в которых данные мутации ассоциированы с резистентностью к различным макролидам у других микроорганизмов, включая микоплазмы. В двух случаях наблюдалась замена А на G в положении 2059 (нумерация E.coli). У одного пациента была выделена M.genitalium с мутацией А на G в положении 2062 (нумерация E.coli).

Выводы. Данное исследование показало, что при лечении уретрита, вызванного M.genitalium, макролидами (джозамицином) рецидив заболевания связан с появлением точечных мутаций в гене 23SрРНК.

Одна из этих мутаций (A2062G) впервые описана для M.genitalium.

Мутации не обнаруживаются до начала и в процессе лечения и выявляются либо поздних сроках терапии, либо через несколько дней после отмены препарата.

Том V. Раздел 5. Инфекции органов репродукции РАзРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ TRICHOMONAs VAGINALIs НА ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ НАСБА В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Рыжих П.Г., Гущин А.Е., Шипулин Г.А.

ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва, Россия Введение.

Trichomonas vaginalis играет важную роль в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин и женщин. Клинические симптомы трихомонадной инфекции довольно часто стерты и не специфичны, что делает необходимым применение лабораторных методов диагностики. На сегодняшний день культуральный метод диагностики трихомониаза, является «золотым стандартом» - высокочувствительным и высокоспецифичным. Но его существенными минусами являются длительность исполнения (от 2-х до 7-ми суток), высокие требования к качеству питательных сред и условиям транспортировки клинического материала. Более быстрый и недорогой метод микроскопии окрашенного мазка наиболее популярен среди методов лабораторной диагностики трихомонадной инфекции в Российской Федерации. Однако высокая субъективность и низкая чувствительность микроскопии при бессимптомной инфекции существенно перевешивают плюсы метода. С появлением методов амплификации нуклеиновых кислот, наиболее известный из которых – ПЦР, появились новые возможности для диагностики T.vaginalis. Данные методы становятся инструментами выбора в диагностике многих инфекций благодаря высокой чувствительности и специфичности. Помимо ПЦР – метода амплификации ДНК, все больше внимания стали привлекать методы амплификации РНК, к которым относится реакция транскрипционной амплификации НАСБА (NASBA – Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) (BioMerieux).

Использование в качестве мишени РНК дает целый ряд преимуществ перед ПЦР. Во-первых, количество рибосом в одной клетке содержится от нескольких тысяч до нескольких десятков тысяч, в зависимости от фазы жизненного цикла микроорганизма. Во-вторых, в то время как ДНК – достаточно стабильный материал и обнаружение ДНК еще не означает наличие жизнеспособных микроорганизмов, РНК – наоборот крайне нестабильный материал и достаточно быстро деградирует при гибели и разрушении клеток микроорганизмов. Это дает возможность не только более правильно судить о наличии текущей инфекции, но и более точно и надежно оценивать результаты проведенного лечения.

В-третьих, поскольку, метод ПЦР является наиболее чувствительным 38 Молекулярная диагностика и специфичным методом для диагностики T.vaginalis по сравнению с бактериоскопией и культуральным посевом, то НАСБА может использоваться в качестве референсного метода для подтверждения результатов ПЦР.

Целью нашей работы стала разработка и апробация набора реагентов для диагностики T.vaginalis на основе технологии НАСБА в реальном времени.

Материалы и методы.

В работе был использован «Базовый набор «Nuclisens», который включает в себя комплект реагентов для экстракции РНК из клинического материала и комплект реагентов для проведения амплификации (солевые компоненты, дНТФ, комплекс ферментов в виде лиофилизированной сферы с AMV- обратной транскриптазой, Т7 РНК-полимеразой, РНКазойН и необходимые для их растворения компоненты).

Нами были разработаны реагенты, специфичные к мишени.

Были выбраны праймеры и флуоресцентно-меченый зонд для специфического участка 18S рРНК T.vaginalis на основе информации международного банка генетической информации GenBank;

получены рекомбинантные количественно охарактеризованные препараты внутреннего контрольного образца (ВКО) и положительного контрольного образца (ПКО), а также флуоресцентно-меченый зонд к ВКО. Реакцию NASBA с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени проводили с использованием прибора «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия).

В рамках апробации разработанного набора реагентов проводили сравнение с зарегистрированным набором реагентов на основе ПЦР «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL» (№ ФСР 2009/06556 от декабря 2009 г.) производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии согласно инструкции производителя на чистой культуре T.vaginalis, которую получали с помощью диагностической среды «Vagicult» («Orion Diahnostica», Финляндия), согласно инструкции производителя.

Кроме того было проведено исследование на клиническом материале – соскобного отделяемого урогенитального тракта мужчин и женщин.

Результаты.

В результате проведенной работы по оптимизации условий анализа был разработан набор реагентов «АмплиСенс® Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ» на основе технологии НАСБА в реальном времени.

С использованием рекомбинантного препарата РНК ПКО было установлено, что предел детекции реакции амплификации набора составил 50-100 копий РНК. Сравнение пределов детекции двух технологий – ПЦР и НАСБА проводилось на чистой культуре Том V. Раздел 5. Инфекции органов репродукции T.vaginalis, полученной из клинического материала. Для этого из исходного образца культуры готовили серию 10-кратных разведений, из которых выделяли нуклеиновые кислоты и проводили амплификацию разработанным набором для НАСБА в сравнении с ПЦР тест-системой «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL», использующей праймеры к фрагменту ДНК повторов в геноме трихомонад. Каждое разведение тестировалось в трех повторах. Исследования показали как минимум стократное превышение предела детекции НАСБА по сравнению с ПЦР (см. таблицу 1) на трех образцах культуры, полученных от трех разных пациентов в разные временные периоды.

Таблица 1. Сравнение пределов детекции методов ПЦР и НАСБА на 10х раз ведениях культуры T.vaginalis Разведения Культура 1 Культура 2 Культура ПцР* NAsBA ПцР* NAsBA ПцР* NAsBA 10-1 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 10-2 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 10-3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 10-4 2 из 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 3 3 из 10-5 1 из 3 3 из 3 из 3 0 из 3 3 из 3 3 из 10-6 1 из 0 из 3 3 из 3 0 из 3 0 из 3 3 из 10-7 1 из 3 3 из 0 из 3 0 из 3 0 из 3 1 из 10-8 0 из 3 0 из 3 0 из 3 0 из 3 0 из 3 0 из *«АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL»

Расчеты показали, что указанный предел детекции обеспечивает аналитическую чувствительность ПЦР позволяющую определять возбудитель, в концентрации 5х102 клеток T.vaginalis на мл. С учетом полученных результатов методом НАСБА можно обнаруживать возбудитель при концентрации как минимум в 10-100 раз меньше, т.е.

до 5-50 клеток в мл.

Апробация набора реагентов «Амплисенс Trichomonas vaginalis РИБОТЕСТ» на основе НАСБА в реальном времени была проведена на клиническом материале (соскобах из уретры и цервикального канала) полученном от 154 пациентов, которые были разделены на группы. У пациентов первой группы (n=54) трихомонадная инфекция была установлена на основании ПЦР-исследования с помощью набора реагентов «Амплисенс Trichomonas vaginalis-FL». РНК Trichomonas vaginalis была обнаружена с помощью разработанного набора реагентов в 54 образцах из 54. Вторая группа пациентов (n=100) выступала в 40 Молекулярная диагностика качестве контрольной. У пациентов данной группы результаты ПЦР на T.vaginalis были отрицательными. РНК T.vaginalis также не была обнаружена методом НАСБА ни в одном из образцов контрольной группы.

Заключение.

Впервые был разработан набор реагентов для выявления T.vaginalis в клиническом материале на основе технологии НАСБА в реальном времени - «Амплисенс Trichomonas vaginalis-РИБОТЕСТ».

Предел детекции данного набора на чистой культуре в 100 раз выше по сравнению с ПЦР. Диагностическая чувствительность двух молекулярно-биологических методов на исследованном клиническом материале совпадала. Разработанный набор реагентов может использоваться для лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза. На данный набор получено регистрационное удостоверение (№ ФСР 2010/07305 от 22 апреля 2010 г) разрешающее его использование в клинической лабораторной практике.

Раздел 6.

ИНфЕКцИИ С фЕКАЛЬНО-ОРАЛЬНЫМ МЕХАНИзМОМ ПЕРЕДАчИ 42 Молекулярная диагностика МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ В ИзУчЕНИИ цИРКУЛЯцИИ РАзЛИчНЫХ ГЕНОТИПОВ РОТАВИРУСОВ СРЕДИ ДЕТЕЙ В УКРАИНЕ Дзюблик И.В., Обертинская О.В., Соловьев С.А., Костенко И.Г, Трохименко Е.П., Вороненко С.Г., Ковалишин Г.Г, Ковалюк О.В., Самборская И.ф., Жеребко Н.Н.

Национальная медицинская академия последипломного образования имени П.Л.Шупика, Киев, Украина Острые кишечные инфекции (ОКИ) представляют одну из наи более значимых проблем здравоохранения во всех странах мира.

Спектр возбудителей, вызывающих ОКИ, разнообразен и вклю чает в себя патогенные и условно-патогенные бактерии, простей шие а также вирусы. Среди них именно ротавирусам принадлежит ведущая роль в структуре вирусных диаррейных заболеваний у новорожденных и детей в возрасте до 5 лет. Ежегодно во всем мире миллионы детей заболевают тяжелой формой ротавирусной диареи, из которых более 440 тыс. умирают, главным образом в развиваю щихся странах [1]. В 2006 году только в странах Европейского Союза было зарегистрировано 3,6 млн случаев ротавирусной инфекции, 87 тыс.госпитализаций, 213 летальных исходов [2]. В Украине ОКИ вирусной этиологии изучены недостаточно хорошо, в связи с тем, что обследование пациентов с симптомами гастроэнтеритов про водится преимущественно на наличие бактериальных патогенов с использованием стандартных микробиологических методов. В редких случаях этот перечень дополняется исследованием клини ческого материала простыми/быстрыми тестами или применяют коммерческие иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов ротавирусов группы А. В результате, почти половина случаев ОКИ (28 381- 46 134 ежегодно) остаются этиологически не расшифрованными и относятся к кишечным инфекциям неустанов ленной этиологии [3]. Однако, в настоящее время разработаны тест системы для выявления РНК ротавирусов методом ПЦР с обрат ной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» и в реальном времени [4]. Методы G/P–генотипирования ротавирусов с использованием ОТ-ПЦР стали применяться в качестве современ ного «инструмента» при изучении циркуляции ротавирусов среди людей в разных регионах мира и это сегодня особенно актуальны в контексте реализации программ по вакцинопрофилактике ротави русной инфекции у детей.

Том V. Раздел 6. Инфекции с фекально-оральным механизмом передачи Цель работы состояла в изучении особенностей циркуляции рота вирусов среди детей с ОКИ в различных городах Украины методами молекулярной диагностики, а также определение доминирующих G/P генотипов методом ОТ-ПЦР.

Материалы и методы. Нами было исследовано 600 образцов фека лий от детей в возрасте до 5 лет с ОКИ из 6 городов Украины:

(Харьков, Одесса, Чернигов, Суммы, Львов, Киев), отобранных в период с ноября 2006 по май 2007 гг. Клинические образцы исследова ли методом ИФА с использованием тест-систем Ridascreen® ELISA (R-biopham, Германия) и методом ОТ-ПЦР тест-системой АмплиСенс® Rotavirus-EPh (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора).

Генотипирование ротавирусов в позитивных пробах проводили с набором праймеров, специфичных для различных генотипов ротави русов по методу [5].

Результаты. Показано, что за исследуемый период в структуре ОКИ вирусной этиологии в разных городах Украины ротавирусы составляли: во Львове – 51 %, в Одессе – 42%, в Чернигове и Суммах - 15 %, в Харькове – 30 %, в Киеве – 20 %. Подтверждена зимне- весен няя сезонность ротавирусной инфекции, максимальное число случаев РВИ было выявлено у детей в январе-феврале месяцах 2007г. В воз растной группе детей до 3 лет средняя частота выявления ротавиру сов была наибольшей и составила 70,1+4,0 %.

В результате генотипирования отобранных 210 позитивных образ цов в 176 случаях (83,8%) были выявлены Р-генотипы и в 182 случаях G-генотипы ротавирусов (86,6%). В 3,3 % образцов не было выявлено P-генотип, в 4,3 % - G-генотип, и в 5,7 % случаев не выявлялись оба генотипа. В исследуемый период была выявлена циркуляция четырех основных генотипов ротавирусов группы А: P[8]G1, P[8]G4, P[8]G3, P[4]G2. Следует отметить, что в Киеве, Львове, Одессе и Харькове большинство случаев ротавирусной инфекции ( более 70%) было вызвано ротавирусом группы А с генотипом P[8]G1. В Суммах доми нировал генотип P[8]G4. В Одессе в отдельных случаях были выяв лены ротавирусы генотипа P[8]G9.

Заключение. Показано, что ротавирусы группы А были основ ной причиной развития в вирусных гастроэнтеритов у детей раннего возраста в Украине. Пик спорадической заболеваемости ротавирусной инфекцией приходился на январь-февраль. В иссле дуемый период была установлена циркуляция четырех основных генотипов ротавирусов группы А: P[8]G1, P[8]G4, P[8]G3, P[4]G2.

Метод ОТ-ПЦР можно использовать для детекции ротавирусной инфекции и мониторинга за циркуляцией штаммов ротавирусов в Украине. Следует предположить, что антиротавирусные вакци 44 Молекулярная диагностика ны, включающие аттенуированные или реассортантные штаммы ротавирусов с генотипом P[8]G1 будут наиболее эффективными на территории Украины при планировании специфической про филактики РВИ у детей.

Литература:

1. Parashar U.D.,Gibson C.J., Bresse J.S., Glass R.I. Rotavirus and severe childhood diarrhea //Emerg. Infect. Dis.-2006.-#12.-P.304-306.

2. Soriano-Gabarro M. Burden of rotavirus desease in European union countries /M. Soriano-Gabarro, J.Mrucowicz, T. Vesicari [et al.] // Pediatric Ivfect. Dis.-2006.-Vol.25.-P.7-11.

3. Кракович А.В. Епідеміологічна характеристика ротавіруснї інфекції та шляхи удоскогналення епідеміологічного нагляду: Автореф.

дис. … канд. мед. наук: 14.02.02/ АМНУ ІЕІХ ім. Л.В. Громашевського.

- 2006.-24 с.

4. Подколзин, А. Т. Разработка методик детекции возбудите лей острых кишечных инфекций на основе мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплифи кации «по конечной точке»/ А. Т. Подколзин, Н. Ю. Абрамычева, Е. Б.

Фенске и др.// Генодиагностика инфекционных болезней: Материалы Российской научно-практической конференции (25-27 октября 2005 г., Новосибирская обл.)- Новосибирск, 2005.-С.216-221.

5. Подколзин, А. Т. Адаптированная к практическому примене нию методика [P]G генотипирования ротавирусов группы А / А. Т.

Подколзин, Е. Б. Фенске, Н. Ю. Абрамычева и др. // Молекулярная диагностика-2007 : сб. тр. 6-ой Всерос. науч.-практ. конф. с междуна родным участием. – М., 2007. – Т. 3. - С. 284-286.



Pages:   || 2 | 3 | 4 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.