авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
-- [ Страница 1 ] --

Материалы международной

научно-практической конференции

«Бактериофаги:

Теоретические и практические аспекты

применения в медицине, ветеринарии

и пищевой

промышленности»

Том II

Ульяновск - 2013

Материалы международной научно-практической конференции «Бактериофаги: Тео-

ретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой про-

мышленности» / - Ульяновск:, ГСХА им. П.А. Столыпина, 2013, т. II - 182 с.

Технический редактор Д.Н. Хлынов Авторы опубликованных статей несут ответственность за достоверность и точность приведенных фактов, цитат, экономико-статистических данных, собственных имен, гео графических названий и прочих сведений, а также за разглашение данных, не подлежа щих открытой публикации.

© ФГБОУ ВПО «УЛЬЯНОВСКАЯ ГСХА им. П.А. СТОЛЫПИНА», 20 Бактериофаги в медицине и ветеринарии Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 619:616- ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ AEROMONAS SALMONICIDA Горшков И.Г., научный сотрудник, i.o.gun@mail.ru Куклина Н.Г., научный сотрудник, ul_nk@mail.ru Викторов Д.А., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru Насибуллин И.Р., соискатель, тел. 9053484611, nir72@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Aeromonas salmonicida, аэромонозы рыб, бактериофаги, выделение, фаготерапия, фагоиндикация.

В результате проведённых исследований было выделено 4 изолята бактериофагов, активных в отношении Aeromonas samona. олуенные бактериофаги перспективно ис.

пользовать для фаготерапии, а также для постановки реакции нарастания титра фага, то позволит проводить диагностику аэромонозов рыб за сроки до 24 асов.

Актуальность исследования.

Необходимость разработки быстрого и точного метода диагностики аэромонозов рыб, обусловленных Aeromonas salmonicida, в последнее время приобретает всё большую актуаль ность, на что указывают данные многих авторов [1]. В этой связи группой авторов предлагает ся применение метода реакции нарастания титра фага для индикации патогенных аэромонад в пищевой рыбной продукции, прудовой воде и патологическом материале, полученном от больной рыбы. Метод РНФ имеет ряд существенных преимуществ [2,3,7], однако для его про ведения необходимо иметь в распоряжении индикаторные бактериофаги, обладающие опреде лёнными свойствами (строгой специфичностью, широким спектром литической активности, максимальной урожайностью и подходящей морфологией негативных колоний).





Целью исследований являлось выделение и отбор наиболее активных культур бакте риофагов бактерии Aeromonas salmonicida для дальнейшей разработки на их основе диагно стического биопрепарата.

Ход исследования.

Для выделения фагов бактерии Aeromonas salmonicida исследовано более 20 проб сточной и речной воды.

Исследуемую воду в количестве 50 мл заливали в колбы со 100 мл стерильного концен Бактериофаги в медицине и ветеринарии трированного мясопептонного бульона. Концентрированный мясопептонный бульон готовили с таким расчётом, чтобы после смешивания с исследуемой водой получить обычную по соста ву среду [7]. В те же колбы добавляли по 3 мл 24-часовых индикаторных культур различных выделенных нами ранее из патологического материала рыб «полевых» штаммов Aeromonas salmonicida. После 48-часового культивирования в термостате при 25 С полученную взвесь в количестве 5 мл перемещали в стерильные пробирки и центрифугировали 20 минут при 700 g.

Наличие бактериофагов в надосадочной жидкости устанавливали с помощью спот-теста. Для этого на чашки Петри с мясопептонным агаром, подсушенным в течение суток, проводили по сев 24-часовой индикаторной культуры сплошным газоном. После подсыхания газона на его поверхность наносили каплю исследуемой надосадочной жидкости [7]. Одновременно с этим для проверки на отсутствие жизнеспособных бактериальных клеток в надосадочной жидко сти, делали посев фаголизата на мясопептонный агар. Чашки ставили в термостат при 25 С.

Посевы периодически просматривали через 18, 24 и 36 ч. Наличие лизиса бактериального га зона в виде полосы чистого агара или отдельных негативных колоний по ходу стекания капли указывает на наличие в исследуемом материале соответствующего бактериофага.

Результаты исследования и выводы.

Таким образом, нами были получены 4 штамма бактериофагов, вызывающих стойкий лизис индикаторных бактериальных штаммов Aeromonas salmonicida. Дальнейшие исследова ния направлены на изучение биологических свойств и селекцию полученных бактериофагов с целью последующей разработки на их основе диагностических тест-систем для проведения реакции нарастания титра фага.

Библиографический список 1. Блинов А.И., Глушанова Н.А. // Аэромонады: выделение, идентификация и диффе ренциация, учебно-методические рекомендации, Новокузнецк, 2. Викторов Д.А. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индика ции бактерий Pseuomonas puta // Автореф. дис. … канд. биол. наук. – 2011. – 22 с.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М., Государственное издательство медицинской литературы медгиз, 4. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, 1998 г.

5. Инструкция по борьбе с фурункулезом лососевых рыб, 1997 г., 6. Методические указания по санитарно - бактериологической оценке рыбохозяйствен ных водоемов. Указание министерство Здравоохранения РФ. 27 сентября 1999г. № 13-4-2/1742.

7. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. К., «Уро жай», 1978.

PROSPECTS OF APPLICATION OF BACTERIOPHAGES FOR THE DISPLAY OF THE PATHOGENIC AEROMONADS Gorshkov I.G., Кuklina N.G., Viktorov D.А., Nasibullin I.R., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Keywords: Aeromonas samona, aeromonoss fish baterophage seeton phagotherapy, fagonkatsya.

The stues were aoate 4 soate baterophage atve aganst Aeromonas samona.

Phages obtane prospetvey use for phage therapy, an for the assay of the phage tter rse, whh w agnose aeromonoss fish for up to 24 hours.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 619:616- ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AEROMONAS Горшков И.Г., научный сотрудник, i.o.gun@mail.ru Куклина Н.Г., научный сотрудник, Викторов Д.А., кандидат биологических наук, тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru Насибуллин И.Р., соискатель, Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактериофаги, аэромонозы рыб, биотехнология, микробиолгия, диагностика.

В работе рассмотрен обзор современных литературных данных по тематике аэро монозов рыб, применяемые в настоящее время методы леения рыб и профилактики аэро монозов, а также обоснованию применения в каестве средства диагностики и леения био препаратов на основе бактериофагов.

Аэромонозы рыб – это опасное заболевание, нередко встречающееся на рыбоводче ских хозяйствах. Аэромоноз протекает молниеносно, остро, подостро и хронически. Рыбы становятся вялыми, держатся у поверхности воды вдоль берега, корм не принимают. Кожный покров иногда приобретает темную окраску. Острое течение проявляется септицемией и рас стройством пищеварения, сопровождающимся выделением экскрементов с примесью крови.

На кожных покровах и жабрах, а также у основания грудных плавников появляются пятнистые кровоизлияния. В таком состоянии больные рыбы или погибают (в течение 1-3 дней), или заболевание принимает подострое течение. При подостром течении на воспаленных участ ках кожи образуются фурункулы, глубоко проникающие в мышечный слой, мягкие на ощупь.

При вскрытии фурункулов во внешнюю среду изливается экссудат, а на их месте образуются красноватые язвы. У больных рыб отмечается бледность жабр и пучеглазие. Подострое тече ние продолжается 3-7 дней, вызывая значительную гибель рыб. При хроническом течении на теле рыб появляются обширные участки сапролегниоза, чаще расположенные на пораженных участках кожи и прилегающих зонах. Кроме того, отмечают потерю чешуи, разрушение плав ников, темную окраску тела, общее истощение рыб. У некоторых особей на поверхности тела и головы заметны заживающие язвы, рубцы, иногда абсцессы, после вскрытия которых об нажается мускулатура и выделение кровянистой жидкости. Из ануса выделяется кровянисто гнойный экссудат. Жабры бледные с чередованием мраморных участков. Эта стадия болезни протекает умеренно и продолжается до нескольких недель и даже месяцев. У переболевших рыб-микробоносителей нет никаких клинических признаков, так как инфекция принимает ла тентное течение. Обнаружение в водоеме рыб с зарубцевавшимися поражениями, без плав ников служит подтверждением перенесенного аэромоноза [1]. В этом случае переболевшая рыба теряет вес и товарные качества. Всё это наносит колоссальный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам.

Возбудителями аэромоноза рыб является целый ряд патогенных штаммов бактерий Бактериофаги в медицине и ветеринарии рода Aeromonas. У рыб чаще встречаются виды: Aeromonas hyropha, Aeromonas salmonicida, Aeromonas sobra, Aeromonas avae, Aeromonas shubert, Aeromonas eurenopha, Aermonas mea, Aeromonas veron. Такое обилие видов бактерий, способных вызывать аэромонозы рыб, обуславливает существенные трудности при назначении правильного лечения.

Современные доступные для рыбоводческих хозяйств методы диагностики далеко не совершенны. Диагноз на аэромоноз ставят на основании эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений, результатов бактериологического исследова ния и положительной биопробы. Типирование до вида при этом в основном не производится, так как существующие методы бактериологической диагностики требуют значительных затрат времени и материалов, а современные методики, такие как полимеразная цепная реакция или иммуно-ферментный анализ, требуют дорогостоящего оборудования, материалов и высоко квалифицированных специалистов, что зачастую недоступно для рыбоводческих хозяйств [6].

Поскольку существующие методы диагностики не предусматривают типирование возбудителей аэромонозов до вида, лечение заболевания заключается в применении антибио тиков широкого спектра, высокомолекулярных соединений, содержащих йод, а также форма лина. [4,5] Как известно, такие препараты пагубно влияют на рост и развитие сразу нескольких видов и даже родов бактерий. В результате их применения погибают не только патогенные бактерии, вызывающие заболевание, но и естественная сапрофитная микрофлора, играющая существенную роль в функционировании биоценозов, круговороте азота и других веществ, разложении органических остатков. Кроме того, антибиотики «заодно» убивают и полезную микрофлору желудочно-кишечного тракта, вызывая дисбактериоз кишечника, токсическое по ражение печени, почек и других органов, проявляются нарушения иммунитета. В результате организм поражает секундарная (то есть вторичная) инфекция. При длительном применении антибиотиков бактерии адаптируются к их действию, что вызывает появление мутантных ан тибиотикоустойчивых форм микробов. Всё это указывает на несостоятельность современных методов диагностики и лечения аэромонозов рыб.

Применение биопрепаратов на основе бактериофагов для диагностики, лечения и про филактики основано на использовании гомологичных бактериофагов бактерий рода Aeromo nas. Применение данного биопрепарата в целях диагностики, лечения и профилактики аэро моноза рыб имеет ряд преимуществ перед существующими методиками:

- типирование возбудителя осуществляется до вида, - время постановки диагноза сокращается до 18 часов, - не требуется наличие дорогостоящего оборудования и материалов, - не требуется высококвалифицированного труда специалистов, - биопрепарат для лечения активен только в отношении конкретного вида возбудителя, - применение биопрепарата для лечения не вызывает нежелательных последствий (та ких как ухудшение иммунитета животного, дисбактериоз, адаптация бактерий к антибиотикам и появление мутантных антибиотикоустойчивых форм бактерий) [2].

Таким образом, в целях диагностики, лечения и профилактики аэромонозов рыб, наи более приемлемыми являются методы, основанные на использовании бактериофагов. В насто ящее время коллективом авторов проводятся работы по выделению, изучению биологических свойств и селекции бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Aeromonas, в частно сти Aeromonas salmonicida, Aeromonas sobra, Aeromonas veron, Aeromonas aveae, Aeromonas hyropha для дальнейшей разработки на их основе диагностических и лечебно-профилакти ческих биопрепаратов.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Библиографический список 1. Блинов А.И., Глушанова Н.А. // Аэромонады: выделение, идентификация и диффе ренциация, учебно-методические рекомендации, Новокузнецк, 1997.

2. Васильев, Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseuomonas puta и их селек ция в целях создания биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А.

Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. – 2011. – №2(52). – С. 79-82.

3. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М., Государственное издательство медицинской литературы медгиз, 1961.

4. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, 1998 г.

5. Инструкция по борьбе с фурункулезом лососевых рыб, 1997 г., 6. Методические указания по санитарно - бактериологической оценке рыбохозяйствен ных водоемов. Указание министерство Здравоохранения РФ. 27 сентября 1999г. № 13-4-2/1742.

7. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. К., «Уро жай», 1978.

PROSPECTS OF APPLICATION OF BACTERIOPHAGES FOR THE DISPLAY OF THE PATHOGENIC AEROMONADS Gorshkov I.G., Кuklina N.G., Viktorov D.А., Nasibullin I.R., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Keywors: Baterophages aeromonoss fish, botehnoogy, mkrobogya, agnosts.

In work there s the revew of the moern terature on the subjets of nfetous astes of fish, the urrenty appe methos of treatment of fish an preventon of nfetous astes, as we as the substantaton of the appaton as a means of agnosts an treatment of booga preparatons on the bass of baterophages.

УДК 619: ОПТИМИЗАЦИЯ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS Гринева Т.А., соискатель,тел. 9033201410, e-mail: tag78@mail.ru Викторов Д.А., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: севдомонады, Pseuomonas hororaphs, псевдомонозы рыб, бак, териофаги, схема выделения.

В результате проведённых исследований была оптимизирована схема выделения бак териофагов Pseuomonas hororaphs. С использованием разработанной методики из водных объектов выделено 2 изолята бактериофагов, активных в отношении названого вида бакте Бактериофаги в медицине и ветеринарии рий.

Интенсивный рост аквакультуры обуславливает повышенный интерес к бактериаль ным заболеваниям пресноводных рыб.

Патогенные штаммы флюоресцирующих видов бактерий рода псевдомонад (Pseu omonas puta, Pseuomonas yprnseptum, Pseuomonas uoresens, Pseuomonas aureofa,, uoresens,, ens, Pseuomonas hororaphs, Pseuomonas ermoaba, Pseuomonas ntestnas) способны вызывать псевдомонозы карповых рыб [2].

P. сhororaphs является нормальным обитателем дистальных отделов кишечника рыб, но способна вызывать заболевания, когда концентрация бактерий в водоемах превышает есте ственный фон. В тоже время, бактерии P. сhororaphs могут быть использованы в качестве по тенциальных пробиотиков в борьбе с бактериальными заболеваниями пресноводных рыб [3].

Бактериологические методы диагностики, используемые в настоящее время, являют ся трудоемкими и продолжительными.

Нами оптимизирована схема получения бактериофагов P. сhororaphs для их даль нейшей селекции и разработки тест-систем для видового типирования P. сhororaphs.

Цель исследования: оптимизация схемы выделения бактериофагов P. сhororaphs из объектов окружающей среды.

Материалы и методы:

Для выделения бактериофагов P. сhororaphs исследовано 18 проб из водных источ ников Ульяновской области. Индикаторными культурами служили 5 полевых штаммов, вы деленных ранее из сточных вод, образцов почвы и прудовой воды. Исследование проводили по схеме, предложенной Викторовым Д.А., для выделения фагов [1]. Температурный режим и продолжительность культивирования были модифицированы с учетом биологических особен ностей объекта исследования.

В колбы с 50 мл концентрированного мясопептонного бульона добавляли исследуе мую воду в количестве 50 мл, таким образом доводя концентрацию среды до обычной, и по мл 18-часовой бульонной индикаторной культуры. После 48 часов культивирования при 28 С полученную взвесь в количестве 5 мл переносили в стерильные пробирки и центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин. Супернатант фильтровали через бактериальные фильтры с диа метром пор 0,2 мкм. Наличие бактериофагов в фильтрате определяли с помощью спот-теста.

На чашки Петри с мясопептонным агаром проводили посев 18-часовой бульонной культуры индикаторных штаммов сплошным газоном. После подсыхания газона на поверхность агара наносили 1 каплю исследуемого фильтрата. Контроль бактериального загрязнения фильтрата проводили на чашках Петри со стерильным мясопептонным агаром. Посевы просматривали через 24, 36, 48 часов. Присутствие в исследуемом материале бактериофагов определяли по наличию зон лизиса бактериального газона или отдельных негативных колоний.

В результате исследования были выделены 2 культуры бактериофагов P. сhororaphs.

В дальнейшем они были протестированы на референс-штамме P. сhororaphs В-1246, полу ченном во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино). Результаты тестирования положительные.

Вывод: Таким образом, нами были выделены 2 культуры бактериофагов бактерии P.

сhororaphs.

Библиографический список 1. Викторов, Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Pseu omonas uoresens / Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, Д.А. Васильев // Ветеринария и корм Бактериофаги в медицине и ветеринарии ление. – Москва: «ВЕТКОРМ», 2012. – №5. – С. 8-9.

2. Методические указания по лабораторной диагностике псевдомонозов рыб, Мин сельхозпрод России, Департамент ветеринарии, 1998.

3. Goldschmidt-Clermont, E., Wahli, T., Frey, J. & Burr, S. E. (2008).Identification of bac teria from the normal flora of perch, Pera uvats L., and evaluation of their inhibitory potential towards Aeromonas species. J Fsh Ds 31, 353–359.

OPTIMIZATION OF THE SCHEME OF ALLOCATION OF BACTERIOPHAGES PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS Grineva Т.А., Viktorov D.А., Vasilev D.А.

Key words: Pseuomonas, Pseuomonas hororaphs, pseuomonoss fish, baterophages, the rut seeton.

As a resut of the onute researh, the sheme of aoaton of baterophages Pseuomonas hororaphs has been optmze. Usng the eveope methooogy, 2 soates of baterophages atve n respet of the above type of batera were aoate from water objets.

УДК 619:616.98:579. ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ НА МИКРОФЛОРУ ТОЛСТОЙ КИШКИ Затевалов А.М., кандидат химических наук, 4520896@mail.ru Киселева И.А., (495)452-18-16, irina6804@mail.ru Копанев Ю.А., кандидат медицинских наук, info@gabrich.com Алешкин А.В., доктор биологических наук, ava@gabri.ru Афанасьев С.С., доктор медицинских наук, профессор, Селькова Е.П.

ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора Ключевые слова: функциональная активность микрофлоры кишеника, летуие жирные кислоты, фагоувствительность и фагорезистентность, препараты бактериофа гов.

Выявление критериев оценки и эффективности применения бактериофагов для кор рекции и нормализации кишеного микробиоценоза остается важной задаей, которая мо жет быть решена с помощью сравнения параметров функциональной активности и фено типиеских свойств микрофлоры кишеника, а так же путем определения избирательности действия препаратов бактериофагов на нормальную и условно-патогенную микрофлору ки шеника n vtro и n vvo.

Введение. В микробном сообществе нормальной микрофлоры человека эволюцион но сформировались межклеточные сети, которые представляют собой систему трофических и энергетических взаимосвязей внутри кишечного микробиоценоза[1].

Представление о микробиоте кишечника, как об отдельном органе человеческого ор Бактериофаги в медицине и ветеринарии ганизма не противоречит исторически сложившемуся определению органа, как части орга низма, представляющей собой эволюционно сложившийся комплекс тканей, объединенный общей функцией, структурной организацией и развитием [2].

Методы клинической биохимии – определение концентраций ЛЖК газо-жидкостной хроматографией дают важные критерии функциональной активности микробиоты кишечника, а именно концентрацию масляной кислоты, соотношение уксусной, пропионовой и масляной кислот, суммарную концентрацию ЛЖК, структурный индекс и индекс изокислот. На основа нии этих критериев можно сделать вывод о типе и степени нарушения функциональной актив ности микробиоценоза кишечника [3].

Не теряет своей актуальности микробиологический анализ кала, несмотря на неболь шой процент высеваемости представителей нормобиоценоза и непропорциональное соотно шение микроорганизмов в кишечнике и в кале. Такие свойства микроорганизмов, как чув ствительность к антибиотикам, чувствительность к бактериофагам коррелируют с некоторыми показателями функциональной активности микрофлоры кишечника и могут характеризовать состояние микробиоценоза кишечника[3].

Материалы и методы исследований. Исследование корреляции средней антибиоти ко- (САЧ) и фагочувствительности (СФЧ) выделенной микрофлоры со структурным индексом (СИ), индексом изокислот (ИИ), а так же других показателей ЛЖК [3], проведенное на пациентов консультативно-диагностического центра МНИИЭМ Габричевского, проводилось по результатам комплексного анализа микрофлоры кишечника, включающего биохимический, копрологический, и микробиологический анализ кала.

Влияние интести-бактериофага (производство ФГУП «НПО Микроген») in vivo на уровень бифидобактерий и лактобацилл в толстой кишке у 30-ти пациентов проводилось пу тем сравнения содержания этих бактерий до и спустя неделю после курсового приема препа рата. Нормофлору определяли с помощью микробиологического исследования кала, используя жидкие селективные агаризованные среды MRS и Блаурокк.

Также проводили исследования влияния интести-бактериофага на нормальную микро флору, полученную от 63 пациентов КДЦ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского», in vitro.

Сравнивали титры бифидобактерий и лактобацилл, исходно содержавшиеся в кале пациентов, с их количеством, определяемым на тех же средах при добавлении бактериофага.

Влияние интести-бактериофага на нормальную E.coli и условно-патогенную микро флору (гемолизирующую E.coli и S.aureus) определялось spot-тестом, заключающимся в оцен Протеолитический индекс Структурный индекс 6, 0, 0, 5, 0, 4, 0,6 y = 0,4683x + 3, y = 0,0616x + 0, R = 0, 0,5 R = 0,727 3, 0, 2, 0, 0, 1, 0, 0, 0, 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Средняя антибиотикочувствительность Средняя чувствительность к антибиотикам, отн. ед. (0 - 4) а) б) Рис. 1. Зависимость структурного индекса а) и индекса изокислот б) от средней антибиотикочувсвительности на большой выборке пациентов КДЦ МНИИЭМ им. Г.Н.

Габричевского.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии ке зоны лизиса на газоне исследуемых культур, посеянных на плотных селективных агаризо ванных средах, после нанесения на него капли интести-бактериофага.

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе проведения 3000 комплексных ис следований микрофлоры кишечника получена корреляция СИ и ИИ с САЧ. Результаты пред ставлены на рисунке 1.

Известно, что продуцентами уксусной кислоты могут быть как аэробная, так и ана эробная микрофлора. Продуценты пропионовой, масляной и далее по гомологическом ряду кислот являются анаэробные бактерии. Снижение СИ – доли анаэробных кислот указывает на сокращение численности анаэробных бактерий, снижению толщины защитной биопленки и о большей уязвимости стенок кишечника.

Известно, что при взаимоотношениях макроорганизма и микробиоты, макроорганизм управляет своей микробиотой, используя разные механизмы, в том числе и селективное пода вление различных групп микроорганизмов секрецией антибактериальных агентов (лизоцима и т.д.). Микрофлора, имеющая высокую антибиотикорезистентность, способна к самоорганиза ции микробного сообщества переориентированного на иные метаболические пути переработ ки субстрата и нарушению функциональной активности.

Положительная корреляция СИ и САЧ (рис. 1) свидетельствует о взаимосвязи струк туры функциональной активности микробиоты кишечника с ее управляемостью. При увели чении антибиотикорезистентности микробиоценоза увеличивается концентрация уксусной кислоты и снижается продукция анаэробных кислот.

Выявлена так же корреляция САЧ с индексом изокислот (ИИ), который рассчитывает ся как отношение суммы изоформ к сумме линейных форм масляной, валериановой и капроно вой кислот. ИИ характеризует протеолитическую активность микрофлоры, так как изоформы ЛЖК образуются при гидролизе белков. Увеличение индекса изокислот свидетельствует о по вышении протеолитической активности микрофлоры.

Положительная корреляция ИИ и САЧ (рис. 1) указывает на взаимосвязь между уве личением доли сахаролитической микрофлоры в «неуправляемых микробных сообществах» и общей антибиотикорезистентностью микробного сообщества.

По аналогии с САЧ был предложен критерий средней фагочувствительности (СФЧ).

Средняя чувствительность к фагам – это величина, полученная усреднением всех значений чувствительности к фагам (нормированных в баллы для унификации использования) по набо ру фагов (интести-бактериофаг, пиобактериофаг комплексный) и микроорганизмов, выделен Суммарная концентрация ЛЖК Концентрация, ммоль/г 120 y = -8,0934x + 100, R = 0, 0 1 2 3 4 Средняя фагочувствительность а) б) Рис.2. Зависимость а) суммарной концентрации ЛЖК и б) индекса изокислотот средней антибиотикочувсвительности на большой выборке пациентов КДЦ МНИИЭМ им. Г.Н.

Габричевского.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии ных из биоматериала пациента.

Предложенный критерий был исследован на предмет корреляции с показателями функциональной активности микрофлоры кишечника, в том числе со структурным индексом и индексом изокислот на 3000 пациентах КДЦ МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Отрицатель ная корреляционная зависимость была найдена между СФЧ и суммарной концентрацией (СК) ЛЖК.

На рисунке 2 видно, что с увеличением устойчивости микробиоценоза к фагам уве личивается СК ЛЖК в кале и растет индекс изокислот. Снижение ИИ и СК при увеличении фагочувствительности можно объяснить спецификой подбора фагов для комплексного анализа микрофлоры кишечника. В связи с тем, что практикующих врачей интересует чувствитель ность к фагам условно-патогенной, протеолитической микрофлоры, был задействован соот ветствующий набор фагов (интести-бактериофаг, пиобактериофаг комплексный). Таким об разом, можно отметить, что такие свойства микробиоценоза как фагочувствительность (рези стентность) и функциональная активность связаны между собой.

Для определения влияния интести-бактериофага на симбиотическую микрофлору толстой кишки (бифидобактерии и лактобациллы) было обследовано 30 человек. Сравнивали частоту встречаемости бифидобактерий и лактобацилл в кале пациентов в титрах их средних (медианных) значений в пределах доверительного интервала (р=95%) для бифидобактерий до 109 (107-109), после фаготерапии 108 (108-108);

для лактобацилл до 106 (105-107), после фаготе рапии 106 (105 - 106). Результат представлен на рисунке 3.

До фаготерапии Встречаемость, % 100% После фаготерапии P(Хи2)=0, 90% P(Хи2)=0, 80% 73% 73% 67% 70% 60% 50% 43% 40% 30% 20% Интенсивность, ср. лог. КОЕ 10% 7,9 7,9 5,9 5, 0% Бифидобактерии Лактобациллы Рис.3. Встречаемость бифидо- и лактофлоры до и после приема интести бактериофага пациентами.

Из рисунка 3 видно, что встречаемость лактобацилл и бифидобактерий достоверно не изменилась, интенсивность роста так же осталась прежней, а коэффициенты корреляции бифидобактерий (r=-0,080) и лактобацилл (r=-0,070) до и после принятия фагов показывают отсутствие тенденций к увеличению или снижению интенсивности роста определяемой микрофлоры. Таким образом, очевидно, что применение интести-бактериофага не влияет на рост симбиотической нормальной микрофлоры толстого кишечника.

Влияние интести-бактериофага на рост бифидобактерий, лактобациллы было исследовано методом серийных разведений in vitro на средах MRS и Блаурокк с добавлением и без добавления в среду этого фага. Проведенная работа показала, что большая часть штаммов нормофлоры является устойчивой к действию данного фага (таблица 1).

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 1. Частота выявления штаммов нормальной микрофлоры кишечника, чувствительных к интести-бактериофагу.

Микроорганизмы, (количество Частота выявления штаммов нормофлоры, исследованных штаммов) чувствительных к исследуемому фагу, в % +m Bifidobacterium, (63) 19,0 + 5, Lactobacillus, (63) 23,2 + 5, E.coli (hem-), (34) 29,4 + 4, Однако, некоторые штаммы (20 - 30%) оказались лизированными, что на наш взгляд, может свидетельствовать о проявлении этим коктейлем фагов неспецифической литической активности. Но, вопрос остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Влияние этого бактериофага на рост E.coli (hem-) (табл. 1), E. coli (hem+) и S.aureus исследовали в spot-тесте. Определяли частоту выявления штаммов, устойчивых и чувствительных к этому бактериофагу. Результаты показаны в таблице 2:

Таблица 2. Частота выявления фагорезистентных штаммов, % +m.

Микроорганизмы, (количество Частота выявления фагорезистентных штаммов в % исследованных штаммов) +m E.coli (hem+), (69) 20,3 + 2, S.aureus, (48) 18,8 + 3, Наши данные по нормальной микрофлоре совпадают с данными, представленными в литературе [4], но для условно-патогенных микроорганизмов значения частоты выявления фагорезистентных штаммов имеют большие значения. Это может быть связано как с изменчивостью представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры в составе микробиоценоза кишечника и особенностями данных микробиоценозов, отличающихся высо, кой степенью биоразнообразия системы в условиях дисбиотических изменений микрофлоры кишечника, так и с неспецифичной активностью штаммов бактериофагов в отношении бифидобактерий, лактобацилл и нормальной кишечной палочки.

Заключение. Избирательность действия бактериофагов зависит от индивидуальности микробиоценоза, от изменения фенотипических и эпигенетических свойств отдельных микроорганизмов. В связи с этим, необходим постоянный мониторинг чувствительности бактерий различных биотопов к существующим фаговым препаратам, с целью повышения их эффективности по отношению к патогенной микрофлоре и снижению побочного действия на нормофлору за счет обновления банка штаммов бактериофагов.

Библиографический список 1. Бондаренко В. Микрофлора человека: норма и патология. Наука в России, №1, 2007.

2. QinJ., LiR., RaesJ., ArumugamM. etal. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomicsequencing.MetaHITConsortium // Nature. 2010. Vol. 464 (7285). P. 59–65.

3. Затевалов А.М., Алешкин А.В., Селькова Е.П., Гусарова М.П., Затевалова Е.А.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ МИКРОБИОТЫ КИШЕЧНИКА // Международная научная конференция «Достижения и перспективы развития биотехнологии», Сборник тезисов с. 137.

4. Бочков И.А., Лавренов Э.С., Юрко Л.П. Влияние лечебных бактериофагов на Бактериофаги в медицине и ветеринарии условнопатогенную и симбиотическую микрофлору толстой кишки // Эпидемиология и инфекционные болезни, «2, THE INFLUENCE OF BACTERIOPHAGE ON THE GUT MICROFLORA Zatevalov A.M., Kopanev J.A., Aleshkin A.V., Afanasiev S.S.

Key words: funtona atvty of ntestna mroora, voate fatty as, an fagohuvs mroora, tvtenost fagorezstentnost, preparatons of baterophages.

Ientfiaton of evauaton rtera an effetveness of baterophages for orreton an normazaton of the ntestna mrobota s the mportant am whh an be sove by omparng the parameters of funtona atvty an phenotyp propertes of the ntestna mroora, as we as by etermnng seetvty of baterophage preparatons for a norma an ontonay pathogen ntestna mroora n vtro an n vvo.

УДК 619:579.852. ЗНАЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ФАГОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ BACILLUS ANTHRACIS Капустин А. В., кандидат ветеринарных наук, доцент, kapustin_andrei@mail.ru Моторыгин А. В. кандидат ветеринарных наук, motor.86@mail.ru ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Ключевые слова: сельскохозяйственные животные, бациллы, сибирская язва, вакци нация, патологиеский материал, фагодиагностика.

В работе приведены данные по изуению диагностиеских свойств бактериофагов и их применение для идентификации возбудителя сибирской язвы. о результатам проведенных исследований установлено, то исследуемые культуры Baus anthras обладали высокой увствительностью к бактериофагу, то позволило дифференцировать возбудителя сибир ской язвы от других видов Baus.

Введение. Сибирская язва – острое инфекционное заболевание из группы зоонозов, отнесенное к списку наиболее опасных карантинных инфекций. Болезнь главным образом травоядных животных, при этом смертность может достигать 80%. В последние годы в РФ ежегодно регистрируется от 3 до 11 вспышек сибирской язвы [5]. Этиологическим агентом является спорообразующие, грамположительные, палочки Bacillus anthracis, единственный об лигатный патоген из рода Bacillus. Большинство других видов Bacillus являются повсемест но распространенными обитающими в окружающей среде сапрофитами, некоторые из них, а именно Bacillus cereus, Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, могут ассоциироваться с пище выми отравлениями у людей и с другими клиническими проявлениями, как у людей, так и у животных [1-3,8].

На встрече Экспертного комитета по биологической стандартизации в 1998 году были проанализированы имеющиеся международные стандарты и список используемых биологиче Бактериофаги в медицине и ветеринарии ских препаратов ветеринарного назначения для диагностики и профилактики сибирской язвы и в результате были предложены новые методики и составлен актуальный список препаратов.

Однако эти меры не позволяют отказаться от используемых в настоящее время методов диа гностики и профилактики, в частности, ветеринарных вакцин против сибирской язвы, разра ботанных ещё в 60-х и 70-х годах. В некоторых странах для диагностики сибирской язвы в разложившихся тушах или продуктах животного происхождения до сих пор используют тер мопреципитиновый тест, описанный А. Асколи в 1910 г.

Основные трудности лабораторной диагностики сибирской язвы заключаются в том, что при естественном разложении туши животного большинство вегетативных организмов уничтожается под действием гнилостных бактерий. В жарком климате это может происхо дить в течение одного или двух дней, если туша остается нетронутой. В мазках из образцов крови, отобранных после этого, капсулированные бациллы обнаружить достаточно сложно, хотя культура может сохраняться в крови более 1-2 суток [6,9]. В жидкостях, вытекающих из естественных отверстий, может наблюдаться споруляция, и множество спор контаминируют окружающую среду, особенно когда туша вскрыта животными-падальщиками. В случае силь ного разложения туш, культивирование образцов почвы контаминированной выделениями, яв ляется основным способом подтверждения диагноза.

В качестве дополнительных лабораторных исследований помимо микроскопии мазков и термопреципитиновой кольцевой пробы, так же используют тесты: определение подвиж ности, чувствительность к пенициллину и специфическому диагностическому бактериофагу.

Цель и задачи исследования. В этой связи, из-за трудностей диагностики сибирской язвы, возникающих при проведении анализов почвы, шкур и разложившихся трупов живот ных, использование бактериофагов для идентификации возбудителя сибирской язвы является на сегодняшний день актуальной задачей.

Материалы и методы исследований.

Работа проведена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных ФГБУ «Всероссийский государственный Центр ка чества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Для проведения исследований использовали вакцинные штаммы: Baus anthras 55-ВНИИВВиМ, Baus anthras М71, Baus ereus, Baus subts. Исследования проводили в соответствии с «Ме тодическими указаниями по лабораторной диагностике и обнаружению возбудителя сибир ской язвы [4].

Чувствительность бактерий Baus anthras к бактериофагам была впервые описана Brown и Cherry в 1955 [7]. Бактериофаги различных производителей находятся в националь ных центральных ветеринарных лабораториях и других справочных лабораториях по сибир ской язве («Гамма», «К», Fah-ВНИИВВиМ и др.). В связи с тем, что стандартизированных тре -ВНИИВВиМ бований к диагностическим биологическим препаратам не существует – используемый нами в работе бактериофаг был получен по следующей схеме: аттенуированная культура Baus anthras на чашках Петри с агаром Mueller-Hinton + 5% овечьей кровью инкубация в тече inton nton ние 4-6 часов при 37 С засевание культуры фагом (при наличии интенсивного и видимого о невооруженным глазом роста) посев 2 мл исходного гамма бактериофага каплями наносят на всю поверхность культуры 37 оС, 12-14 ч помещают чашки в морозильник при -20оС на 12-14 ч 18-20 оС, 2 ч отбор и фильтрация жидкости через фильтровальную бумагу повторное стерильное фильтрование (фильтр 0,22мк) проверка эффективности фага и провер ка чувствительности к культуре Baus anthras (в разведениях 1/1, 1/10 до 1/10 000). Полу ченный бактериофаг хранили при 2-8 ос.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Результаты исследований и обсуждение.

Бактерии Bacillus anthracis без труда поддаются выделению из крови и тканей живот ных, недавно павших от сибирской язвы, и в чистой культуре на стандартных питательных средах, при 37оС, наиболее оптимальной средой является 10% кровяной агар. Но в то же время при разложении туши, особенно в теплом климате, бактерии, вызывающие гниение, оказыва ются вне конкуренции и, в конечном счете, они уничтожают инфицирующий организм в туше.

Подтверждение наличия сибирской язвы в таких случаях может зависеть от результатов вы деления возбудителя из почвы, контаминированной предсмертными выделениями.

Принцип реакции основан на свойствах бактерий Bacillus anthracis лизироватся си биреязвенными фагами. Для проведения реакции чашки с агаром Mueller-Hinton перед поста inton nton новкой пробы размечали на квадратные сектора со стороной 2 см. На каждый сектор наносили каплю 5—6-часовой бульонной культуры Bacillus anthracis. Чашку подсушивали в течение мин в термостате, после чего в центр подсохшей капли наносят петлей каплю (10-15 мкл) си биреязвенного бактериофага, в качестве дополнительного теста на другую сторону помещали диск с пенициллином (10 ед). Учет результатов проводили через 12—24 ч инкубации чашек при 37оС. В случае положительного результата на участке из-за лизиса наблюдали зоны про светления и отсутствие бактериального роста, вокруг пенициллинового диска наблюдалась чистая просветленная зона.

Заключение.

В результате проведенных исследований было установлено, что штаммы Baus anthras 55-ВНИИВВиМ и Baus anthras М71 были высокочувствительны к бактериофагу и пенициллину, и образовывали характерные зоны просветления диаметром от 30-50 мм;

у штаммов Baus ereus, Baus subts задержки роста на месте нанесения сибиреязвенного бактериофага не наблюдалось, культура Baus subts была резистентна к антибиотику. Со гласно полученным результатам, использование бактериофагов является и легко выполнимым и высокочувствительным методом, позволяющим идентифицировать Baus anthras от дру гих видов Bacillus.

Библиографический список 1. Бакулов, И.А. Сибирская язва (антракс): новые страницы в изучении «старой» бо лезни / И.А. Бакулов, В.А. Гаврилов, В.В. Селиверстов. -Владимир: «Посад», 2001. 218 с.

2. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А. и др. Сибирская язва. - М.: Колос, 1996.

3. Лобанова Т.П., Кихтенко Н. В. Сибирская язва. Монография. М., 2003. - 45 с.

4. МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибир ской язвы. Методические указания».

5. Онищенко Г.Г. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиоло гии, клиники, диагностики, лечения и профилактики /Г.Г. Онищенко и др, М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448 с.

6. Рязанова, А.Г. Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сиби реязвенного микроба, усовершенствование методов их индентификации и дифференцирова ния от близкородственных бацилл: Автореф. дис.. канд. мед. наук: (03.00.07)/ А.Г. Рязанова.

Ростов-на-Дону, 2006. - 23 с.

7.Brown E.R. & Cherry W.B. Specific «Identification of Bacillus anthracis by meen of a variant bacteriphage. J. Infect. Dis., 96, - P. 34-39.

8. Dieter, C., Dagmar F. II Bacillus Ed. C. R. Harwood. New York, London. Plenum Press.

1989. - P. 5-26.

9. Fellows, P.F. A survey of worldwide strains of Bacillus anthracis / P.F. Fellows // Proc.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. September 19-21. 1996. -N 87. - P. 33.

VALUE OF DIAGNOSTIC PHAGES FOR BACILLUS ANTRACIS IDENTIFICATION Kapustin A. V., Motorygin A. V.

Keywords: agrutura anmas, ba, magnant anthrax, baternaton, pathooga matera, phageagnoss.

Data on stuyng of agnost propertes of baterophages an ther appaton are prove n work for entfiaton of the orgnator of a magnant anthrax. By resuts of the onute researhes t s estabshe that stue utures of Baus anthras possesse hgh senstvty to sae to a baterophage that aowe to fferentate the orgnator of a magnant anthrax from other types of Baus.

УДК 602.3:579. ОЦЕНКА ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИОФАГОВ Катаева Л. В., кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, тел. 8(3452) 29-99-90, KataevaLV@tniikip.rospotrebnadzor.ru Вакарина А. А., младший научный сотрудник Нижегородцева Н. Ф., младший научный сотрудник ФБУН ТНИИКИП Роспотребнадзора Ключевые слова: Бактериофаги, увствительность, устойивость, штаммы бак терий, метод определения.

Работа посвящена определению увствительности/устойивости некоторых ус ловно-патогенных бактерий к бактериофагам разлиными методами (на плотной и в жид кой питательной среде). ри проведении исследования установлено, то увствительность штаммов бактерий к разлиным бактериофагам не одинакова, поэтому необходимо назна ать фаготерапию после исследования фаголитиеской активности. Кроме того, существу ющая методика определения и оценки активности фагов субъективна.

Введение. Современная ситуация снижения эффективности антибиотикотерапии очень сложна вследствие повышения устойчивости патогенных и условно-патогенных бакте рий к антибактериальным препаратам. Хорошие перспективы в качестве антимикробной тера пии имеют бактериофаги, которые эффективны в отношении как чувствительных, так и устой чивых к антибиотикам бактерий. Бактериофаги обладают рядом преимуществ: специфичность действия, отсутствие угнетения нормальной микрофлоры и аллергической реакции, стимуля ция факторов специфического и неспецифического иммунитета [1], применение бактериофа гов вместе с антибиотиками и иммунопрепаратами [2, 3]. Кроме того, весомым аргументом в пользу целесообразности клинического применения бактериофагов является практически пол ное отсутствие побочных эффектов, а следовательно, и противопоказаний [4].

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Чувствительность к бактериофагам бактерий, выделенных из стационаров различного профиля несколько варьирует. Так, литическая активность стафилококкового бактериофага и пиобактериофага к стафилококкам, выделенным из очагов гнойной инфекции, составляет 72 – 88 %, стрептококковый фаг лизировал 60 – 82 % штаммов стрептококков [5, 3]. Вместе с тем, результаты исследований чувствительности штаммов Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumonia, выделенных от больных гастроэнтерологического отделения показали, что стафи лококковый фаг лизировал 37,1 % штаммов, стрептококковый фаг – 12 – 21 % стрептококков [6]. Клебсиеллы сохраняли чувствительность как к клебсиеллезному, так и к пиобактериофагу в 87 % случаев. При сравнении литической активности монофагов и ассоциированных под черкивают, что у монофагов она более выражена [6, 3].

Таким образом, существенное различие данных о литической активности бактерио фагов условно-патогенных микроорганизмов, тем более, если речь идет о применении фагов в лечебных целях, свидетельствует о том, что в каждом конкретном случае необходимо пред варительное определение чувствительности конкретных микроорганизмов к бактериофагам определенных производителей [7].

Целью исследования явилось сравнение литической активности монофагов и ассо циированных фагов к штаммам Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia и Klebsiella pneumonia, а также характеристика эффективности методов определения чувствительности к фагам на плотной и в жидкой питательных средах.

Материалы и методы исследований.

Чувствительность исследуемых штаммов определялась к следующим бактериофа гам: стафилококковый бактериофаг, пиобактериофаг поливалентный очищенный и бактерио фаг клебсиелл поливалентный (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа), интестибактериофаг (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Нижний Новгород), пиокомбинированный, фаг клебсиелл пневмонии очищенный (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Пермь).

Действие монофагов и комбинированных бактериофагов было изучено на 159 культу рах Staphylococcus aureus и 62 штаммах бактерий Klebsiella pneumoniae, выделенных от боль ных с дисбиозами и здоровых новорожденных детей при еженедельном мониторировании родильного дома № 2 г. Тюмени. Фаголитическую активность стафилококкового, пиобакте риофага поливалентного, интестибактериофага и пиокомбинированного фага исследовали со штаммами Staphylococcus aureus на плотной (1,5 % мясопептонный агар - МПА) и в жидкой (мясопептонный бульон - МПБ) питательных средах.

Фаголитическую активность бактериофага клебсиелл пневмонии, клебсиеллезного поливалентного бактериофага и пиобактериофага поливалентного исследовали со штаммами Klebsiella pneumoniae.

Бактериальную суспензию суточной агаровой культуры (5 ед по ОСО 42-28-85-01 п) исследуемого штамма равномерно наносили на поверхность чашки Петри с хорошо подсу шенной питательной средой. На поверхность агара с впитавшейся культурой наносили одну каплю бактериофага. После подсыхания капли фага, чашки инкубировали в термостате при 370С в течение 18-20 ч. Степень лизиса культуры оценивали по схеме: полный лизис – «++++»/ «+++», свидетельствует о чувствительности изучаемого штамма к бактериофагу;

не полный лизис и отсутствие лизиса – « - », указывает на устойчивость штамма.

Применяли также вариант метода, при котором бактериофаги (5 капель) добавляли пастеровской пипеткой в 5 мл МПБ, в который вносили петлю суточной агаровой исследуемой культуры. Термостатировали 18-24 часа при 370С.

Статистическая обработка выполнена лицензионным программным обеспечением SPSS версия 14.0, предназначенным для научных исследований, отвечающих требованиям Бактериофаги в медицине и ветеринарии клинической эпидемиологии.

В исследовании использовались дискретные данные (типа Да/Нет – устойчивые/чув ствительные). Дискретные данные анализировались таблицами сопряженности, которые при менялись для расчета отношения шансов встречаемости исследуемых явлений в анализируе мых группах. Гипотеза о равенстве шансов встречаемости отвергалась, когда величина соот ветствующего критерия не равна 1, а его 95% доверительные интервалы не включали в себя 1.

Результаты исследований и их обсуждение.

Итоги изучения сравнительных характеристик методов определения фаголитической активности монофагов и ассоциированных бактериофагов на плотной и в жидкой питатель ной среде показали следующие результаты. Литическая активность фагов: стафилококкового, интестибактериофага и пиокомбинированного к бактериям S. aureus на МПА, практически не отличаются, различия статистически не значимы. Исключение составляет пиобактериофаг поливалентный, устойчивость к которому оказалась выше, чем у стафилококкового и инте стибактериофага, разница статистически достоверна, о чем свидетельствует критерий оценки статистической значимости, таблица 1.

Аналогичные исследования фаголитической активности в МПБ показали, что более высокая устойчивость стафилококков выявлена к стафилококковому и пиокомбинированному фагам, по сравнению с интестифагом и пиобактериофагом поливалентным, разница статисти чески достоверна, что подтверждают показатели таблицы 2.

При сравнении показателей устойчивости золотистого стафилококка к исследуемым бактериофагам на плотной и жидкой питательной среде с помощью расчета отношения шан сов различие установлено только по пиобактериофагу поливалентному (46,5 % и 24,3% соот ветственно).


Таблица 1 - Устойчивость бактерий S. aureus к бактериофагам при определении на МПА Устойчи- T критерий оценки статисти 95 % доверительный Количе- вость ческой значимости различий интервал Бактериофаг ство куль- штаммов к средних тур фагам Нижняя Верхняя 1 2 3 (%) граница граница 1.Стафилокок 159 27,7 20,60 34,80 - 3,06 0,16 1, ковый 2.Пиобактери офаг поли- 99 46,5 36,47 56,53 3,06 - 3,19 1, валентный 3.Интести 156 26,9 19,80 34,00 0,16 3,19 - 1, бактериофаг 4. П и о ком б и 55 38,2 25,10 51,30 1,41 1,01 1,52 нированный При использовании МПА для определения устойчивости к указанному фагу шансы литической способности оказались в 2,7 раза меньше, чем при использовании МПБ, а с учетом 95 % доверительного интервала величина этого показателя колебалась в пределах от 1,5 до 4, раз. Так как нижний доверительный интервал оказался более единицы, имеющееся различие шансов статистически значимо.

По результатам наших исследований не представляется возможным утверждать, что литическая активность монофага стафилококкового к штаммам S.aureus выше, чем у ассоци.aureus aureus Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 2 - Устойчивость бактерий S. aureus к бактериофагам при определении на МПБ 95 % доверительный T критерий оценки статисти Устой ческой значимости различий Количе- чивость интервал средних Бактериофаг ство куль- штаммов к тур фагам Нижняя Верхняя 1 2 3 (%) граница граница 1.Стафилокок- 165 37,6 30,66 45,14 - 2,35 1,76 0, ковый 2.Пиобактери офаг полива- 103 24,3 15,85 32,75 2,35 - 0,76 2, лентный 3.Интестибак- 165 28,5 21,47 35,53 1,76 0,76 - 1, териофаг 4. П и о ком б и - 62 40,3 27,84 52,76 0,37 2,13 1,65 нированный ированных фагов. Показатели свидетельствуют о значимых различиях при определении чув ствительности бактерий к пиобактериофагу поливалентному на плотной и жидкой питатель ных средах. Аналогичные результаты получены и при сравнении литической активности моно и ассоциированных бактериофагов к штаммам K. pneumoniae.

Исследование литической активности фагов по отношению к штаммам K. pneumoniae при использовании МПА показало наиболее высокую устойчивость их к пиополивалентному фагу. Критерий оценки статистической значимости различий средних свидетельствует о до стоверности различий, таблица 3.

Таблица 3 - Устойчивость бактерий K.euoae к бактериофагам при опреде.euoae euoae лении на МПА T критерий оценки ста Устойчивость Коли- 95 % доверительный тистической значимости штаммов к фа Бактериофаг чество интервал различий средних гам культур Нижняя Верхняя (%) 1 2 граница граница 1. Клебсиелла 62 67,7 55,82 79,58 - 1,06 2, пневмония 2. Клебсиелла 59 76,3 65,23 87,37 1,06 - 0, поливалентный 3.Пиобакте рио 49 83,7 73,15 94,25 2,01 0,97 фаг полива лентный Устойчивость к фагам бактерий K.pneumoniae в жидкой питательной среде оказалась наиболее высокой у бактериофага клебсиелл пневмонии, таблица 4.

Расчет отношения шансов частоты обнаружения устойчивых штаммов K.pneumoniae к бактериофагу клебсиелл пневмонии на плотной питательной среде с учетом 95 % доверитель ного интервала был от 3,0 до 14,5 раз выше, чем в жидкой питательной среде. Вместе с тем, указанные показатели устойчивости этих штаммов к бактериофагу клебсиелл поливалентному и пиополивалентному составил от 7,0 до 45,0 и от 7,7 до 60,0 соответственно.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 4 - Устойчивость бактерий K.euoae к бактериофагам при опреде.euoae euoae лении на МПБ 95 % доверительный T критерий оценки ста Коли- Устойчивость тистической значимо интервал штаммов к сти различий средних Бактериофаг чество фагам культур Нижняя Верхняя (%) 1 2 граница граница 1. Клебсиелл 62 24,2 13,32 35,08 - 2,01 0, пневмонии 2. Клебсиелл по- 59 15,3 5,93 24,67 2,01 - 0, ливалентный 3.Пиобактерио фаг поливалент- 52 19,2 8,28 30,12 0,65 0,54 ный Заключение. Сравнительная характеристика литической активности монофага ста филококкового и ассоциированных фагов (пиобактериофаг поливалентный, интестибактери офаг и пиокомбинированный), к золотистому стафилококку показала, что статистически до стоверные отличия отмечены только с пиобактериофагом поливалентным при исследовании на плотной питательной среде. При аналогичном исследовании в жидкой питательной среде результаты получаются противоположными. Штаммы клебсиелл пневмонии также были бо лее устойчивы к пиобактериофагу поливалентному при определении на плотной питательной среде и более чувствительны при исследовании в жидкой питательной среде, хотя различия статистически не достоверные. На наш взгляд, этот факт свидетельствует о несовершенстве существующих методик определения чувствительности бактерий к фагам.

Указанные методы определения устойчивости к фагам, применяемые в настоящее вре мя бактериологическими лабораториями в практическом здравоохранении не позволяют объ ективно оценить литические свойства бактериофагов, так как результаты оцениваются очень субъективно - в «крестах». Кроме того, широкое применение фаготерапии в лечении и про филактике бактериальных инфекций требует определения чувствительности к определенным бактериофагам конкретных производителей. Это выдвигает приоритетную задачу разработки методики, позволяющей количественно определять и оценивать чувствительность бактерий к бактериофагам.

Библиографический список 1. Майская Л. М., Дарбеева О. С., Парфенюк Р. Л. и др. Методика определения фаго чувствительности штаммов, выделенных от больных, к препаратам бактериофагов. //Научно практический журнал «БИО препараты». – 2003. - № 2. – С. 22-23.

2. Лазарева Е. Б. бактериофаги для лечения и профилактики инфекционных заболева ний. //Антибиотики и химиотерапия. – 2003. – 48. - № 1. –С.36-40.

3. Лазарева Е. Б., Спиридонова Т. Г., Киселевская-Бабина И. В. И др. Эффективность бактериофагов при лечении внутрибольничных инфекций у больных ожогами. //Стерилизация и госпитальные инфекции. – 2007. - № 2. – С. 48-50.

4. Дроздова О. М., Брусина Е. Б. Применение бактериофагов в эпидемиологичкой практике: взгляд через столетие. //Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2010. - № 5. – С.

20 – 24.

5. Меньшиков Д. Д., Янискер Г. Я., Савельева Г. Ф. и др. Чувствительность возбудите лей гнойно-воспалительных заболеваний к лечебным бактериофагам. //Антибиотики. – 1980.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии - № 5. – С. 356-359.

6. Веселов А. Я., Карманова С. Ю. Литическая активность и специфичность коммер ческих бактериофагов. //Клиническая лабораторная диагностика. -1992. - № 9. – С.55-57.

7. Зуева В. С., Дмитриенко О. А., Клицунова Н. В. Роль профагов в формировании антибиотикоустойчивых популяций стафилококков в процессе трансформации, трансдукции и коньюгации. //Антибиотики и химиотерапия. – 1996. – 41. - № 10. – С.35-42.

EVALUATION OF LYTIC ACTIVITY OF SOME BACTERIOPHAGES Kataevа L. V., Vakarina A. A., Nizhegorodtseva N. F.

Key words: Baterophages, senstvty, stabty, strans of batera, the metho efinton.

Senstvty / resstane of some opportunst batera to baterophages were nvestgate by varous methos (for so an qu meum). It was foun that batera strans senstvty of to severa baterophages are fferent, so you must assgn phage therapy ony after stuy fagot atvty. Furthermore, the urrent metho of etermnng an assessng the phage atvty s subjetve.

УДК 579.843:578.1:616-092:612.015. БАКТЕРИОФАГИ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ВИБРИОНОВ Кудрякова Т.А., доктор медицинских наук, Тел.8(863) 240-27-03, e-mail: plague@aaanet.ru Македонова Л.Д., кандидат медицинских наук, Гаевская Н.Е., Качкина Г.В., ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора Ключевые слова: бактериофаги Vbro hoerae O1, O139, не О1/не О139 серогрупп, V.abenss, V.parahaemoytus, V.agnoytus, V. mmus, V.metshnkov, биологиеская харак.abenss,.parahaemoytus,.agnoytus,.

abenss, parahaemoytus, agnoytus,,,,,.metshnkov, metshnkov,, теристика, применение.

Работа посвящена изуению свойств новых и имеющихся в коллекции фагов пато генных вибрионов. оказана принадлежность бактериофагов Vbro hoerae 1 к пяти мор фологиеским типам, V.abenss и V.parahaemoytus – к етырем, V. mmus – к одному и V.metshnkov – к одному. Охарактеризованы серологиеские свойства и установлены раз.metshnkov metshnkov лиия и сходства в антигенном строении. Специфиность литиеской активности бактери офагов использована в лабораторной диагностике патогенных вибрионов.

Введение. Большой фактический материал, накопленный в последние три десяти летия, свидетельствует о широком распространении патогенных вибрионов, для большой группы которых бактериофаги неизвестны. Показано, что на территории России и некоторых зарубежных государств возможно обнаружение бактериофагов холерных и парагемолитиче ских вибрионов, Vbro uvas, Vbro vunfius [1, 2, 3, 4]. В центре патогенных вибрионов Ростовского-на-Дону противочумного института были идентифицированы представители де сяти видов патогенных вибрионов, коллекция культур которых нуждается в дополнении соот ветствующими бактериофагами и разработке методов фагодиагностики. Детальное изучение взаимоотношения бактериофагов с клеткой хозяина имеет не только теоретическое, но и важ Бактериофаги в медицине и ветеринарии ное практическое значение в диагностике заболеваний, вызываемых патогенными для челове ка вибрионами.

Целью работы явилось сравнительное изучение свойств свежевыделенных и име ющихся в коллекции рас бактериофагов Vbro hoerae O1, O139, не О1/не О139 серогрупп, V.abenss, V.parahaemoytus, V.agnoytus, V. mmus, V.metshnkov для их дифференциа ции и применения.

Материалы и методы исследований. В работе использовали 301 фаг патогенных для человека вибрионов, выделенных из лизогенных штаммов и объектов внешней среды (та блица 1). Титры бактериофагов составляли 108-109 БОЕ/мл. В качестве индикаторных штам мов использовали V. hoerae hoerae 145, V. hoerae etor 75, КМ-199, V. hoerae О139-КМ 152, V. hoerae не О1 – 16 штаммов, V.parahaemoytus КМ-97, КМ- 184, V.abenss-КМ 41, V.metshnkov КМ 185, V. hoerae О37 серовара 1322-69.


При выращивании вибрионов применяли 0,7% и 1,5% агар и бульон Мартена (рН 7,6 7,8), для галофильных вибрионов V.parahaemoytus, V.agnoytus использовали те же сре ды с 3% NaCl. Результаты учитывали через 18-20 часов инкубации при 370С. биологические свойства фагов изучали классическими методами [5]. Строение корпускул исследовали в элек тронном микроскопе Gem-100B [6, 7]. Антифаговые сыворотки получали путем внутривенной иммунизации кроликов по методу Марьиной Ю.Н. [8]. Специфичность фагов испытывали на 135 штаммах микроорганизмов родственных видов, родов и семейств (Vbronaeae, Pseuo-, monaaeae, Enterobateraeae).

В работе применяли препараты диагностических холерных бактериофагов производ ства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»: классический, эльтор, ДДФ, ctx+ и ctx-.

Результаты исследований и их обсуждение. Материалы исследования показали, что бактериофаги патогенных вибрионов представляют собой неоднородную по свойствам группу. В таблице 1 суммированы основные морфологические типы [6] изученных 301 ДНК содержащих бактериофагов патогенных вибрионов. Впервые охарактеризованы новые фаги V.metshnkov и V. mmus, выделенные нами из лизогенных штаммов (патент № 2375437).

Установлено, что бактериофаги объединены у V. hoerae O1 и не О1/не О139 – пятью морфо группами, у V. hoerae О139 – двумя, V.abenss и V.parahaemoytus – четырьмя, у V. mmus – 1, V.metshnkov – 1 по классификации А.С.Тихоненко [6]. У бактериофагов отмечены три типа негативных колоний: 1 - мелкие с ободком по периферии;

2 - мутные;

3 - прозрачные, от 0,5 до 2мм в диаметре.

При анализе антигенных свойств бактериофагов выявлено большое разнообразие се рологических типов: 12 – у холерных фагов, 18 – у неагглютинирующихся О-сывороткой и О-139 сывороткой вибрионов, 11 – у парагемолитических и 4 – у алгинолитических вибрио нов. Наряду с высокой специфичностью антифаговых сывороток представленных рас фагов, установлено сходство антигенного строения у фагов V. hoerae O1 и О139 серогрупп (фаги II и XII серотипов), а также фагов V. mmus с холерными (XII серотип), дающими перекрестные реакции нейтрализации.

Для дифференциации бактериофагов I морфотипа от остальных (III –V) использова III V)) ли действие инактивирующих агентов – хлороформа и прогревание при температуре 650С.

Установлена чувствительность к химическому агенту филаментозных фагов и устойчивость к прогреванию. Специфичность литического действия фагов патогенных вибрионов, проверен ная на 135 штаммах различных видов бактерий, соответствовала таксономическим группам, и их активность не распространялась на представителей семейств Vbronaeae, Pseuomonaa, eae, Enterobateraeae. Для идентификации фагов V. mmus от серологически родственных холерных, присутствие которых возможно в пробах речной воды при мониторинге объектов Бактериофаги в медицине и ветеринарии Таблица 1. Особенности структурной организации бактериофагов патогенных для человека вибрионов Семейство фагов Число Ino Вид микроба изученных Myoviridae Siphoviridae Podoviridae viri фагов dae А1 А2 А3 В1 В2 В3 С1 С2 С3 F V.hoerae 1 207 141 - - 1 - - 21 - - V.hoerae 139 8 7 - - - - - - - - V.hoerae не О1/не 28 15 - - 2 - 5 3 2 - О V.abenss 17 - - - 2 - - 2 - - V.parahaemoytus 32 7 - - 9 2 - 8 - - V.agnoytus 4 1 - - 1 - - 1 - - V.metshnkov 3 - - - 3 - - - - - V. mmus 2 - - - - - - - - - Всего 301 171 - - 18 2 5 35 2 - окружающей среды на наличие вибриофлоры, нами предложен фагочувствительный к ним штамм V. hoerae О37 серогруппы, устойчивый к холерным фагам [9].

Данные ретроспективного анализа более 700 штаммов вибрионов, выделенных в последние 20 лет в разных эпидемиологических ситуациях, свидетельствовали о различии лизогенных систем вибрионов, циркулировавших на контролируемых территориях в пери од седьмой пандемии холеры. Нами создана система из восьми тест-культур, позволяющая идентифицировать обнаруживаемые умеренные фаги, из которых V. hoerae КМ 199, КМ 152;

V.parahaemoytus КМ 184, КМ 97;

V.metshnkov КМ 185 – депонированы в ГКПБ «Микроб».

Холерные вибрионы О139 серогруппы проявили лизогенные свойства на индикаторных штам мах холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп. Эти биологические особенности были исполь зованы для внутривидовой дифференциации вибрионов «Бенгал» [10].

Бактериофаги применяются в диагностике некоторых видов патогенных вибрионов: в идентификации холерных вибрионов О1 и не О1/не О139 серогрупп используется фаг ДДФ, в индикации биовара – классические и эльтор фаги, проводится определение фаготипа, диффе ренциация штаммов на серовары и внутривидовая дифференциация с помощью метода пря мого фаготипирования.

По результатам фаготипирования холерных вибрионов, изолированных из объектов окружающей среды на территории Российской Федерации, была установлена принадлежность штаммов к различным фаготипам (ф/т) в период с 2007 по 2011 годы: к трем – в 2007 году (13, 14, 19 ф/т), четырем – в 2010 (13, 14, 16, 19 ф/т) и в 2011 году – (5, 13, 15, 17 ф/т). Токсигенные холерные штаммы при использовании фагов ctx+ и ctx- в комплексе с гемолитической активно стью по Грейгу были идентифицированы в 94%. Фаготипирование более 200 штаммов параге молитических вибрионов с помощью авторского набора бактериофагов позволило определить принадлежность штаммов к одиннадцати фаготипам.

Заключение. Анализ полученных данных о свойствах большой группы бактериофа гов различных видов патогенных вибрионов позволяет установить не только их общность как представителей вирусов бактерий, но и различия признаков. По данным детекции и иденти фикации бактериофагов V. hoerae, V.parahaemoytus, V.abenss, V. mmus, V.metshnkov определены серологические свойства и морфология фагов. При сравнительном изучении Бактериофаги в медицине и ветеринарии бактериофагов обнаружены особенности по чувствительности к химическому агенту (хлоро форму) и устойчивости к повышенной температуре. Специфичность литического действия бактериофагов использована для тестирования на соответствующих видах микроорганизмов.

Создана База данных «Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека вибрионов» (Свидетельство о гос.регистрации базы данных № 2010620549 от 24.09.2010 г.), расширяющая возможность использования в научно-практических исследованиях по пробле ме «Холера и патогенные вибрионы». По мере накопления новых данных о фагах патогенных вибрионов, выяснение особенностей и специфичности лизогенных тест-систем может быть полезным в решении вопросов об эволюционных взаимоотношениях в пределах вида и между видами.

Библиографический список 1. Кудрякова Т.А. Лизогения холерных и парагемолитических вибрионов и её практи ческое значение. //Автореф.дисс….д-ра мед.наук.-Ростов – на – Дону, 1996.-42с.

2. Chen K, Lin Y, Chen G. Studies on diagnostic bacteriophage of Vibrio fluvialis. // Chung Hua Yu Fang i Hsuch Tsa chih (chinex Yornal of Preventive Medicine), 1995, 29 (3): 138-140.

3. Pelon W, Siebeling K.I., Simonson I, Liftig R.B. Isolation of bacteriophage infection for Vibrio vulnificus. // Current Microbiology, 1995, 30 (6): 331-336.

4. Остроумова Н.М., Агапова З.М., Мороз В.П. и др. Лизогения у НАГ - вибрионов О-41 серотипа. //Генетика и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1980. с.56-61.

5. Адамс М. Бактериофаги: Пер.с англ.-М., 1961,-527с.

6. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. - М., 1968, 89с.

7. Ackerman H.W. Bacteriophage taxonomy in 1987. // Microbiol. Sci.-1987.-Vol.4, № 7. Р.214-218.

8. Марьина Ю.Н. Получение антифаговой сыворотки и изучение антигенной структу ры фага.//Тр.Рост.н/Д противочум. ин-та.-1941.-Т.2.-с.3-7.

9. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В., Авдеева Е.П., Саямов С.Р. Патент РФ на изобретение № 2375437 – Способ выделения и дифференциации фага Vibrio mimicus. // Бюллетень № 34 от 10.12.2009г.

10. Кудрякова Т.А., Гаевская Н.Е., Македонова Л.Д., Качкина Г.В. Патент РФ на изо бретение № 2268942 – Способ внутривидовой дифференциации Vibrio cholerae 139. //Бюлле 139.

тень № 03 от 27.01.2006г.

BACTERIOPHAGES OF PATHOGENIC VIBRIOES FOR THE PERSON Kudryakova T.A., Makedonskaya L.D, Gaevskaya N.E. Kachkina G.V.

Key words: baterophages Vbro hoerae 1, 139, nether 1/nor 139 serogroups, V.abenss, V.parahaemoytus, V.agnoytus, V.mmus, V.metshnkov, booga propertes, appaton.

Ths arte s evote to the earnng of propertes of phages of pathogen vbroes new an avaabe n a oeton.The beongng of baterophages of Vbro hoerae 1 to five morphoog a types s state, V.abenss и V.parahaemoytus – to four, V.mmus – to one an V.metshnkov –to one. The serooga properfies are haraterze an stntons an smartes n an ant-gene struture are state. Spefiaton of yt atvty of baterophages s use n aboratory agnosts of pathogen vbroes.

Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 619:616.98:579. БАКТЕРИОФАГИ ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ КУР Ленев С.В., кандидат биологических наук, ФГБУ Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва, Тел. (8 495) 982 50 83, slenev@yandex.ru Ключевые слова: сальмонеллез, бактериофаги, антибиотики, куры, профилактика, леение риведены результаты изуения биологиеских свойств бактериофагов S. Enterts, S. Typhmurum и S. Ganarum, а также сравнения литиеского действия фагов и антибио тиков на сальмонеллы.

Введение. В России, как и во многих странах мира, среди пищевых зоонозов с уста новленным бактериальным агентом, сальмонеллез имеет наибольшую эпидемиологическую значимость. Показатель заболеваемости сальмонеллезом в РФ составил в 2011году 35,89 на сто тысяч населения, его доля составляла 17,9% от всех этиологически расшифрованных ки шечных инфекций (1).

Ситуация по сальмонеллезу в настоящее время не может считаться благополучной, что делает необходимым применение в практике ветеринарии и здравоохранения эффектив ных мер борьбы с заболеванием.

Установлено, что интенсивность циркуляции сальмонелл в природе во многом связана с интенсификацией процессов выращивания и переработки птицы. При этом, продукция пти цеводства рассматривается как главный путь передачи возбудителя человеку.

Проблема поиска эффективной альтернативы антибиотикам, а также ограничения по химической обработке птицы (использование хлорированной воды при убое) возродила инте рес к использованию бактериофагов в качестве средства профилактики зоонозных заболева ний, в том числе и сальмонеллеза птиц (2).

Концепция, по обеспечению безопасной продукции животного происхождения, в том числе и птицеводства, рекомендованная МЭБ и ФАО ВОЗ, направлена на предотвращения рас пространения сальмонелл вдоль всей пищевой цепи (по принципу - «от фермы до стола»).

В этой связи препараты бактериофагов обладают уникальными возможностями, так как могут быть эффективно использованы на разных стадиях пищевой цепи. Бактериофаги для контроля пищевых патогенов предлагается использовать в первичной звене для санации возбу дителя при выращивании птицы, обработке тушек и оборудования при убое, а также обработке продукции готовой для употребления (3).

Основными сероварами сальмонелл инфицирующими кур в Российской Федерации являются: S. Enteritidis, S. Gallinarum и S. Typhimurium, составляющие вместе около 95% саль монелл циркулирующих в птицеводческих хозяйствах. Этиологическая структура сальмонел леза птиц за последние 15 лет существенно не изменилась. В этот период возросла этиологи ческая значимость серовара S. enteritidis и уменьшилась серовара S. Gallinarum.

В данной работе приведены результаты изучения биологических свойств бактерио фагов S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Gallinarum, а также сравнения литического действия фагов и антибиотиков на сальмонеллы.

Материалы и методы исследований. Выделение изолятов фагов проводили из сточ ных вод птицефабрик, неблагополучных по сальмонеллезу кур. Для повышения вероятности Бактериофаги в медицине и ветеринарии обнаружения фагов использовали метод обогащения, описанный М. Адамсом (4). Чистые ли нии фагов получали последовательным клонированием морфологически однотипных негатив ных колоний. Сравнительную оценку морфологии негативных колоний различных фагов про водили, используя одну партию питательной среды и одинаковые условия культивирования.

Электронограммы вирионов бактериофагов выполняли на электронном микроскопе JEM-100-CX, при ускоряющем напряжении 80 киловольт, с использованием метода негатив ного контрастирования фосфорно-вольфрамовой кислотой по А.С. Тихоненко (5). В качестве модельного тест объекта использовали бактериофаг Т2.

Активность бактериофагов определяли общепринятыми способами – по количеству жизнеспособных фаговых частиц методом Грациа, и по литической активности фагов методом Аппельмана.

Чувствительность сальмонелл к 8 антибиотикам определяли диско-диффузионным методом, в соответствии с рекомендациями Института клинических и лабораторных стандар тов (CLSI), США.

Для изучения антибиотикорезистентности использовали 308 штаммов сальмонелл.

200 из них, представляли собой штаммы, собранные в коллекции микроорганизмов ВГНКИ в период 1948 по 2009 годы, а 108 - были изолятами сальмонелл, выделенными из пищевых про дуктов, кормов и биоматериалов от животных в различных регионах РФ в 2010 - 2012 годах.

Штаммы сальмонелл, относящиеся к основным сероварам сальмонелл инфицирую щих кур - S. Enteritidis, S. Typhimurium и S. Gallinarum, были испытаны на чувствительность к бактериофагам.

Для оценки эффективности лечебного и профилактического эффекта от применения фагов при сальмонеллезе на лабораторных животных использовали белых беспородных мы шей массой от 8-10г до 14-16 грамм, а также цыплят и кур различного возраста кроссов «Смена - 4», «Хайсекс коричневый» и «Иза-Браун». Профилактические свойства экспериментальных препаратов бактериофагов изучали, вводя перорально белым мышам по 106 и цыплятам по фаговых частиц, с последующим заражением через 2 часа опытных и контрольных животных 5LD50 вирулентного штамма сальмонелл. Лечебные свойства фагов проверяли, вводя их ана логично, и в тех же дозах, через трое суток после инфицирования вирулентными штаммами сальмонелл.

Результаты исследований и их обсуждение. Из проб сточных вод птицеводческих хозяйств выделено 27 изолятов бактериофагов S. Enteritidis, 14 - S. Typhimurium и 10 фагов S.Gallinarum. Состав популяций выделенных фагов был гетерогенным и был представлен не сколькими типами негативных колоний. После их клонирования и проведения пяти последова тельных пассажей на штаммах бактерий -хозяинах, из выделенных фагов отобраны наиболее активные. В их фаголизатах в течение 3-5 часов культивирования в стационарных условиях на капливалось от 8,4х109 до 2,0х1011 жизнеспособных фаговых частиц. Среди этих штаммов фа гов в свою очередь отобраны фаги, обладающие наименьшим периодом латентным периодом развития, высокой адсорбционной способностью и максимальной урожайностью. Установле но, что диапазон специфичности выделенных фагов ограничен пределами рода Salmonella.

Электронно-микроскопические исследования вирионов селекционированных фагов показали, что все они обладают бинальным типом симметрии, состоят из равносторонней го ловки в виде изометрического многогранника в форме икосаэдра с диаметром от 50 до нм, длинного несокращающегося отростка с поперечной исчерченностью длиной 105 -150 нм, имеют базальную пластинку и короткие фибриллы (рис.1). Фаги данного типа входят в семей ство Siphoviridae, относятся к морфотипу В1 по классификации H.W. Ackermann, M.S. Dubow (6).

Бактериофаги в медицине и ветеринарии Рис. 1 Морфология вирионов бактериофага F-6 S.etertds Таблица 1 - Сравнение чувствительности коллекционных штаммов к антибио тикам и изолятов сальмонелл поступивших в лабораторию в 2010-2012 гг.

промежуточно устой устойчивые чувствительные чивые коллекция изоляты коллекция изоляты коллекция изоляты Ампициллин 2,8% 5,6% 6,2% 0 90,9% 94,4% Цефтазидим 1,4% 1,8% 12,2% 7,41% 86,4% 90,1% Цефтриаксон 0,9% 0 9,9% 8,3% 89,1% 91,7% Доксициклин 11,9% 21,3% 22,2% 23,2% 65,8% 51,6% Ципрофлоксацин 0 0 2,6% 10,2% 97,4% 89,8% Гентамицин 0,8% 0,9% 0 1,9% 99,1% 97,2% Норфлоксацин 0 0,9% 0,5% 2,8% 99,5% 96,3% Стрептомицин 3,7% 6,5% 10,7% 9,3% 85,6% 84,3% Как следует из представленных данных, изученные штаммы сальмонелл в основном были чувствительны ко всем использованным в работе антибиотикам, за исключением докси циклина. Следует отметить, что среди изолятов, выделенных в 2010-2012гг., в 2 раза возросла частота обнаружения сальмонелл, устойчивых к ампициллину и доксициллину, в 1,8 раза - к стрептомицину (рис.2).

Рис 2. Штаммы и изоляты сальмонелл, устойчивые к антибиотикам Бактериофаги в медицине и ветеринарии Также у сальмонелл, выделенных в этот период, значительно возросло количество изолятов имеющих промежуточную устойчивость к ципрофлоксацину (в 3,9 раза) и норфлок сацину – в 5,6 раза (рис.3).

Рис. 3. Штаммы и изоляты сальмонелл промежуточно-устойчивые к антибио тикам Таким образом, проведенный ретроспективный анализ чувствительности к антибио тикам штаммов сальмонелл, собранных в коллекции микроорганизмов ВГНКИ в период с 1948 по 2009 годы, а также изолятов сальмонелл поступивших в институт в 2010-2012 годах, свидетельствует о возрастающей тенденции распространения штаммов возбудителей сальмо неллеза антибиотирезистентных к тетрациклинам, аминогликозидам и фторхинолонам.

При испытании сальмонелл на чувствительность к селекционированным бактериофа гам, установлено, что фаги S. Enteritidis способны лизировать 75 из 78 музейных и 101 из штаммов гомологичного серовара. Фаги S. Typhimurium – 35 из 37 музейных и 23 из 24 изоля тов сальмонелл этого серовара. Среди изученных штаммов сальмонелл серовара S.Gallinarum к фагам были чувствительны 51 из 53 музейных штаммов и 42 из 42 изолятов. Фагорезистенные штаммы сальмонелл имели «R» и « S-» форму колоний и, по всей видимости, представляли собой мутанты адсорбционного типа. Наличие устойчивых к фагам штаммов сальмонелл не было связано с давностью и источником их выделения. В целом, изученные музейные штаммы и «полевые» изоляты сальмонелл обладали очень высокой чувствительностью к селекциони рованным бактериофагам.

При оценке профилактического и лечебного эффекта бактериофагов введенных лабо раторным животным, установлено, что бактериофаги предохраняли от заболевания и гибели 90-100% белых мышей и 95-100% цыплят и оказывали лечебный эффект в 80-96% случаев, при гибели 80-100 животных в контрольной группе.

Заключение.Селекционированные штаммы бактериофагов S. Enteritidis, S. Gallinarum и S.Typhimurium используется в качестве производственных при изготовления фагового ком понента Сальмофага, единственного в настоящий момент, лечебно - профилактического пре парата содержащего фаги, зарегистрованного в РФ. Сальмофаг состоит из двух компонентов – сухой живой вакцины из фагоустойчивого аттенуированного штамма сальмонелл и бактери офага. Лечебный эффект препарата создается за счет высокоактивных бактериофагов широко го спектра действия. Фагоустойчивый вакцинный штамм обеспечивают формирование имму нитета к возбудителям после санации организма птиц бактериофагом.

Контролируемые опыты по применению промышленных серий препаратов сальмофа Бактериофаги в медицине и ветеринарии га содержащих бактериофаги S. Enteritidis, S. Gallinarum и S. Typhimurium в птицеводческих хозяйствах различных регионов страны, неблагополучных по сальмонеллезу, показали их вы сокую лечебно-профилактическую эффективность.

Библиографический список 1. Информационный бюллетень Референс – центра по мониторингу за сальмонеллеза ми №24, - М., 2012.- 66с.

2. R. J. Atterbury, M. A. P. Van Bergen, F. rtiz, M. A. Lovell, J. A. Harris et al., Bacteriophage Therapy To Reduce Samonea Colonization of Broiler Chickens // Appl Environ Microbiol. July;

73(14), 4543–4549.

3. S. Hagens, M. J. Loessner Bacteriophage for Biocontrol of Foodborne Pathogens:



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 7 |
 



Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.