авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 9 |

«ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Сервис виртуальных конференций Pax Grid Акутальные проблемы биохимии и бионанотехнологии III ...»

-- [ Страница 5 ] --

Для оценки пищевой ценности и функциональной направленности разработанных напитков нами проведены исследования по определению содержания минеральных веществ, углеводов и органических кислот.

Минеральные вещества выполняют пластическую функцию в процессах жизнедеятельности человека и построении костной ткани.

Минеральные вещества участвуют в важнейших обменных процессах организма - водно-солевом, кислотно-щелочном, поддерживают осмотическое давление в клетках, влияют на иммунитет, кроветворение и свертываемость крови. Многие ферментативные процессы в организме невозможны без участия тех или иных минеральных веществ. Примерно треть всех ферментов содержит в своем составе металл или активируется металлом.

Одним из важных межклеточных и внутриклеточных элементов, участвующий в создании необходимой буферности крови, регуляции кровяного давления, водного обмена является натрий.

Калий в некоторых физиологических процессах выступает как антагонист натрия и увеличение концентрации калия приводит к выделению натрия из организма. Уменьшение содержания калия в организме приводит к мышечной слабости, сонливости, потере аппетита и появлению аритмий. Для ликвидации этих симптомов назначают диету с богатыми калием продуктами.

Кальций необходим для поддержания нервно-мышечной возбудимости, он участвует в процессе свертываемости крови, оказывает влияние на проницаемость клеточных оболочек.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Магний обладает сосудорасширяющим действием, стимулирует перистальтику кишечника и повышает желчеотделение. Имеются данные о холестеринпонижающем влиянии этого элемента. Ионы магния принимают участие в углеводном и фосфорном обмене. Важная роль отводится магнию в регуляции деятельности нервной системы. При недостатке магния в почках развивается дегенеративные изменения с нефротическими явлениями.

Овощное сырье рассматривается в рационе питания человека как источник таких минеральных веществ как натрий, калий, кальций, магний. Результаты исследования содержания этих микроэлементов в разработанных напитках представлены в табл. 1.

Полученные данные позволяют сделать вывод о целесообразности применения напитков в питании, как источника минеральных веществ.





Так напитки на основе свекловичного пектинового концентрата отличаются повышенным содержанием калия (135-172 мг/100г напитка) по сравнению с напитками на основе яблочного концентрата (120- мг/100г напитка). В тоже время содержание натрия в напитках со свекловичным концентратом меньше, чем в напитках с яблочным – 346-352 мг/100г и 428-433 мг/100г соответственно. Что касается кальция и магния, то более высокое их содержание наблюдается в напитках на основе яблочного пектинового концентрата. Полученные данные необходимо учитывать при рекомендациях для включения разработанных напитков в различные рационы питания.

Таблица 1. Содержание микроэлементов в напитках на основе томатного сока Вид Калий, Наименование Натрий, Кальций, Магний, пектинового мг/ напитков мг/100 г мг/100 г мг/100 г концентрата г яблочный 428 132 13 Томатный пектиновый свекловичный 346 156 9 яблочный 430 144 14 Ароматный пектиновый свекловичный 350 165 10 яблочный 431 150 15 Особый с пектином свекловичный 351 172 10 яблочный 433 126 15 Молодость с пектином свекловичный 352 141 12 яблочный 430 120 16 Огуречный с пектином свекловичный 350 135 12 Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Углеводы необходимы для биосинтеза нуклеиновых кислот, заменимых аминокислот как составная структурная часть клеток. Они имеют и определенное пластическое значение, входя в состав гормонов, ферментов и секретов слизистых желез. С этой целью нами проведены исследования по определению содержания моносахаридов в разработанных напитках (табл.2).

Регуляторная функция углеводов разнообразна. Они противодействуют накоплению кетоновых тел при окислении жиров, регулируют обмен углеводов и деятельность центральной нервной системы. Важную роль играют углеводы, выполняя защитные функции.

Потребление глюкозы и фруктозы - двух наиболее распространенных в природе моносахаридов - достигает 20% общего потребления углеводов.

Из кишечника углеводы всасываются в кровь только в виде глюкозы и фруктозы. Глюкозу в качестве питательного материала в организме человека используют исключительно нервные клетки, мозговое вещество почек и эритроциты.

Таблица 2. Содержание сахаров в напитках на основе томатного сока Вид пектинового Наименование напитков Фруктоза, г/100 г Глюкоза, г/100 г концентрата яблочный 1,4380 1, Томатный пектиновый свекловичный 1,1170 0, яблочный 1,4250 0, Ароматный пектиновый свекловичный 0,9750 0, яблочный 1,4338 0, Особый с пектином свекловичный 0,879 0, яблочный 1,7064 2, Молодость с пектином свекловичный 1,2450 1, яблочный 1,4110 0, Огуречный с пектином свекловичный 0,9570 0, Из данных таблицы 2 следует, что более высокое содержание фруктозы и глюкозы наблюдается в напитках на основе яблочного пектинового концентрата.

Значение пищевых кислот в питании человека определяется их энергетической ценностью и участием в обмене веществ. Обычно они не вызывают дополнительной кислотной нагрузки в организме, окисляясь при обмене веществ с большой скоростью. Основная функция органических кислот, входящих в состав пищи, связана с участием процесса пищеварения. К таким функциям органических кислот относятся: активация перистальтики кишечника;

стимуляция секреции пищеварительных соков;





влияние на формирование определенного Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" состава микрофлоры путем снижения рН среды;

торможение развития гнилостных процессов в толстом кишечнике [4](табл. 3.) Из представленных данных следует, что содержание яблочной кислоты в напитках на основе яблочного концентрата колеблется от 0,350 до 1,437%, лимонной – от 1,860 до 3,038%. В напитках на основе свекловичного концентрата органических кислот содержится меньшее количество: лимонной - от 1,215 до 2,020%, яблочной – от 0,270 до 1,378%.

Таблица 3. Содержание органических кислот в напитках на основе томатного сока Яблочная, Лимонная Наименование напитков Вид пектина г/100г г/ яблочный 0,457 2, Томатный пектиновый свекловичный 0,321 2, яблочный 0,429 2, Ароматный пектиновый свекловичный 0,310 2, яблочный 0,501 3, Особый с пектином свекловичный 0,379 2, яблочный 1,437 1, Молодость с пектином свекловичный 1,378 1, яблочный 0,350 1, Огуречный с пектином свекловичный 0,270 1, Таким образом, разработанные напитки могут быть рекомендованы для ежедневного питания, как пищевой продукт, предназначенный для систематического употребления в составе пищевых рационов, снижающих риск развития ряда заболеваний, связанных с загрязнением окружающей среды токсическими веществами и радионуклидами.

Литература 1. Донченко Л.В. Надыкта В.Д. Безопасность пищевого сырья и продуктов питания. М.: ДеЛи принт, 2007. 539 с.

2. А.А.Кочеткова. Функциональные пищевые продукты: общее и частное практических задач//Пищевые ингредиенты, сырье и добавки, 2012.

№1. С. 34-37.

3. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов. Учебное пособие. М.: ДеЛи, 2000. 253 с.

4. Пищевая химия / Нечаев А.П., Траубенберг С.Е., Кочеткова А.А. и др.

СПб.:ГИОРД, 2007. 640 с.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ИЗУЧЕНИЕ IN SILICO 3D-СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ ХИТОЗАНА С КАППА-КАРРАГИНАНОМ В РАСТВОРЕ Лихацкая Г.Н.1,Володько А.В.1,Трифонов Е.В.2,Нурминский Е.А.2,Ермак И.М.1,Давыдова В.Н. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022, г. Владивосток Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт автоматики и процессов управления ДВО РАН, г. Владивосток galin@piboc.dvo.ru Полисахариды полиионной природы интересны тем, что могут быть использованы для получения разнообразных полиэлектролитных комплексов (ПЭК), что является перспективным направлением в современной науке о биополимерах. Изменяя условия проведения полиэлектролитной реакции между двумя ионногенными полисахаридами, можно получать широкий спектр полиэлектролитных композитов в виде геля, нано-и микрочастиц, пленок и мембран, пористых структур и растворимых комплексов. Строение и свойства таких композитов зависят от природы и структуры исходных компонентов и условий их формирования. Комплексообразование получаемых ПЭК будет определяться плотностью заряда на молекулах полисахаридов, их концентрацией и конформацией макромолекул. При определенных сочетаниях перечисленных факторов формируются растворимые и нерастворимые, стехиометрические или нестехиометрические композиты, которые могут иметь разнообразное применение. ПЭК на основе таких полисахаридов как хитозан и каррагинан, которые проявляют широкий спектр биологической активности, представляют интерес для использования в медицине и биотехнологии. Недавно получены ПЭК хитозана и каппа-каррагинана в растворе [1]. Экспериментальные данные о детальной пространственной структуре таких комплексов в настоящее время отсутствуют. В данной работе методами структурной биоинформатики получены теоретические модели 3D-структуры хитозана, каппа-каррагинана и их комплексов в водной фазе. 3D-структуры пентасахарида хитозана и 50-мера хитозана в протонированной форме в водной фазе получены с помощью молекулярного редактора программы МОЕ 2011.10 [2]. Структура Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" каппа-каррагинана в растворе получена с использованием кристаллической структуры йота-каррагинана (код PDB 1CAR).

Модификация структуры йота-каррагинана и построение двойной спирали каппа-каррагиана проводились с помощью программы МОЕ.

Оптимизация структур хитозана и каппа-каррагинана проводилась методом минимизации энергии после сольватации молекул в водной фазе в присутствии NaCl для нейтрализации зарядов. Структура протонированной формы хитозана в водной фазе стабилизируется внутримолекулярными водородными связями НО3-О и N2-О6 (рис. 1).

Структура двойной спирали каппа-каррагинана стабилизируется внутри и межмолекулярными водородными связями. Молекулярная поверхность хитозана имеет положительно заряженный потенциал.

Электростатический потенциал молекулярной поверхности двойной спирали каппа-каррагинана имеет электроотрицательные участки.

Оптимизированные 3D-структуры хитозана и каппа-каррагинана использовались для построения структуры их комплексов методом молекулярного докинга. Полноатомная модель 3D-структуры комплекса пентасахарида хитозана получена методом молекулярного докинга с помощью модуля докинга программы МОЕ. Анализ контактов, стабилизирующих структуру комплекса, проведен с помощью программы МОЕ (табл. 1). Обнаружено, что водородные и ионные связи атомов азота молекул хитозана вносят наибольший вклад в энергию образования комплекса хитозана с каррагинаном. С помощью программы GRAMM рассчитаны структуры 100 комплексов 50-мера хитозана в протонированной форме с каппа-каррагинаном. Обнаружено, что хитозан может иметь несколько сайтов связывания с двойной спиралью каррагинана (рис.2). При образовании комплексов в растворе может наблюдаться стехиометрия комплексов 1:1, 1:1,5 и 1:2. Результаты теоретических расчетов показали, что наиболее вероятные комплексы имеют стехиометрию 1:1 и 1:1,5. Данные полученные методами компьютерного моделирования согласуются с экспериментальными данными по стехиометрии комплексов хитозана и каппа-каррагинана в растворе [1].

Таким образом, в экспериментах in silico впервые получены атомные детали с 3D-структуры комплексов хитозана с каппа-каррагинаном в растворе. Обнаружено, что хитозан может иметь несколько сайтов связывания с двойной спиралью каррагинана.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Таблица 1. Контакты, стабилизирующие структуру комплекса пентасахарида хитозана и каппа-каррагиинана Лиганд Рецептор Связь Расстояние E (ккал/моль) O6 19 O7 G4S 1 (B) H-donor 3.01 -1. O3 46 O7 DGS 6 (A) H-donor 2.72 -1. N2 60 O7 DGS 6 (A) H-donor 3.00 -0. N2 60 O8 DGS 6 (A) H-donor 3.27 -5. O3 69 O1 DGS 6 (A) H-donor 3.18 -0. O3 115 O7 G4S 1 (B) H-donor 2.89 -2. O4 117 O7 G4S 1 (B) H-donor 2.95 -2. N2 12 O9 DGS 6 (A) ionic 2.96 -4. N2 60 O7 DGS 6 (A) ionic 3.00 -4. N2 60 O8 DGS 6 (A) ionic 3.27 -2. Рис. 1. Теоретическая модель 3D-структуры пентасахарида хитозана после сольватации в воде и минимизации энергии с помощью программы МОЕ.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Рис. 2. Потенциальные 4 сайта связывания хитозана с каппа-каррагинаном с наиболее низкой энергией, рассчитанные с помощью программы GRAMM 1.03 с параметрами докинга низкого разрешения Литература 1. Володько А. В., Давыдова В. Н., Барабанова А. О., Соловьева Т. Ф., Ермак И. М. // Химия природных соединений. – 2012. – № 3. – С.

321–325.

2. Molecular Operating Environment (MOE), 2011.10;

Chemical Computing Group Inc., 1010 Sherbooke St. West, Suite #910, Montreal, QC, Canada, H3A 2R7, 2011.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" РОЛЬ ТИРОЗИНКИНАЗНЫХ ИНГИБИТОРОВ В ABCC10-ЗАВИСИМОЙ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ Малофеева Е. В.1, 3, Иксанова А. Г.1, Доманитская Н. В.2, 3, Фаттахова А. Н.1, Hopper-Borge E. Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт молекулярной биологии и биофизики СД РАМС, Новосибирск, Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA katrin537@yandex.ru За последнее десятилетие возросло количество новосинтезированных тирозинкиназных ингибиторов, применяемых для лечения некоторых видов рака, таких как рак почек и лейкемия. Ранее было показано, что тирозинкиназные (ТК) ингибиторы могут являться субстратами не только для тирозинкиназных рецепторов, но и для других мишеней, задействованных во множественной лекарственной устойчивости клеток к терапевтическим агентам. В зависимости от этапа воздействия лекарственного соединения на клетку выделяют несколько механизмов возникновения множественной лекарственной устойчивости – от ограничения накопления лекарственного соединения внутри клетки до отмены запрограммированной клеточной гибели. Наиболее изученным механизмом является активация трансмембранных транспортных белков, выводящих различные вещества из клетки (к ним принадлежит широко изученный Р-гликопротеин (АВСB1), и изучаемый нами – MRP (ABCC10)). В данной статье описано действие некоторых ингибиторов ТК рецепторов на ABCC10-опосредованную лекарственную устойчивость.

Нами было установлено, что Erlotinib и Lapatinib в концентрации 5µМ, являющиеся EGFR ингибиторами, а также Nilotinib, Imatinib (PDGFR ингибиторы) и Sorafenib (PDGFR, VEGFR ингибитор) снижают АТФазную активность ABCC10, представляющего собой АТФ-зависимым активный транспортер. Однако, только Nilotinib, Sorafenib, Erlotinib и Dasatinib (BCR-ABL ингибитор) достоверно увеличивали внутриклеточную аккумуляцию субстрата ABCC10 [3H]-доцетаксела в клетках LLC-PK1 с гиперэкспрессией ABCC10 в сравнении с контрольной клеточной линией LLC-PK1 без гиперэкспрессии ABCC10. Таким образом, ТК ингибиторы являются потенциальными ингибиторами ABCC10-зависимой лекарственной устойчивости, и в комбинации с противоопухолевыми субстратами ABCC10 могут быть использованы в терапии рака.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БЛОКСОПОЛИМЕРОВ ЭТИЛЕН- И ПРОПИЛЕНОКСИДА НА ДОСТАВКУ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК В КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА Мартынова А. Д., Бондарь О. В., Абдуллин Т. И.

Казанский (Приволжский) федеральный университет martalina007@gmail.com Разработка эффективных систем доставки генетического материала является актуальной задачей клеточной биологии и генной терапии.

Среди генетических векторов наиболее безопасными являются плазмидные ДНК (пДНК), однако, применение препаратов пДНК, как правило, требует специальных систем доставки. Нами исследована возможность применения амфифильных блоксополимеров этилен- и пропиленоксида для внутриклеточной доставки пДНК и ее комплексов с поликатионами.

В работе использовали трехфункциональные блоксополимеры на основе глицерина(лапролы), полиэтиленимин(25 кДа) и коммерческий трансфекционный реагент Turbofect. Установлено, что Turbofect образует более компактные положительно заряженные полиплексы с плазмидной ДНК и обеспечивает большую экспрессию репортерного гена (GFP) в клетках HEK 293, чем полиэтиленимин. Лапролы слабо взаимодействуют с плазмидной ДНК и не улучшают ее внутриклеточную доставку, однако существенно усиливают трансфекцию клеток комплексами ДНК с полиэтиленимином. Результаты показывают, что исследуемые блоксополимеры обладают умеренной цитотоксичностью и могут быть использованы в качестве системы доставки пДНК в клетки человека.

Литература 1. А.Д. Мартынова и др., Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – том VII. – № 3. – С. 101-104.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" МЕМБРАННАЯ ФРАКЦИЯ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS КАК БИОКАТАЛИЗАТОР В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ Минайчева П.Р., Возчикова С.В., Алферов С.В.

ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет polina051189@rambler.ru Уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans широко используются в биотехнологии при производстве биологически активных соединений и пищевых продуктов. Они эффективно окисляют углеводы, спирты и способны к росту в средах с высоким содержанием сахаров и полиолов и низкими значениями рН. Мембранная локализация ферментов дегидрогеназ, ответственных за быстрое окисление углеродных субстратов, обеспечивает легкий доступ искусственных акцепторов электронов – медиаторов к активным центрам ферментов.

Эта особенность бактерий Gluconobacter была использована при разработке амперометрических микробных медиаторных биосенсоров.

Учитывая сходство конструкций медиаторных биосенсоров и БТЭ, можно говорить о возможности использования мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans в качестве биокатализатора в макете биотопливного элемента.

Таким образом, целью данной работы было определение энергетических характеристик макета биотопливного элемента на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans. Ферментные препараты, содержащие мембранлокализованные и цитоплазматические дегидрогеназы бактерий Gluconobacter oxydans, получали из разрушенной ультразвуком биомассы бактерий путем последовательного центрифугирования. Провели сравнение величин генерируемых потенциалов в макете биотопливного элемента в режиме замкнутой внешней цепи (внешнее сопротивление составило 240 и 150 кОм соответственно) на основе целых клеток и мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans. Установлено, что величина генерируемого потенциала при использовании мембранной фракции по сравнению с использованием целых клеток возрастает в 2 раза (120±10 и 210±10 мВ соответственно), что, по-видимому, связано с большей доступностью окислительно-восстановительных ферментов в составе мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans для медиатора Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" электронного транспорта. Максимальное значение мощности в макете БТЭ на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans наблюдается при приложенном внешнем сопротивлении 100 кОм: Pmax =160±15 нВт, расчетное значение удельной мощности, отнесенное к единице рабочей поверхности электрода, составляет 0,5 мВт/м2. Таким образом, использование мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans в качестве биокатализатора является перспективным направлением, позволяющим существенно увеличить энергетические характеристики разработанного макета БТЭ.

БЛАГОДАРНОСТИ Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук, договор № 16.120.11. – МК.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В КЛЕТКАХ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПЕРИНАТАЛЬНОМ ГИПОКСИЧЕСКИ-ИШЕМИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА Моргун А. В., Пожиленкова Е. А., Малиновская Н. А., Кувачева Н. В., Комлева Ю. К., Салмина А. Б.

ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации, ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии a_morgun@mail.ru Белок лекарственной устойчивости (P-гликопротеин, Pgp) является трансмембранным АТФ-зависимым насосом, удаляющим химические вещества из цитоплазмы клеток [1]. В центральной нервной системе этот белок, в основном, экспрессируется на поверхности цитоплазматической мембраны эндотелиоцитов, входящих в состав гематоэнцефалического барьера [2]. В некоторых работах указывается на локализацию P-гликопротеина на астроцитах и нейронах. Другие авторы не подтверждают локализацию Pgp на нейронах головного мозга [3, 4].

Однако при сокультивировании астроцитов и эндотелиоцитов in vitro локальный окислительный стресс, вызванный астроцитами, приводит к усилению экспрессии Pgp на эндотелиоцитах [5]. Белок лекарственной устойчивости транспортирует самые разнообразные субстраты - от неорганических ионов до белков. В клетках с повышенной функцией или содержанием этого белка отмечается снижение накопления любого вещества, которое является для него субстратом. Такие вещества быстрее высвобождаются из Pgp-положительных клеток, в то же время ингибиторы функции Pgp тормозят процесс экструзии препаратов.

Уровень экспрессии Pgp на эндотелиоцитах играет роль в биодоступности многих метаболитов и веществ для головного мозга.

Было высказано предположение, Pgp что играет роль в элиминации A белков при болезни Альцгеймера [6]. В то же время роль Pgp в Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" центральной нервной системе (ЦНС) при гипоксии-ишемии изучена не до конца. Известно, что, с одной стороны, Pgp предотвращает негативное влияние цитокинов на ЦНС, с другой стороны, он предотвращает проникновение лекарственных веществ в ЦНС и снижает эффективность терапевтических мероприятий [7].

Цель исследования: изучить особенности экспрессии Pgp в клетках головного мозга при перинатальном гипоксически-ишемическом поражении.

Материалы и методы Объект исследования – белые беспородные крысята в возрасте десяти суток (P10) в количестве 35. Все животные были разделены на группы по семь животных: контрольная группа (ложно-оперированные животные), четыре экспериментальных группы - через 4, 12, 24, 72 часа после моделирования гипоксии-ишемии (группы 1, 2, 3 и 4, соответственно).

Условия содержания и обращения с экспериментальными животными соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 2000).

Моделирование перинатального гипоксически-ишемического поражения головного мозга проводилось путем постоянной окклюзии правой ОСА с последующим помещением крысят в атмосферу с низким содержанием кислорода (по методу J. Rice, 1989). Животных декапитировали после охлаждения на льду и производили забор лобных областей головного мозга.

Суспензию клеток получали путем ферментативной обработки ( мг/мл коллагеназы и 10 мг/мл трипсина), затем готовили препараты по типу «толстой капли», высушивали при комнатной температуре.

Детекция экспрессии Pgp на клетках гематоэнцефалического барьера проводилась на суспензии клеток путем одновременного или последовательного комбинированного окрашивания препарата антителами к следующим белкам: Pgp (белок лекарственной устойчивости), NSE (нейронспецифическая енолаза) - маркер нейронов;

GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) - маркер астроцитов;

CD31 - маркер эндотелиоцитов сосудов согласно стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуноцитохимии.

При проведении люминесцентной микроскопии в суспензии (х900) Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" подсчитывали количество клеток, соэкспрессирующих Pgp и маркер вида клеток (NSE, GFAP или CD 31) в процентах на 300 клеток.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной (М±) и непараметрической статистики (критерий Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса, Уилкоксона) при уровне значимости р0,05.

Результаты При изучении соэкспрессии NSE и Pgp на нейронах контрольной группы не было обнаружено нейронов, экспрессирующих P-гликопротеин. Однако, при перинатальной гипоксии-ишемии головного мозга отмечалось наличие нейронов, экспрессирующих Pgp, в сравнении с контролем: уже через 4 часа с момента моделирования гипоксии-ишемии - 11%, через 12 часов – почти 20%, далее отмечалась «стабилизация» этих значений в пределах 20% (р0,05).

В контрольной группе количество астроцитов и эндотелиоцитов, экспрессирующих на своей поверхности белок лекарственной устойчивости было 2% 3% соответственно. После перенесенной перинатальной гипоксии-ишемии количество Pgp-иммунопозитивных астроцитов и клеток эндотелия существенно возросло, в сравнении с показателями контрольной группы: через 4 часа количество экспрессирующих Pgp-астроцитов увеличилось до 16%, эндотелиоцитов – до 9%, через 12 часов – около 17% астроцитов и 18% эндотелиоцитов, через 24 ч – 27% Pgp+ астроцитов и 20% эндотелиоцитов, через 72 ч – около 14% Pgp-экспрессирующих астроцитов и 21% эндотелиоцитов (р0,05).

Обсуждение Количество Pgp-позитивных эндотелиоцитов при развитии гипоксии-ишемии головного мозга достигло максимальных значений в пределах 12 часов и составляло 18-20%, оставаясь стабильно высоким и через 24-72 ч с момента развития ишемии. Процент Pgp-экспрессирующих астроцитов достиг максимальных значений значительно позже (через 24 ч) с момента развития перинатальной гипоксии-ишемии, а через 72 ч отмечалось снижение количества Pgp-позитивных астроцитов.

Можно предположить, что увеличение экспрессии белка лекарственной устойчивости имеет защитное значение и отмечается спустя некоторое время с момента развития перинатальной гипоксии-ишемии головного мозга. На фоне гипоксии-ишемии развивается повышенная устойчивость к ксенобиотикам и продуктам метаболизма, что имеет протективное значение для клеток головного Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" мозга (в особенности нейронов) в условиях кислородного голодания.

Наши данные представляют особенный интерес с точки зрения астроглиального контроля экспрессии Pgp на эдотелиоцитах.

Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о том, что астроциты могут играть роль в усилении экспрессии Pgp на эндотелиоцитах [5], однако в этом процессе могут участвовать не только активные формы кислорода, вырабатываемые астроцитами, но и экспрессия на их поверхности белка-транспортера Pgp.

Исследование выполнено при поддержке гранта Краевого государственного автономного учреждения «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности», дополнительное соглашение № 1/12 от «04»

июля 2012 г. к соглашению № 11 от 12 августа 2009 и грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-4818.2012.7 (2012 г.).

Литература 1. Putman M., van Veen H.W., Konings W.N. Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000;

64:

672–693.

2. Chan H.S., Grogan T.M., Haddad G. et al. P-glycoprotein expression:

Critical determinant in the response to osteosarcoma chemotherapy. J.

Natl. Cancer Inst. 1997;

89: 1706-1715.

3. Ronaldson P.T., Bendayan M., Gingras D. et al. Cellular localization and functional expression of P-glycoprotein in rat astrocyte cultures. J.

Neurochem. 2004;

3: 788-800.

4. Volka H.A., Burkhardtb K., Potschkaa H. et al. Neuronal expression of the drug efflux transporter P-glycoprotein in the rat hippocampus after limbic seizures. Neurosci. 2004;

123(3): 751-759.

5. Gaillard P.J., Van Der Sandt I.C., Voorwinden L.H. et al. Astrocytes increase the functional expression of P-glycoprotein in an in vitro model of the blood-brain barrier. Pharm. Res. 2000;

17(10): 1198-1205.

6. Kuhnke D., Jedlitschky G., Grube M. et al. MDR1-P-glycoprotein (ABCB1) mediates transport of Alzheimer's amyloid-ОІ peptides - Implications for the mechanisms of A clearance at the blood-brain barrier. Brain Pathol.

2007;

17(4): 347-353.

7. Salmina A.B., Inzhutova A.I., Malinovskaya N.A., Petrova M.M. Endothelial Dysfunctions end Repair in Alzheimer-Type Neurodegeneration: Neuronal and Glial Control. J. Alzheimers Dis. 2010;

22(1): 17-36.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ВЛИЯНИЕ МАСЛА ЧЕРНОГО ТМИНА, ШАЛФЕЯ И КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ TRICHODERMA НА ЖИЗНЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЫШЕЙ.

Мухаметзянова А.М.1,Эльшафей С.М.А. 2,Абдельрахман А.А. 2, Тухбатова Р.И.1, Иванова Е.В. 1, Акинина Е.А.1, Воронкова Ю.Е.1, Букуру Л.С.1, Алимова Ф.К.1, Фаттахова А.Н. Казанский (Приволжский) федеральный университет, институт фундаментальной медицины и биологии, кафедра биохимии, 2Факультет сельского хозяйства, Университет Минья, г.Эль-Минья, Египет alsoumsmail@mail.ru В настоящее время производство лекарственного растительного сырья культивируемых лекарственных растений значительно отстает в своем развитии от потребностей фармацевтической промышленности, здравоохранения и других социально ориентированных отраслей хозяйства [1]. Вместе с тем, устойчивая тенденция повышения спроса на растительное сырье и виды продукции из него обусловлена резким увеличением в последние годы числа потребителей, а также расширением ассортимента такого сырья [2].

В данной работе была проведена оценка влияния масла черного тмина, шалфея и культуральной жидкости T. harzianum 3 на жизненные показатели мышей и на рост опухолей, вызванных тетрахлорметаном у мышей CD-1 типа.

В ходе эксперимента было выявлено, что получавшие на первой неделе тетрахлорметан группы мышей резко набирали в весе, а с 8-х суток эксперимента так же быстро теряли в весе, что могло свидетельствовать о протекании патологического процесса у этих мышей.

Группы мышей, получавшие на первой неделе масло тмина и шалфея, плавно набирали вес в течение всего эксперимента даже после введения им тетрахлорметана. У мышей, получавших КЖ T. harzianum 3 в течение первой недели эксперимента, наблюдалось увеличение веса в ходе всего эксперимента, а также после начала приема тетрахлорметана. Вес мышей, получавших только масло тмина, масло шалфея и КЖ T.

harzianum 3, плавно увеличивался в течение всего эксперимента.

Продолжительность жизни мышей, получавших тетрахлорметан была ниже, чем у мышей получавших КЖ T. harzianum 3, масло тмина или шалфея. Мыши, получавшие после трихлорметана, масло тмина или Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" шалфея, а также КЖ T. harzianum 3, имели более высокую продолжительность жизни по сравнению продолжительностью жизни мышей, не получавших эти исследуемые вещества.Исходя из результатов работы, можно сделать выводы о том, что масло черного тмина и шалфея положительно или нейтрально влияет как на вес мышей, так и на продолжительность из жизни.

Литература 1. Терехин, А.А.Технология возделывания лекарственных растений / А.А.

Терехин, В.В.Вандышев // Учеб. пособие. –М.:РУДН, 2008. – 201 с.: ил.

2. Самылиной И.А. Лекарственные растения государственной фармакопеи.Фармакогнозия.ч.2.// И.А. Самылиной, В.А. Северцева.-М.:

Медицина.-2003.-536 с.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ Наумова А.И., Коновалова Е.В., Носарева О.Л., Веснина О.Н.

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск Naumova_Nastya09@mail.ru Актуальность. На сегодняшний день известно, что в патогенезе целого ряда социально-значимых заболеваний лежит дизрегуляция апоптоза наряду с окислительным стрессом. Для поиска молекулярных мишеней воздействия на редокс-статус с целью регулирования внутриклеточных процессов широко используются модели патологических процессов на клеточных системах in vitro.

Цель. Подобрать оптимальную концентрацию пероксида водорода в среде культивирования лимфоцитов крови для изучения особенностей метаболизма опухолевых клеток линии Jurkat.

Материалы и методы. В работе использовалась опухолевая клеточная линия Jurkat и выделенные из крови здоровых доноров лимфоциты. Культивирование опухолевых клеток линии Jurkat проводили суспензионным методом в полной питательной среде при температуре 37°С и 5% СО2. Выделение лимфоцитов проводили из мононуклеарных лейкоцитов, полученных методом градиентного центрифугирования в стерильных условиях на градиенте плотности ficollpaque, а затем на градиенте Перколла. Содержание восстановленного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG) определяли методом, предложенным M.E. Anderson (1985) в модификации Kojima S. et al. (2004). Расчет содержания общего и окисленного глутатиона производили с помощью калибровочных графиков. Дополнительно рассчитывали величину отношения GSH/GSSG, как маркера окислительного стресса.

Определение концентрации внутриклеточных АФК проводили с помощью дихлорфлюоресцеина диацетата методом проточной цитофлуориметрии.

Содержание белка в клетках определяли методом Бредфорда.

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программы Statistica 6.0. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Шапиро-Уилки. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Статистически значимыми считались различия при р0,05.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Результаты Параметры системы глутатиона, концентрация активных форм кислорода (Me (Q1-Q3)) в лимфоцитах крови при различных условиях культивирования и опухолевых клетках линии Jurkat Конечная концентрация Н2О2 в культуральной среде Клеточная лимфоцитов крови линия Jurkat 0,3 мМ 0,5 мМ 1 мМ 2 мМ GSH 1, нмоль/ 1,91 2,08 2,08 2, (1,64-1,83) мг (1,89-1,92) (1,5-2,16) (1,91-3,19) (1,93-2,31) р0, белка GSSG 0, нмоль/ 0,17 0,14 0,25 0, (0,139-0,142) мг (0,14-0,17) (0,11-0,14) (0,167-0,306) (0,15-0,19) р0, белка 17,48 7, GSH/ 13,5 12,46 13, (14,96-22,95) (5,36-10,96) GSSG (13,45-13,81) (10,71-12,78) (11,36-14,23) р0,05 р0, 0, АФК 0,45 0,71 1,56 1, (0,78-1,23) у.е. (0,34-0,65) (0,57-1,92) (1,43-1,89) (0,99-1,91) р0, Примечание: р – уровень значимости различий по сравнению с лимфоцитами крови.

Вывод. На основании отсутствия достоверно значимых различий по изучаемым параметрам между культурой опухолевых клеток линии Jurkat и лимфоцитов крови, для создания экспериментальной модели окислительного стресса in vitro можно использовать пероксид водорода в конечной концентрации 0,5 мМ. Исследование выполнено при финансовой поддержке ГК №16.512.11.2282 от 27.02.2012.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМИТИРУЮЩЕЙ СТАДИИ ПРОЦЕССОВ, ПРОТЕКАЮЩИХ НА МИКРОБНОМ АНОДЕ БИОТОПЛИВНОГО ЭЛЕМЕНТА Нгуен В.Т., Алферов В.А.

Тульский государственный университет lgkk1985@yahoo.com Для разработки биотопливных элементов (БТЭ), работающих в проточном режиме, биокатализатор должен быть иммобилизован на поверхности электрода во избежание потери биокатализатора. В макете БТЭ использовали уксуснокислые бактерии Glucnobacter oxydans в качестве биокатализатора, поливиниловый спирт, модифицированный N-винилпирролидоном, в качестве матрицы для иммобилизации, 2,6-дихлорфенолиндофенол в качестве медиатора, переносящего электронов на электрод, и этанол как субстрат биоокисления.

Для описания кинетических закономерностей на аноде применяли модель, учитывающей различные стадии: перенос субстрата и медиатора через слой полимера, их взаимодействие с ферментными системами бактериальных клеток, регенерацию фермента и медиатора.

Для определения лимитирующей стадии при взаимодействии субстрата с иммобилизованными бактериальными клетками была использована математическая модель ферментного электрода, приводящая в конечном итоге к выражению, аналогичному уравнению Хэйнеса.

Первый этап для нахождения лимитирующей стадии процессов, протекающих на микробном электроде, заключается в регистрации зависимости силы стационарного тока (I), проходящего через микробный электрод, от концентрации этанола (S) при постоянном потенциала электрода и в присутствии медиатора. Далее определили k ME по графику зависимости S/j от S. Затем вводятся параметры r и y, которые не имеют конкретного физического смысла, но позволяют представить экспериментальные данные в удобном для анализа виде. Характеру участков графика зависимости r от y определили области концентрации этанола, при которых лимитирующей является диффузия или ферментативная реакция.

Установлено, что в диапазоне концентраций этанола 0,25 – 8,0 мМ график зависимость у от r носит характер прямой, практически Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" параллельной оси. Согласно применяемой модели, в таком скорость общего процесса лимитируется ферментативной реакцией. В диапазоне концентраций этанола 0,015 – 0,12 мМ прямая зависимости у от r отсекает на оси абсцисс отрезок равный 1,1. Поэтому в данном диапазоне концентраций субстрата скорость общего процесса практически лимитируется диффузией субстрата к биокатализатору.

Рис. 1. Зависимость y от r для анода с иммобилизованными клетками Литература 1. Albery W.J., Bartlett P.N. Amperometric enzyme electrodes. Part 1. Theory.

J. Electroanal. Chem. 1985. V. 194. P. 211- Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА.

Орлова Н.А., Ковнир С.В., Воробьев И. И.

Центр "Биоинженерия" РАН nobiol@gmail.com Фактор свертывания крови VIII человека является основным лекарственным средством при лечении гемофилии A. Функционально фактор свертывания крови VIII представляет собой кофактор сериновой протеазы - фактора IXa, которая осуществляет превращение актора X в фактор Xa (активированный) на поверхности мембраны клеток. Природный фактор VIII человека гликопротеин с молекулярной массой 170–280 кДа, обнаруживаемый в кровотоке преимущественно в форме нековалентного комплекса с фактором Виллебранда (vWF). Рекомбинантный фактор VIII, продуцируемый в гетерологичных системах на основе клеток млекопитающих, например, в клетках линий СНО или ВНК, эквивалентен природному фактору VIII плазмы крови и широко используется в клинической практике.

Основной проблемой получения фактора VIII в гетерологичных системах является низкий уровень экспрессии, обусловленный большим размером и сложным набором посттрансляционных модификаций целевого белка. Показано сохранение функциональных свойств фактора VIII при удалении составляющего значительную часть молекулы фактора VIII домена B [1]. Замена домена B коротким линкером приводит к существенному повышению продукции фактора VIII в клетках CHO [2], а препарат фактора VIII на основе данного делеционного варианта (BDD-FVIII) допущен к медицинскому применению;

показатели его эффективности и безопасности сопоставимы с показателями препаратов полноразмерного фактора VIII [3].

Нами проводилась экспрессия рекомбинантного фактора VIII человека в клетках CHO с использованием различных экспрессионных векторов, и был выбран подход, позволяющий получить промышленно-пригодного продуцента.

Широко используемый промотор цитомегаловируса (CMV) обеспечивает высокий уровень транскрипции, но подвержен инактивации (метилированию), его эффективность зависит также от контекста точки интеграции. На основе системы несущей CMV прмотор, Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" нами были получены пулы клеток CHO, секретирующих полноразмерный фактор VIII, на уровне не превышающем 10 МЕ/л. Для делеционного варианта фактора VIII был получен пул с уровнем секреции BDD-FVIII ± 10 МЕ/л, на основе которого были после амплификации получена клональная линия клеток, секретирующая делеционный вариант фактора VIII с продуктивностью около 0,5 МЕ/мл [4].

Для получения более продуктивных линий-продуцентов фактора VIII была создана система экспрессии на основе основе конститутивного аутологичного промотора и элементов, обеспечивающих транскрипционную активность кассеты в геноме. Известно, что для клеток CHO наилучшие результаты в данной области фиксируют для нетранслируемых областей гена фактора элонгации трансляции 1 альфа.

В силу того, что получение областей фланкирующих ген фактора элонгации трансляции 1 альфа (длина каждой области порядка 5 т.п.о.) методом прямого ПЦР с геномной ДНК, выделенной из клеток CHO не увенчалось успехом, была разработана стратегия модульной сборки этих областей из фрагментов, соединяющихся друг с другом по гибридным рестриктным сайтам (рисунок 1). 5’-фланкирующий фрагмент был разделен на 5 модулей, а 3’--фланкирующий фрагмент был разделен на модулей. Небольшая длина модулей (0.8 т.п.о.) позволяла определять нуклеотидную последовательность фрагментов до их сборки, то есть быстро и экономично получить полностью корректную последовательность целевых геномных участков [5]. Разработанная в ходе решения этой задачи программа BIOF для разбиения геномных последовательностей на модули, содержщие гибридные рестриктные сайты, распространяется на условиях лицензии GNU GPL, программа и ее исходный код доступен по адресу http://sourceforge.net/projects/biof/ .

Ограничением векторов несущих подобные нетранслируемыме области - низкая эффективность трансфекции и низкая частота амплификации целевого гена в геноме, вызванная большим размером генетической кассеты и возможностью независимой амплификации гена селекционного маркера. При разработке экспрессионного вектора были предприняты шаги по уменьшению возможного влияния этих факторов.

Для уменьшения размера генетической кассеты – создана минимальная плазмида (бэкбон), на основе которой собирался экспрессионный вектор.

Для увеличения вероятности интеграции и частоты амплификации в вектор был введен конкатемер терминальных повторов вируса Эпштейна-Барр (рисунки 2 и 3).

Использование созданного экспрессионного вектора позволило получить без многостадийной амплификации трансгена клональную Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" линию CHO - продуцент фактора VIII с максимальной продуктивностью 25 МЕ/мл при плотности культуры 2 млн клт/мл, что сопоставимо или превосходит типичные показатели для промышленных продуцентов фактора VIII.

Рис. 1.

Схема модульной сборки фрагментов экспрессионного вектора Рис. 2.

Карта экспрессионного вектора на основе основе конститутивного аутологичного промотора и элементов, обеспечивающих транскрипционную активность кассеты в геноме Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Рис. 3. Принцип метода модульной сборки. Мутации или неизвестные нуклеотиды обозначены звездочками, верифицированные последовательности ДНК обозначены зеленым. Праймеры для секвенирования обозначены стрелками. Адаптированно из [5].

Литература 1. Pittman D.D., Alderman E.M., Tomkinson K.N., Wang J.H., Giles A.R., Kaufman R.J. // Blood. 1993. V. 81. № 11. p. 2925–2935.

2. Lind P., Larsson K., Spira J., Sydow-Backman M., Almstedt A., Gray E., Sandberg H. // Eur. J. Biochem. 1995. V. 232. № 1. p. 19– 3. Kessler C.M., Gill J.C., White G.C., Shapiro A., Arkin S., Roth D.A., Meng X., Lusher J. M. // Haemophilia. 2005. V. 11. № 2. p. 84– 4. Orlova NA, Kovnir SV, Vorobiev II, Yuriev AS, Gabibov AG, Vorobiev AI.// Acta Naturae V. 4 № 1 (12) 2012. p. 93- 5. Orlova NA, Orlov AV, Vorobiev II. A modular assembly cloning technique (aided by the BIOF software tool) for seamless and error-free assembly of long DNA fragments. // BMC Research Notes 2012, 5:303.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" СОДЕРЖАНИЕ ТБК-АКТИВНЫХ ПРОДУКТОВ И АНТИОКСИДАНТНЫЕ ФЕРМЕНТЫ В НАЗАЛЬНОМ СМЫВЕ У НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ Павлов В. С., Степанова Е. А., Гулая В. С.

Сибирский Государственный Медицинский Университет falling-shove@mail.ru В настоящее время имеются данные о важной патогенетической роли перекисного окисления липидов (ПОЛ) в инициации и развитии многих заболеваний. Его усиление вызывает окислительный стресс [1,2,3]. Этот процесс активно изучается в различных биологических средах.

Перспективным может быть изучение назального смыва, как материала неинвазивной диагностики.

Цель работы заключалась в изучении показателей ПОЛ в назальном смыве 26 новорожденных доношенных, практически здоровых, детей. Для получения назального смыва в носовой ход помещали на мин ватный тампон, который потом промывали 1 мл физ. раствора. В надосадке после центрифугирования, определяли содержание ТБК-активных продуктов (малонового диальдегида - МДА), активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и содержание белка.

Установлено, что содержание ТБК-активных продуктов в назальном смыве находится в широком диапазоне: от 1,35 мкмоль/л до 15, мкмоль/л, среднее значение 7,60 мкмоль/л. Все результаты поделены на три группы: низкие, средние, высокие значения исследуемых показателей. В группу с низкими показателями МДА попало новорожденных детей, а в группы со средними и высокими значениями МДА – 16 и 3 соответственно.

Активность СОД в назальном смыве находится в широком диапазоне:

от 0,027 Ед/мл до 4,139 Ед/мл, среднее значение 0,54 Ед/мл. У новорожденных детей активность СОД находилась в пределах средних значений, у 6 детей активность фермента была высокой (увеличение в раз), а у 5 – очень высокой (увеличение в 41 раз). Активность СОД в пересчёте на 0,1 мг белка варьировала в диапазоне от 0,041 до 4, Е/0,1 мг белка. При пересчёте на белок, количество результатов в каждой из групп не изменялось.

Активность каталазы в назальном смыве находится в широком диапазоне: от 0,04 мккат/мин*л до 5,33 мккат/мин*л. Среднее значение Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" 2,62 мккат/мин*мл. Все результаты были поделены на три группы:

низкие, средние и высокие значения. В группу с низкими значениями каталазы попало 6 результатов, а в группы со средними и высокими значениями каталазы - по 10 результатов. Активность каталазы в пересчёте на 0,1 мг белка изменялась в диапазоне от 0,005 до 4,960 Е/0, мг белка. При пересчёте на белок, количество результатов в каждой из групп не изменялось.

У 25 детей ПОЛ находилось под контролем системы антиоксидантов.

У одного ребёнка обнаружено высокое содержание ТБК-активных продуктов на фоне снижения активности каталазы и средних значений СОД. Рекомендовано наблюдение за состоянием ребенка с мониторингом состояния ПОЛ.

Широкий диапазон показателей ПОЛ назального смыва может быть связан с биологической вариацией: строение дыхательной сисетмы новорожденных, наличие «носового цикла», гигиена носовых ходов и т.п.

Учитывая всё вышесказанное, исследование показателей ПОЛ в назальном смыве можно использовать для выявления ЛОР-заболеваний.

Выявление повышенного содержания МДА, снижения активности СОД и каталазы в назальном смыве может быть дополнительным критерием оценки состояния новорожденных детей.

Литература 1. Биохимия / Е. С. Северин. - 2-е изд., М. : ГЭОТАР-МЕД (Серия ""XXI век""), 2004 – 784 с.

2. Интернет ресурс: http://abstractsgamma.com/ 3. Интернет-ресурс: http://medbiol.ru/ Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ У БЕРЕМЕННЫХ С ФПН И ПРЕЭКЛАМПСИЕЙ Павлова Г.А., Сунгатуллина Л.М., Ковалева Ю.А., Кравцова О.А.

Казанский (Приволжский) Федеральный Университет, Клиника "АВА-Казань" gerapavlova@gmail.com Введение. Наиболее распространенными осложнениями беременности являются преэклампсия и фетоплацентарная недостаточность (ФПН), частота которых из года в год увеличивается и достигает 16-21%. Важную роль в развитии этих патологий играют нарушения цитокинового баланса. В связи с вышеизложенным, целью данного исследования явилось выявление ассоциации полиморфизма +3247 A/G гена ИЛ-6, -590 С/Т гена ИЛ-4, +3953 С/Т гена ИЛ-1 с развитием ФПН и преэклампсии.

Материалы и методы. Генотипирование полиморфизмов проводили методом SSP-PCR у 162 беременных (34 женщины с ФПН, 21беременная с гестозом и 107 женщин с физиологическим течением беременности).

Результаты и выводы. Анализ результатов показал, что частоты генотипов полиморфизмов +3247 A/G гена ИЛ-6 и -590 С/Т гена ИЛ- статистически доcтоверно не различаются в группах больных ФПН, преэклампсией и здоровых лиц. При анализе частот генотипов полиморфного локуса +3953 С/Т гена ИЛ-1 в группе больных ФПН обнаружено достоверное повышение доли гетерозиготного генотипа (OR=3,18) на фоне достоверного снижения гомозиготного генотипа СС (OR=0,48). Таким образом, генотип СТ ассоциирован с риском развития ФПН, тогда как носительство генотипа СС локуса +3953 С/Т гена ИЛ- носит протективный характер.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА КОМПОЗИТОВ НА ОСНОВЕ КРЕМНЕЗЕМА, ПОЛИМЕРНОГО КОМПЛЕКСА И ХОЛИНЭСТЕРАЗ Паентко В.В., Матрунчик Ю.В., Матковский А.К., Зуб Ю.Л.

Институт химии поверхности имени А.А. Чуйка НАНУ, Институт общей и неорганической химии Национальной академии наук Беларуси payentko@mail.ru Несмотря на широкое применение иммобилизованных ферментативных препаратов в медицинской практике и биохимическом анализе, интерес к созданию новых систем и поиск к улучшению уже существующих для решения конкретныхпрактических задач, по-прежнему существует[1]. Это связано снеобходимостью получения препаратов, обладающих высокой активностью, пролонгированным действием и невысокой ценой.В настоящей работе представлены разработанные авторами композиционные материалы на основе различных форм кремнезема, полимерной оболочки (сшитый полимер на основе поливинилового спирта и полиакриловой кислоты), так называемый гидроаккомулирующий комплекс и холинэстераз (ХЭ) разного происхождения. В работе использовались два типа кремнезема: а) полученный золь-гель методом на основе метасиликата натрия при рН=6,которое соответствуетмаксимальной активности ХЭ;

б)высокодисперсный кремнезем А300. Идея состояла во включении ферментативного препарата в полимерную оболочку, которая создавала условия, близкие к invivo,с последующим введением в кремнеземную матрицу. Кремнеземная матрица создает дополнительную защиту полимерной оболочке, которая является бактерициднонеустойчивой, а также повышает механическую прочность и улучшает эксплуатационные свойства. При получении композитов в реакционную смесь вводили гомогенат печени курицы домашней Gallus gallus,а также раствор АХЕ электрического органа электрического угря(Acetylcholinesterase from Electroporus electricum (electric eel)).

Установлена активность холинэстераз различногопроисхождения как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии. Показано, что пористость неорганического носителяоказывает значительное влияние на транспорт субстрата кактивному центру ХЭ. Так, в случае Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" использования пористойкремнеземной оболочки, полученной золь-гель методом,наблюдается более низкое значение активности фермента посравнению с непористой на основе А300. Однако в первом случае происходит более длительное сохранение активности, что можетбыть связано с лучшей защитой ферментного препарата отбактерицидного воздействия. Благодаря всему перечисленному, полученные материалы являются удобной формой для практического применения.

Литература 1. Тертых В.А., Янишпольский В.В. Иммобилизированные на кремнеземах ферменты и их применение // Медицинская химия и клиническое применение диоксида кремния/ под ред. акад. НАН Украины А.А. Чуйко. - Киев: Наук. думка, 2003.-416с.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" СИНТЕЗ И ОПТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОМПОЗИТНЫХ МАТЕРИАЛОВ, СОСТОЯЩИХ ИЗ ПОЛИ (N-ИЗОПРОПИЛАКРИЛАМИДНОГО) ГЕЛЯ И СЕРЕБРЯНЫХ НАНОЧАСТИЦ Панфилова Е.В., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г.

ФГБУ науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратовский государственный университет eliza_panfilova@mail.ru Синтезированы композитные наночастицы, представляющие собой полимерные гели, содержащие серебряные наночастицы. Протокол синтеза состоит из двух основных этапов. На первом, путем полимеризации N-изопропилакриламида, получают монодисперсные наночастицы гидрогеля с контролируемым диаметром около 500 нм.

Далее производится восстановление ионов серебра на поверхности полимерной сетки. Варьирование соотношения концентрации восстановителей и нитрата серебра позволяет получить серебряные наночастицы с размером в диапазоне 10-30 нм с различной плотностью упаковки частиц на поверхности геля. Полученные нанокомпозиты исследованы методами просвечивающей электронной микроскопии, спектрофотометрии и динамического светорассеяния. В зависимости от размера и плотности упаковки серебряных наночастиц на поверхности полимерной частицы нанокомпозиты имеют плазмонный резонанс в диапазоне 420-750 нм, который определяет цветовые изменения коллоида от желтого, оранжевого, красного до синего и сине-зеленого.

Композитные наногели, после включения серебряных наночастиц, сохраняют термочувствительный фазовый переход с нижней критической температурой смешения 31°С.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" СА2+-ЗАВИСИМОСТЬ УРОВНЯ ТИРОЗИНОВОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ РАСТЕНИЙ В РАННИХ ОТВЕТНЫХ РЕАКЦИЯХ НА СТРЕСС Петрова Н.В.,Каримова Ф.Г.

ФГБУН КИББ КазНЦ РАН npetrova@inbox.ru В литературе накоплены данные, что ионы Са 2 + в качестве вторичного посредника принимают участие в каждой из известных у растений систем сигнальной трансдукции (1). Кальций является эффективным регулятором метаболических процессов во всех клетках, где существуют системы, реагирующие на небольшие изменения его концентрации. Основные внутриклеточные мишени для ионов Са2+ – различные кальций-связывающие белки, одни из которых сами меняют свою активность, а другие опосредуют эффект этого иона на различные молекулярные мишени. Т.о. специфичность Са 2 + -сигналинга определяется наличием определенных мишеней, что является характерным свойством вторичного посредника.

Несмотря на давние исследования только в последние годы стали появляться данные о молекулярных механизмах действия Са2+ на такую важную часть сигнального каскада как фосфорилирование белков. И эти данные касаются в основном действия Са2+ на ферменты, регулирующие ser\threo фосфорилирование. Это кальций зависимые протеинкиназы (CDPK), кальций-кальмодулинзависимые киназы, фосфатаза cdc2. Что касается тирозинового фосфорилирования, в настоящее время имеются данные только об опосредованной регуляции кальцием этих процессов. И происходит это в том числе и за счет редокс-регуляции, модулируемой кальцием. Под действием ионов Са 2 + происходит активация НАДФН-оксидазы, стартового фермента супероксидсинтазной сигнальной системы. Субъединица 91 кДа НАДФН-оксидазы имеет два Са2+-связывающих участка. Данных о наличии прямых Са2+-связывающих участков у компонентов тирозинкиназного каскада в литературе пока нет. А вот механизм редокс-регуляции тирозиновых фосфатаз (ТФ) охарактеризован достаточно хорошо. В том числе показана редокс-зависимость тирозинфосфатазы растений. В активном сайте тирозинфосфатаз имеется цистеин, тиоловая группа которого подвергается окислению активными формами кислорода (АФК), Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" генерируемыми при стрессе. Остатки цистеина активного сайта тирозинфосфатаз имеют низкие значения рКа и существенная тиоловая группа может быть окислена и при физиологическом значении рН, что влечет ингибирование активности ТФ. Показано, что каталитический домен тирозинфосфатаз высококонсервативен и для растений.

Тирозиновое фосфорилирование представляет для исследователей сигнальных систем особый интерес, поскольку оно имеет ряд отличительных особенностей, позволяющих ему динамично регулировать сигнальные события в клетке. Доля фосфотирозиновых белков в общем количестве фосфобелков невелика (4,3 %), однако тирозиновое фосфорилирование является преимущественным механизмом передачи сигнала об изменении внешних условий через мембрану в клетки. Уникальность тирозинового фосфорилирования заключается в том, что активность тирозинфосфатаз в 10 раз выше активности тирозинкиназ.

Исследование Са2+-зависимости фосфорилирования белков проводили двумя методами: с использованием растений, выращенных выращенных на среде с отсутствием ионов Са2+, в которой Са2+ был заменен на натрий согласно ионной силе (у 7-ми дневных растений гороха Са 2+-дефицит составлял 30-40%).

А для изучения вклада экстраклеточного Са 2 + в изменение фосфорилирования белков проводили обработку растений, выращенных на оптимальной среде, высокоспецифичным хелатором Са 2+ ЭГТА, который связывая внешний кальций приводит к выключению экстраклеточного кальциевого сигналинга. По литературным данным известно, что ЭГТА не проникает в клетку (2).

Проводили определение общей фосфатазной активности с использованием р-нитрофенилфосфата в качестве субстрата. Измерения проводили при двух значениях рН, поскольку по литературным данным известно, что тирозиновая фосфатаза гороха при изучении in vitro имеет 2 оптимума рН 5.5 и 7 (3). Таким образом, мы хотели добиться, чтобы в наблюдаемые значения фосфатазной активности больший вклад вносили тирозиновые фосфатазы. Кроме того, для вычленения вклада тирозинфосфатазной активности в наблюдаемых значениях использовали специфический ингибитор тирозиновых фосфатаз ортованадат натрия (в концентрации 10 -4 М). Ванадат ингибирует тирозиновые фосфатазы различных семейств, однако серин/треониновые фосфатазы нечувствительны к ванадату (4). Механизм действия ванадата определяется его стереохимической комплементарностью к фосфат-связывающему сайту фермента, этим определяется Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" невозможность функционирования каталитического цистеина в качестве акцептора фосфата на первой ступени тирозинфосфатазной активности.

Изменение фосфатазной активности на исследуемых временных точках действия механического стресса при обоих значениях рН имеет схожую тенденцию.

За 5 мин действия механического стресса наблюдается более низкая фосфатазная активность в варианте с обработкой ЭГТА. Можно предположить, что ингибирование связано с окислением активного центра пероксидом водорода, генерированным НАДФН-оксидазой, причем в ее активацию вносят вклад внутриклеточные источники Са2+, поскольку его внеклеточное поступление в данном случае заблокировано. За 10 мин действия механического стресса картина примерно та же, что и за 5 мин. За 20 мин действия механического стресса уровень фосфатазной активности в варианте, обработанном ЭГТА повышается, что может говорить о том, что пул внутриклеточного кальция постепенно истощается, снимается активация НАДФН-оксидазы и фосфатазная активность постепенно восстанавливается. За 30 мин действия механического стресса наблюдается некоторое ингибирование фосфатазной активности у Са2+дефицитных растений, возможно на этом этапе происходит выход Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо.

С использованием двумерного электрофореза с последующим иммуноблоттингом нами были получены данные о Са 2+-зависимости изменений уровня тирозинового фосфорилирования белков корней гороха при 10 мин действии механического стресса. Оказалось, что при Са 2+ -дефиците у большинства белков наблюдается более высокий уровень тирозинового фосфорилирования в сравнении с растениями, выросшими на оптимальной среде.

Литература 1. Медведев С.С., Маркова И.В. Роль ионов Са2+ в передаче сигналов в клетках растений // Вестник Нижегородского университета им. Н.И.

Лобачевского. – 2001. – с. 20-25.

2. Колупаев Ю.Е. Кальций и стрессовые реакции растений // Вестник Харьковского национального аграрного университета. – 2007. – с.

24-41.

3. Guo Y.L., Roux S.J. Partial purification and characterization of an enzyme from pea nuclei with protein tyrosine phosphatase activity // Plant Physiol.

– 1995. – V. 107. – p. 167-175.

4. Huyer et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272. – p. 843-851.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА БЕШЕНСТВА Петрова Т. П.

ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань, Республика Татарстан pettatiana2@gmail.com В настоящее время бешенство представляет угрозу для человечества во многих странах мира и представляет собой серьезную проблему ветеринарии и медицины [1,3,4]. Эпизоотическая ситуация по заболеваемости бешенством животных в Российской Федерации (РФ) продолжает оставаться неблагополучной, не имеющей тенденции к стабилизации. Ежегодно регистрируются до 20 и более случаев заболевания бешенством среди людей. Бешенство – смертельное заболевание. Лечебных препаратов от бешенства не существует, предупреждают заболевание с помощью профилактических средств антирабических вакцин и антирабического глобулина. В очагах инфекции необходимо проводить постоянный контроль за ситуацией по заболеваемости бешенством, а также эффективности профилактических мероприятий [2].

Целью исследований явилось изготовление иммунохимических препаратов для проведения иммунологического мониторинга и контроля эффективности вакцинопрофилактики бешенства в дикой фауне на территории Калининградской области.

В работе использовали 5 овец, 300 беспородных белых мышей;

производственный штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства;

культуральные, вирусологические, серологические методы исследования, иммуноферментный и иммунофлуоресцентный анализы, а также люминесцентную микроскопию. Исследовали 33 пробы головного мозга лисиц, енотовидных собак, барсука, белки, собак и кошек, добытых в очагах бешенства для исследования на бешенство, а также 500 проб головного мозга, 500 проб сывороток крови и 500 проб костной ткани лисиц и енотовидных собак, отстрелянных на территории проведения вакцинации в 2011 и 2012 гг. Калининградской области с применением иммунохимических биопрепаратов.

Схема технологии изготовления иммунохимических препаратов включала: получение иммунизирующего антигена вируса бешенства, иммунизацию овец для получения диагностических сывороток, Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" выделение иммуноглобулина класса G, конъюгирование его флуоресцеинизотиоционатом и пероксидазой из корней хрена, контроль активности и специфичности, расфасовка в ампулы, лиофилизация и этикетирование. Всего изготовлено по указанной схеме 500 Наборов препаратов для иммунологического мониторинга и контроля вакцинопрофилактики бешенства, разработанных в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

В результате иммунологического мониторинга бешенства на территории Калининградской области выявлено 14 неблагополучных по заболеваемости бешенством районов, 5 городов, а также 210 случаев бешенства среди сельскохозяйственных, домашних и диких животных.

Основным источником и распространителем бешенства в Калининградской области являются лисицы, на долю которых среди заболевших диких животных приходится 93,8%. Бешеные лисицы, теряют страх перед людьми, Отмечены случаи, когда бешеные лисицы набрасывались с укусами на мотоцикл, грызли дерево, на которое забрался испуганный человек. Опасна лисица даже в стадии параличей, когда кусает человека, пытающегося оказать помощь больному животному. Необходимо отметить также, что собаки и кошки, также представляют угрозу заболеваемости животных и людей.

Эффективным методом борьбы с природным бешенством является оральная иммунизация диких животных, отвечающая интересам охраны природы [2]. Оральная вакцинация против бешенства восприимчивых животных делает их невосприимчивыми к бешенству, дает долгосрочный эффект и является гуманной мерой [2]. Оральная вакцинация диких плотоядных животных на территории Калининградской области проводится ежегодно, начиная с 2007 года, с использованием отечественной антирабической вакцины «Оралрабивак» из штамма «РБ-97», производства ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Распределение вакцины осуществляется с самолетов Синтал-2. В 2007-2009 гг. вакцинация проводилась однократно, а с 2010 г. - дважды в год, весной и осенью. Анализом эффективности мероприятий по оральной вакцинации диких плотоядных животных на территории Калининградской области установлено снижение заболеваемости бешенством к 2011 г.( сл.) по сравнению с 2006 г. (46 сл.) в 2,2 раза;

поедаемость приманок лисицами составила – 67,2%, уровень сероконверсии (количество животных с защитным уровнем вируснейтрализующих антител) – 67,1%;

поедаемость приманок енотовидными собаками составила 58,8%, уровень сероконверсии – 44,0%. Оральную вакцинацию диких плотоядных рекомендуем проводить в сочетании с регулированием их численности до 0,1- 0,2 гол. на 1 км2 в районах, где этот показатель выше.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Изучением патогенных и некоторых антигенных свойств изолятов, циркулирующих на территории Калининградской области установлена их патогенности при внутримозговом и подкожном заражении лабораторных белых мышей. Изучаемые изоляты вируса бешенства обладали преципитирующими и комплементсвязывающими свойствами с активностью в РДП и РДСК 1:8-1:16 и выделялись в культуре клеток НГУК-1 без проявления цитопатического действия. Кроме того, изучаемые изоляты вируса бешенства нейтрализовались сыворотками, полученными на вакцинные штаммы вируса бешенства, что свидетельствует об антигенном соответствии эпизоотических изолятов вируса бешенства вакцинным штаммам вируса бешенства и это имеет важное значение при проведении профилактических мероприятий и диагностических исследований в данном регионе.

В заключение хотелось бы отметить, что аналогичные исследования необходимо проводить и в Республике Татарстан (РТ), где ситуация по заболеваемости бешенством также неблагополучна. Так, только за текущий год зарегистрировано 196 случаев бешенства в административных районах, в том числе и г.Казани, где отмечено случаев среди собак и 2 случая среди лисиц и была оказана антирабическая помощь 3922 пострадавшим от укусов животных. Кроме того, из-за финансовых и организационных трудностей в РТ оральная вакцинация дикой фауны была приостановлена и за последние годы не проводилась.

Литература 1. Гулюкин М.И., Ведерников В.В. Ситуация уже кризисная // Ветеринарная жизнь. 2008. №12. С.6-8.

2. Иванов А.В., Хисматуллина Н.А., Чернов А.Н., Гулюкин А.М. Бешенство:

этиология, эпизоотология, диагностика: учебно-методическое пособие в иллюстрациях.- М.: Колос, 2010. 54 с.

3. Селюк В.Н., Груничева Т.П., Черкес Н.Н., Кандудин А.Г. Современная характеристика бешенства в Калининградской области// Нейроинфекция: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, крейтцфельдта-Якоба и другие прионные болезни;

листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: матер. Межд. науч.- практич. конф. - Покров:

ВНИИВВиМ. 2001. С.19-21.

4. Хисматуллина Н.А., Гулюкин А.М., Кулакова С.Р., Амирова И.В.

Совершенствование мер борьбы с бешенством в Смоленской области // Ветеринария. №4. 2011. С.24-27.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" РОЛЬ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА TGF-B В РАЗВИТИИ СПАЕЧНОГО ПРОЦЕССА ПРИ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ Печальнова С. А., Захарова П. А.

ГБОУ ВПО СИБГМУ Минздрава РФ apatiyatomsk@ya.ru Как течение генитального эндометриоза, так и его хирургическое лечение практически в каждом случае связано со спаечным процессом различной локализации и плотности. Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-) является ключевым медиатором фиброгенеза, с чем связывают возможную роль данного цитокина в патогенезе эндометриоза и сопутствующего ему спаечного процесса.

Целью работы было провести анализ распределения аллельных вариантов гена TGFB и обнаружить их ассоциацию с уровнем продукции соответствующего цитокина (TGF-) в патогенезе эндометриоза и спаечного процесса.

Материал и методы исследования. В программу исследования были включены 135 пациенток репродуктивного возраста от 19 до 43 лет (средний возраст 30,6±1,2 года). Основную группу составили женщины с генитальным эндометриозом. В группу сравнения вошли женщины, у которых при проведении эндоскопического исследования был исключен генитальный эндометриоз. Выделенную из периферической крови ДНК с использованием аллель-специфической полимеразной цепной реакции. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI.

Содержание TGF- в сыворотке крови оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.

У пациенток с генитальным эндометриозом содержание TGF- в крови (7120 пг/мл) значимо превышало таковое у женщин без данной патологии (4087 пг/мл, p0,05). Иммуногенетическое исследование показало, что среди пациенток с эндометриозом статистически значимо преобладали гомозиготы с генотипом ТТ полиморфизма C-509T гена TGFB (55% против 35% у женщин без эндометриоза), а реже встречались носительницы генотипа СС (33% против 49% у женщин без данной патологии). Анализ распределения аллелей позволил установить, что среди больных эндометриозом достоверно преобладал аллель Т (2=8,03, p0,005) полиморфизма C-509T гена TGFB.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Генотипирование образцов ДНК по гену TGFBC-509T у больных эндометриозом показало, что частота встречаемости генотипа ТТ у пациенток с выраженным спаечным процессом III-IV степени (47%) статистически значимо превышала таковую у женщин со спаечным процессом органов малого таза I-II cтепени (28 %).

Установлено, что ген TGF индуцирует увеличение экспрессии мРНК для цепей коллагена в клетках человека. TGF- может влиять на метаболизм белков матрикса как непосредственно, так и опосредованно, через синтез других регуляторных молекул. Таким образом, благодаря своей полифункциональности, TGF- играет важную роль в фиброгенезе при генитальном эндометриозе.

Таким образом, течение генитального эндометриоза сопровождается повышением содержания TGF- в крови. Риск подверженности генитальному эндометриозу с выраженным спаечным процессом ассоциирован с аллелем Т и генотипом ТТ локуса C-509T гена TGFB.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ В ДЕТСКИХ КАШАХ Погосян Г.П.,Урицкая А.Н.,Коновалова А.А.

Карагандинский государственный университет им. академика Е.А. Букетова gayane_63@mail.ru Определение генетически модифицированных организмов в продуктах детского питания является актуальной проблемой во всем мире, и в Республике Казахстан, в частности /1/. Использование каш в качестве продуктов первой необходимости для детей в возрасте от шести месяцев требует тщательного их исследования и контроля. Потребность в этих продуктах обусловлена наличием в них минеральных компонентов, белков, углеводов и других питательных веществ. Исследования, проводимые в последние годы по выявлению негативного влияния ГМО на здоровье человека, достоверно не доказывают и не опровергают это влияние. В некоторых публикациях отмечается возможность мутагенного и канцерогенного воздействия ГМО /2,3/. Анализ этих данных требует тщательного исследования в первую очередь продуктов детского питания для ограничения этого воздействия на растущий детский организм.

4 мая 2010 года в РК был принят закон «О защите прав потребителей», который обязывает производителей маркировать продукты, содержащие 0,9% и более ГМО /4/. Однако подавляющее большинство продуктов, имеющихся в продаже, не имеют никакой маркировки, что подтверждает необходимость настоящего исследования.

Для определения ГМО в продуктах питания наиболее достоверным является метод полимеразной цепной реакции //.

Целью настоящего исследования было определение генетически модифицированных организмов в детских молочных кашах методом полимеразной цепной реакции.

атериалы и методы.М Объектами исследования были детские молочные каши различных фирм производителей, представленные в таблице. Таблица. Названия исследуемых продуктов и фирм-производителей.

В качестве метода молекулярно-генетического анализа на предмет обнаружения ГМО, применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР), позволяющую выявить ничтожно малые фрагменты ДНК с помощью Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" многократной амплификации.

Выделение ДНК из описанных продуктов осуществляли с применением комплекта «ДНК-сорб-С» вариант 50. В настоящем исследовании использовали сорбент универсальный для осаждения молекул ДНК.Амплификацию последовательности промотора 35S, а также генов сои и кукурузы проводили с использованием комплекта «АмплиСенс вариант 50-R ПЛАНТ-СКРИН», последовательности терминатора Nos, последовательности ДНК генетически модифицированной сои линии 40-3-2, с помощью набора реактивов «АмплиСенс вариант 50-R ГМ-соя 40-3-2».

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР в агарозном геле проводили с помощью комплекта «ЭФ вариант 300». Все наборы реактивов произведены «ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора».

Анализ результатов электрофореза проводили, обрабатывая полученные данные с помощью компьютерной системы Totallab.

Результаты и обсуждение. Для скрининга на наличие ГМО первоначальные эксперименты проводили с применением тест-системы «ПЛАНТ-СКРИН». После выделения ДНК из всех тестируемых образцов, ставили реакции амплификации в соответствующем режиме. Число циклов составляло 42. По окончании ПЦР продукты амплификации анализировали процедурой электрофореза в агарозном геле. Применяли положительный и отрицательный контрольные образцы (ПКО и ОКО соответственно). В данной тест-системе применяли 2 варианта ПКО для выявления генетически модифицированной сои (ПКО 1) и кукурузы (ПКО 2). Для достоверности полученных результатов эксперимент повторяли по три раза с каждым образцом. Фотография электрофореза представлена на Рисунке 1.

По результатам исследования с помощью данной тест-системы обнаружены фрагменты ДНК, размером 400 п.н., что соответствует длине амплифицированных фрагментов ДНК генома сои в 2 исследуемых образцах: Hummana «каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью», HEINS «Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка». Кроме того, обнаружены фрагменты ДНК размером 544 п.н., что соответствует длине амплифицированных фрагментов ДНК генома кукурузы в 1 из исследуемых образцов Nestle «каша 5 злаков».

Не обнаружено фрагментов ДНК размером 194 п.н., соответствующих промотору 35S. Отсутствие каких-либо флуоресцирующих полос ДНК в дорожке 3, соответствующей ОКО, доказывает достоверность полученных результатов. Следовательно, 2 из 8 проанализированных продуктов содержат генетически модифицированную сою и 1 из 8 – Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" генетически модифицированную кукурузу.

Следуя рекомендациям «Инструкции АмплиСенс-50-R», после скрининговых исследований с помощью тест-системы «ПЛАНТ-СКРИН»

необходимо проверить исследуемые продукты с комплектами реагентов «Терминатор-NOS» и «ГМ соя 40-3-2». Все исследуемые объекты тестировала в описанных системах.

Процедуру выделения ДНК материала из исследуемых образцов проводили без изменений. С выделенными ДНК образцами ставили ПЦР с использованием тест-системы «Терминатор-NOS» в соответствующем режиме с количеством циклов амплификации 42. По окончании реакций проводили детекцию продуктов в электрофорезном геле. Результаты приведены на Рисунке 2. В настоящем электрофорезе не использована дорожка 3. Такую нумерацию использовали для сохранения последовательности объектов, приведенных в предыдущем рисунке.

В ходе анализа полученных результатов были обнаружены положительные образцы в 4 исследуемых продуктах: Hummana «каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью», Тёма «каша 5 злаков», Фруто няня «Каша овсяная с молоком и персиками», HEINS «Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка». Следовательно, 4 из проанализированных продуктов содержит ГМИ.

Для определения конкретных линий генетически модифицированной сои необходимо продолжить эксперименты с использованием других наборов реагентов. Последующие эксперименты проводили с применением тест-системы «ГМ соя 40-3-2» с целью выявления фрагментов генетически модифицированной сои линии 40-3-2.

Картина электрофореза амплифицированных фрагментов ДНК приведена на Рисунке 3.

В этом эксперименте положительный результат, соответствующий размерам амплифлицированных фрагментов ДНК 274 п.н., показали следующие продукты: Hummana «каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью», HEINS «Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка». Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о наличии ГМ- сои линии 40-3-2 в 2 исследуемых образцах детских каш в данной тест-системе.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1.С применением скрининговой тест-системы «ПЛАНТ-СКРИН»

обнаружены фрагменты ДНК размером 400 п.н., что соответствует длине амплифицированных фрагментов ДНК генома сои в 2 из 8 исследуемых образцов: Hummana «каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью», Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" HEINS «Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка»;

также обнаружены фрагменты ДНК размером 544 п.н., что соответствует длине амплифицированных фрагментов ДНК генома кукурузы в 1 из исследуемых образцов Nestle «каша 5 злаков».

2. С использований тест-системы «Терминатор NOS» искомые фрагменты ДНК размерами 180 п.н. соответствующие ПКО генома кукурузы линии GA-21, обнаружены в 4 из 8 исследуемых образцов:

Hummana «каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью», Тёма «каша злаков», Фруто няня «Каша овсяная с молоком и персиками», HEINS «Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка».

3. Обнаружены компоненты трансгенной сои линии 40-3-2 при анализе с применением тест-системы «ГМ соя 40-3-2» в 2 образцах из исследуемых: Hummana «каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью», HEINS «Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка».

Рис. 1. Электрофореграмма ДНК, амплифицированных с применением тест-системы «ПЛАНТ-СКРИН». 1. ПКО 1 соя 400 и 194 пн. 2. ПКО кукуруза 544 пн. 3. ОКО 4. Каша Молочно-гречневая с яблоками, «Фруто няня» 5. Каша Гречневая с яблоком и морковью, «Малютка» 6.

Каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью, «Hummana» 7. Каша Рисово-кукурузная, «Агуша» 8. Каша 5 злаков, «Nestle» 9. Каша злаков, «Тёма» 10. Каша овсяная с молоком и персиками, «Фруто няня»

Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка, «HEINS»

Рис. 2. Электрофореграмма ДНК, амплифицированных с применением тест-системы «Терминатор Nos» 1. ПКО 180 п.н. 2. ОКО 3. ------------------- 4.

Каша Молочно-гречневая с яблоками, «Фруто няня» 5. Каша Гречневая с яблоком и морковью, «Малютка» 6. Каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью, «Hummana» 7. Каша Рисово-кукурузная, «Агуша»

8. Каша 5 злаков, «Nestle» 9. Каша 5 злаков, «Тёма» 10. Каша овсяная с молоком и персиками, «Фруто няня» 11. Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка, «HEINS»

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Рис. 3. Электрофореграмма ДНК, амплифицированных с применением тест-систем «ГМ соя 40-3-2». 1. ПКО 274 п.н. 2. ОКО 3. ------------------- 4.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |   ...   | 9 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.