авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |

«ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет" Сервис виртуальных конференций Pax Grid Акутальные проблемы биохимии и бионанотехнологии III ...»

-- [ Страница 6 ] --

Каша Молочно-гречневая с яблоками, «Фруто няня» 5. Каша Гречневая с яблоком и морковью, «Малютка» 6. Каша Кукурузно-рисовая молочная с ванилью, «Hummana» 7. Каша Рисово-кукурузная, «Агуша»

8. Каша 5 злаков, «Nestle» 9. Каша 5 злаков, «Тёма» 10. Каша овсяная с молоком и персиками, «Фруто няня» 11. Лакомая кашка пшеничная, персик, абрикос, вишенка, «HEINS»

Литература 1. ГМО – зона повышенного риска / под ред. Е. Климова. Алматы: Спектр, 2003. – 52 с.

2. Ermakova I.V. GM soybeans revisiting a controversial format // Nature Biotechnology. — 2007. — Т. 25. — № 12. — С. 1351-1354.

3. Ermakova I. Influence of genetically modified soya on the birth-weight and survival of rat pups // Proceedings «Epigenetics, Transgenic Plants and Risk Assessment». — 2006. — С. 41-48.

4. Закон Республики Казахстан от 04.05.2010 N 274-IV 5. "О защите прав потребителей".

6. Глик, Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ФЕНОТИПОВ ТРАНСФОРМАНТОВ STREPTOMYCES GLOBISPORUS Полищук Л. В., Лукьянчук В. В.

Институт микобиологии и вирусологии НАН Украины (г. Киев), Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины (г. Киев) Polischuk@serv.imv.kiev.ua Вступление. Биотехнология – это новое направление деятельности человека, которое предоставляет возможность целенаправленно изменять свойства как микроорганизмов, так и растений и животных [2, 10, 11, 18, 19, 22]. Успех такого рода деятельности, базирующейся на изменениях генотипов организмов, возможен только при условии стабильности наследования трансгенными организмами всех свойств и детерминируемых трансгенами, и свойственных организму-реципиенту.

Однако установлено, что в дальнейшем, при практическом использовании трансгенных организмов или в процессе их исследования, имеют место изменения как фенотипических, так и генетических характеристик гибридных организмов.

Таким образом, важным и актуальным является изучение таких изменений, выявление их причин и механизмов. Установлено, что причинами прекращения экспрессии клонированных генов может быть их «замолкание», интеграция гибридной конструкции в хромосому и последующая ее неточная эксцизия и ряд других [2, 10].

Нежелательным есть также и появление новых незапланированных свойств у трансформированных организмов, которые, например, у микроорганизмов продуцентов биологически активных соединений могут привести к частичной или полной потере биосинтетической активности [6, 11, 18, 19, 22].





Цель работы – изучение стабильности наследования ряда фенотипических признаков трансформантов штамма Streptomyces globisporus 1912-б/п, которые содержат гибридные плазмиды.

Материалы и методы. В данной работе исследовались трансгенных культур, полученных при выполнении программы ВБФМБ НАН Украины № госрегестрации 0107U011129. 23 из них содержали гибридные плазмиды построенные на базе вектора рАХ5а, а 13 построенные на базе вектора pWHM4 [5]. Бактерицидная активность метаболитов стрептомицетов тестировалась на 7 штаммах Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" стрептомицетов: S. griseus 3934, S. coelicolor А3(2), S. olivaceus VKX, S.

griseus Б6, S. levоris 165, S. lividans 1326, S. globisporus 1912-б/п.

В работе использовались агаризованные среды: картофельная, соевая, Гаузе 1 и Оканиши [6, 7]. Трансформанты хранились на среде Оканиши, содержащей антибиотик тиострептон в концентрации 50 мкг.

Синтетичнескую среду Гаузе 1 применяли при исследовании антибиотической активности микроорганизмов. Картофельная и соевая среды использовалиcь для накопления метаболитов [1, 6, 7].

Способность культур стрептомицетов продуцировать метаболиты с бактерицидными свойствами исследовали наложением 5-ти дневных блоков на свеженанесенные газоны тестерных штаммов стрептомицетов [3].

Состав комплексов метаболитов, синтезированных трансгенными культурами, исследовали соответственно методикам [1, 7].

Тонкослойную хроматографию проводили с использованием пластинок Cromatofolhas AL TLC Silicagel 60F фирмы “Merck”. Спектры поглощения метаболитов определяли в УФ- и видимом свете с помощью спектрофотометра Beckman DU-8B [1, 7]. Идентификацию каротиноидов на хроматографе Agilent 1200, колонка С18 [1].

Результаты и их обсуждение. Штамм S. globisporus 1912 был выделен в 1970 году из образца почвы, отобранной на сельскохозяйнных полях Армении [8]. Установлено, что данный штамм стрептомицета продуцирует комплекс противораковых антибиотиков, относящихся к ангуациклиновой группе (ландомицины А, Д и Е) [7]. Основным компонентом в этом комплексе, как установлено, является ландомицин Е. Спонтанно от штамма S. globisporus 1912 было отобрано ряд производных вариантов в том же числе и бесплазмидный вариант S.

globisporus 1912-б/п, который так же утратил способность синтезировать метаболиты с антибиотическими свойствами [1, 6, 7]. Этот вариант использовался как реципиент для гибридных плазмидных конструкций [5].

С помощью полимеразной цепной реакции было амплифицирован 1, т.п.н.- фрагмент хромосомы S. coelicolor A3(2), который содержит ген SCO1206. Трансген встроено в бифункциональные вектора pWHM4 (6, т.п.н.) и pAX5a (8,1 т.п.н.). Амплифицированная ДНК и векторные плазмиды гидролизовались двумя рестриктазами HindIII и EcoRI и лигировались лигазой фага Т4. Гибридными конструкциями первоначально трансформировали компетентные клетки Escherichia coli XL1 Blue. Отбирали Ap R- трансформанты, содержащие гибридные плазмидные ДНК молекулярным размером 7,7 т.п.н (построены на базе Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" вектора pWHM4) или 8,4 т.п.н. (вектор pAX5a). Полученными плазмидами трансформировались протопласты S. globisporus 1912-б/п и отбирались колонии, устойчивые к тиострептону. Первоначально трансгенные культуры по фенотипическим признакам были подобны штамму реципиенту – неокрашенная спорулирующая культура, не продуцирующая антибиотиков [5].





Однако при хранении трансформантов в селективных условиях была выявлена их сегрегация по некоторым фенотипическим признакам (споруляции и пигментированию культур). Проводились многократные пересевы до получения культур со стабильными визуально однородными фенотипами. Для дальнейших исследований было отобрано трансформантов S. globisporus 1912-б/п устойчивых к тиострептону.

Необходимо отметить, что многолетние исследования штамма S.

globisporus 1912-б/п не выявили изменений его окраски, споруляции или антибиотической активности.

Установлено, что из 36 отобранных трансформантов 10 культур (27, %) утеряли способность к спорообразованию. 61,1 % штаммов начали продуцировать пигменты, которые окрашивали субстратный мицелий и диффундировали в среду. Пигментация культур была характерной – двухдневные культуры трансформантов были окрашены в коричневый цвет, а семидневные – в сине-фиолетовый.

Как сообщалось ранее, такое изменение окраски мицелия характерно для исходного штамма S. globisporus 1912 за счет синтезируемого им антибиотика ландомицина Е. Известно, что окраска растворов антибиотиков антрациклинового ряда (в том числе и ландомицина Е) зависит от рН раствора. Показано, что раствор с рН меньшим окрашивается в коричневый цвет, а щелочной – в сине-фиолетовый.

Установлено, что S. globisporus 1912 и его производные варианты подщелачиваю среды при инкубации, что и приводит к таким метаморфозам их окраски.

Была исследована антибиотическая активность метаболитов трансформантов с использованием 7 тестерных штаммов и установлено, что 72,2 % из них демонстрируют антибиотическую активность. На основании вышеизложенных результатов трансформанты можно распределить на 4 группы (таблица).

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Таблица 1. Распределение трансформантов по группам в зависимости от их фенотипов Трансформанты, отнесенные в группу № Фенотип группы культур вектор pAX5a * вектор pWHM4** ТрS9, ТрS20, ТрS22, ТрS23, Спо Пиг Ант + + + 1 ТрS25, ТрS26, ТрS11, ТрS16, ТрS (33,3%) ТрS33, ТрS34, ТрS ТрS5, ТрS15, Спо-Пиг+Ант+ ТрS19, ТрS21, 2 ТрS7, ТрS (27,8%) ТрS24, ТрS28, ТрS29, ТрS Спо+Пиг-Ант+ 3 ТрS6, ТрS48, ТрS50 ТрS (11,1%) ТрS13, ТрS30, ТрS38, Спо+Пиг-Ант- ТрS27, ТрS47, 4 ТрS43, ТрS44, ТрS45, (27,8%) ТрS ТрS Примечания: Спо – споруляция, Пиг – окрашивание среды, Ант – антибиотическая активность;

* – трансформанты, содержат гибридные плазмиды сконструированные на базе вектора pAX5a, ** трансформанты, содержат гибридные плазмиды сконструированные на базе вектора pWHM4.

Кроме того, 11 трансформантов (из 1 и 2 групп) приобрели способность угнетать рост S. lividans 1326, который ни донор хромосомной ДНК (S. coelicolor A3(2)), ни реципиент гибридных плазмид (S. globisporus 1912-б/п), ни исходный штамм S. globisporus 1912 не угнетали.

Исследования екстрактов метаболитов трансгенных культур физико-химическими методами (тонкослойной хроматографией и спектрофотометрией) выявили разницу в составе синтезированных комплексов. Максимум поглощения метаболитов 22 окрашенных трансформантов (61,1 %) составлял 458 нм. Такое значение максимума поглощения очень близко к максимуму поглощения антибиотика ландомицина Е. Ранее установлено, что максимум поглощения ландомицина Е составляет 456 нм, в то время как его производных (окисленной и дегидрированной) форм - 440 нм и 502 нм [7].

У экстрактов метаболитов трансгенных культур (3 и 4 группы) не выявлено пиков поглощения в видимой части спектра поглощения.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Таким образом, 4 трансформанта (3 группа) синтезировали биоциды, вероятно не являющиеся антибиотиками ландомицинами, но могли быть их предшественниками или веществами иной природы.

Как видно из таблицы, у трансгенных культур виявлено одновременные изменение 2 или 3 фенотипических признаков – антибиотической активности, споруляции и пигментации.

При хранении одного из трансформантов (ТрS16), было выявлено темнолиловые неспорулирующие колонии. Исследования методами тонкослойной хроматографии, спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии метаболитов лилового варианта (ТрS16-Р) показали, что эта культура синтезирует каротиноид ликопин (рисунок).

Процедура получения протопластов, их трансформация или трансфекция – методики часто используемые в биотехнологии [4, 11, 16, 18]. Установлено, что в результате таких манипуляций могут появиться как ожидаемые желанные изменения фенотипа у трансформанта (следствие экспрессии трансгена), так и нежеланные неожиданные изменения как последствие мутагенного действия биотехнологических процедур [4, 17]. Например, среди регенерантов штамма S. galbus (F) subsp. аchromogenes 695 выявлено варианты со значительными изменениями биосинтетической активности и состава комплекса синтезируемых антибиотиков [4]. Так же сообщалось, что, как следствие протопластирования, у штамма S. setonii ISP5395 (не продуцирующего каротиноиды) было получено мутант, который приобрел такую способность [17].

Мы предполагаем, что выявленные изменения морфологических характеристик и биосинтетических возможностей изучаемых трансформантов – это проявление изменения их генотипов в результате мутаций. Мутагенными факторами в данном случае, по нашему мнению, могут быть получение протопластов и их трансформация. Однако мы не исключаем возможность и, не связанных с вышеуказанными генно-инженерными манипуляциями, спонтанных мутаций.

Ранее были получены мутанты как исходного штамма S. globisporus 1912, так и его производных вариантов. Установлено, что спонтанные и экспериментальные мутанты имеют изменения тех же фенотипических признаков, что и описанные трансформанты. В коллекции мутантов S.

globisporus 1912 собраны варианты с изменениями биосинтеза антибиотика ландомицина Е, «лысые» культуры, синтезирующие каротиноиды бета-каротин и ликопин [1, 6 – 9].

Согласно данным литературы, мутации хромосомной ДНК одного и того же штамма микроорганизма, не зависимо от способа их получения, Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" изменяют одни и те же гены [13, 20]. Однако, если спонтанне изменения выявляют у 0,1 % спор, то индуцированные изменения происходят более чем в 25 % колоний. Кроме того показано, что вследствие мутагенеза могут происходить изменения двух и более генов микроорганизмов одновременно [14, 20].

Другими исследователями выявлено одновременную потерю мутантами таких фенотипических признаков, как спорулляция и синтез определенных метаболитов у ряда стрептомицетов (S. griseus, S.

coelicolor A3(2) та S. bikiniensis). Например, сообщается что «лысые»

мутанты S. griseus перестали синтезировать антибиотик стрептомицин, а не спорулирующий мутант S. coelicolor A3(2) более не синтезировал антибиотики актинородин и продигиозин [15, ].

Вывод. Установлено, что большинство полученных и исследованных трансформантов (72,2 %), при хранении в селективних условиях, имели одновременные изменения двух или больше фенотипических признаков реципиентной культуры: споруллирование, синтез каротиноида ликопина и антибиотической активности. Обобщая данные, полученные в представленном исследовании, и ранее опубликованные результаты изучения мутантов S. globisporus 1912 было сделано предположение о повышенной мутабильности генов детерминирующих данные фенотипические признаки.

Рис. 1. Высокоэффективная хроматография каротиноидов трансформанта TpS16-P. Пик 1 - ликопин (7614 мин) Литература 1. Голембіовська С.Л., Мацелюх Б.П. Продукування каротину і лікопіну мутантами Streptomyces globisporus 1912. // Мікробіол. журн.- 2008. 70, №4.- С.45-50.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" 2. Дейнеко Е.В., Новоселя Т.В., Загорская A.A., Филипенко Е.А., Пухначева Н.В., Шумный В.Л. Инактивирование чужеродных генов у трансгенных растений табака (обзор) // Изучение генома и генетическая трансформация растений. Новосибирск: Наука, 2001. С.

132-142.

3. Егоров Н.С. Основы учения об антибіотиках.– Москва: Высшая школа, 1985.– 448с.

4. Йочева Л.Д., Антонова–Николова С.К. Влияние протопластирования на антибиотическую активность и состав актиномицинового комплекса штамма Streptomyces galbus (F) subsp. аchromogenes и его активных вариантов // Антибиотики и химиотерапия.– 2000.– Т.5, № 4.– С.10– 13.

5. Лук‘янчук В.В., Поліщук Л.В. Клонування ПЛР-копій нуклеотидної послідовності гена SCO1206 Streptomyces coelicolor A3(2) // Мікроб.

журн.– T.72, № 3, С.46 – 51.

6. Мацелюх Б.П., Лутченко В.А., Поліщук Л.В. Синтез каротиноїдів мутантними штамами Streptomyces globisporus 1912//Мікробіол.

журн.–2003.–Т. 65, № 6. – С. 24– 30.

7. Мацелюх Б.П., Тимчик О.В., Мацелюх А.Б. Вплив умов вирощування Streptomyces globisporus 3– 1 на продукування ландоміцину Е//Мікробіол. журн.– 2005. – Т. 67, № 4. – С. 44–51.

8. Полищук Л.В., Полевода Б.В., Заверуха В.Б., Мацелюх Б.П. Изучение стабильности наследования плазмиды pSG1912 клетками Streptomyces globisporus 1912 и гетерологичных штаммов стрептомицетов // Микробиол. журн.– 1992.– T.54, №3. –С.9– 14.

9. Поліщук Л.В., Голембієвська С.Л., Мацелюх Б.П., Лук‘янчук В.В.

Crt+- та Lcp+ -мутанти Streptomyces globisporus 1912 // Мікробіол.

журн. – 2013 (cтатья в печати).

10. Юзбашев Т.В., Соболевская Т.И., Тихонова Е.Ю., Выборная Т.В., Лаптев И.А., Синеокий С.П. Интегративны вектор Random-URA3-RPT для последовательного введения множественных копий генетических элементов в дрожжи Yarrowia lipolytica. Патент РФ №2376376. Дата приоритета 16.11.2006 г.

11. Baltz R.H. Genetics and biochemistry of tylosin productin : A model for genetic engineering in antibiotic-producing Streptomyces // In:"Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals" (Hollaender A., DeMoss R.D., Kaplan S., Konisky J., Savage D., Wolfe R.S., eds.) // Pro.

Symp.Chempaian.Urbana, Plenum Press.- New-Jork, London.-1982.-P. -444.

12. Baltz R.H. Genetic manipulation of antibiotic– producing Streptomyces // Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Trends Microbiol.– 1998.– Vol. 6, №2.– P.76– 83.

13. Birch A., Hausler A., Hutter R. Genome rearrangement and genetic instability in Streptomyces spp. // Bacteriol.– 1990.– Vol.172, № 8.– P.

4138– 4142.

14. Dharmalingam K., Cullum J. Genetic instability in Streptomyces // J.

Biosciences.– 1996.– Vol. 21, № 3.– P.433– 444.

15. Hara O., Horinouchi S., Uozumi T., Beppu T.. Genetic analysis of A-factor synthesis in Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces griseus // J.

Gen. Microbiol.-1983.- Vol. 129, №9.– P.2939-2944.

16. Horinouchi S., Hara O., Beppu T. Cloning of a pleiotropic gene that positively controls biosynthesis of A-factor, actinorhodin, and prodigiosin in Streptomyces coelicolor A3(2) and Streptomyces lividans // J Bacteriol.- 1983.- Vol. 155, №3.– P.1238-1248.

17. Kato F., Hino T., Nakaji A., Tanaka M., Koyama Y. Carotenoid synthesis in Streptomyces setonii ISP5395 is induced by the gene crtS, whose product is similar to a sigma factor // Mol. Gen. Genet. – 1995. – Vol. 247, №10. – P. 387 – 390.

18. Kieser, T., Bibb M. J., Chater K. F., Buttner M. J., Hopwood D. A.

Practical Streptomyces genetics: a laboratory manual.- Norwich (United Kingdom): John Innes Foundation, 2000.- 424 p.

19. Schumann G., Nurnberger H., Sandman G., Krugel H. Activation and analysis of cryptic crt genes for carotenoid biosynthesis from Streptomyces griseus // Mol. Gen. Genet. – 1996. – 252. – P.658–666.

20. Volff J.– N., Altenbuchner J. Genetic instability of the Streptomyces chromosome // Mol. Microbiol.– 1996.– Vol.27, № 2.– P.239– 246.

21. Volff J.N., Vandewiele D., Decaris B. Stimulation of genetic instability and associated large genomic rearrangements in Streptomyces ambofaciens by three fluoroquinolones // Antimicrob. Agents Chemother.- 1994.- Vol. 38, № 9. – Р.1984-1990.

22. Wang M., Yang H., Gao Jun –lian., Ma Rong-cai. Breeding of high-yield lycopene producing strains of Streptomyces rimosus and studies on its flask culture conditions // China Biotecnology.-2009.- №12.- C.013.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ЛИТИЕВАЯ СОЛЬ АКРИДОНУКСУСНОЙ КИСЛОТЫ КАК СУБСТАНЦИЯ ДЛЯ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Половцев С.В., Носков Ф.С., Галилеев С.М., Белов И.В.

ФГУП РНЦ «Прикладная химия», СПб, НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Пастера, СПб, Санкт-Петербургский государственный инженерно-экономический университет (ИНЖЭКОН), СПб galina@polovtsev.com, galiley@engec.ru В статье рассматривается новый противовирусный имуномодулирующий препарат с чрезвычайно высокой бактерицидной и, особенно, вирулицидной эффективностью против РНК и ДНК вирусов, обладающий микоцидным и альгицидным эффектом. Рассмотрены пути эффективного использования препарата в народно-хозяйственных продуктах.

Известны фармакологические эффекты солей лития, используемые фармакопеей ряда стран, СССР и России. [1, 2]. Нами собрана библиография более 600 работ, посвященных положительному влиянию литиевых солей на растительный и животный мир и человека.

Помимо разрушающего действия иона лития на отложения солей при почечно-каменной болезни в упомянутых источниках есть указания на иммуностимулирующее действие лития, способность поляризовать мембраны и тем самым способствовать фармакологически активному аниону проникать в клетку.

В 90-е годы 20 века в России разработан сначала как ветеринарный, а затем и медицинский препарат «Неовир» - натриевая соль акридонуксусной кислоты-противовирусный и иммуномодулирующий (ЛАУК).

Ф.С. Носков, многие годы работавший в области исследования литиевых препаратов, испытал литиевую соль акридонуксусной кислоты (ЛАУК) «Виролит» как альтернативу «Неовиру».

Известны применяемые в противовирусной терапии лекарственные средства на основе литиевых солей [3], например, хлорид лития, где противовирусным действием обладают ионы лития вне зависимости от того, в состав какой соли они входят ( сукцинат, карбонат, бензоат).

Указанные средства дают определенный лечебный эффект при их Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" использовании в виде таблеток, на мазевой основе, при электрофорезе растворов. Однако, эти лекарственные средства при относительно низкой токсичности не обладают противовирусным действием (активностью) в отношении РНК содержащих вирусов (гриппа, арбовирусов и др.).

Наиболее близким по механизму воздействия на клетку иммунной системы является низкомолекулярный индуктор интерферона «Неовир»

(НАУК) [4]. При высокой эффективности и малой токсичности препарат гидрофилен и ограничено стабилен при хранении. Кроме того он проявляет недостаточную эффективность в отношении ДНК содержащих вирусов. Эффективность обеспечивается только за счет повышения неспецифической резистентности (индукция интерферонов альфа/бета).

На этом основании мы считали своей задачей синтезировать и испытать низкомолекулярное химическое соединение, биологическое действие которого сочетало двухстороннюю активность, т.е. препарат должен обладать ингибирующей активностью в отношении определенных этапов репродукции вируса, а также способностью индуцировать гибель и удаление инфицированных клеток из организма или эффективными функциями, обеспечивающими инактивацию и элюминацию патогенна без цитопатического действия на инфицированную клетку.

Результат от использования «Виролита» [3, 4, 6] заключался в значительном повышении эффективности препарата в отношении ДНК содержащих вирусов (в несколько тысяч раз), сочетания не специфического действия за счет индукции интерферона прямым противовирусным действием на репродукцию вируса в инфицированной клетке и удобства использования препарата перрорально.

В отличие от ранее известного действия литиевых солей на ДНК содержащие вирусы, где противовирусным действием обладает в первую очередь ион лития [8], «Виролит» (ЛАУК) активна и в отношении ДНК и РНК содержащие вирусы, и это действие распространяется не только на вирусы герпеса, оспы, аденовирусов (ДНК геномным вирусам), но и на вирусы гриппа А и В, японского энцефалита, венесуэльского энцефаломиелита, вируса лихорадки долины РИФТ.

«Виролит», по нашему мнению, является индуктором синтеза и секреции цитокинов, главным образом противовоспалительных цитокинов, активирующих функциональную активность натуральных киллеров и макрофагов, тем самым обеспечивая литическое действие на клетки, несущие чужеродную генетическую информацию, и иные эффекторные функции специфических цитоксических СД8(+)Т клеток, Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" обеспечивая нецитологическую инактивацию и элиминацию патогена из инфицированной клетки.

С другой стороны, препарат проявляет ингибирующее действие на репродукцию вирусов, обладая способностью специфического взаимодействия с вирусной мишенью.

Синтез субстанции осуществляется с использованием отечественных компонентов, применяемых в медицине.

Свойства «Виролита» при хранении в защищенном от света месте при комнатной температуре в течении срока наблюдения (1,5 года) не менялись. Острая токсичность для мышей ЛД50 - 713мг/кг при внутрибрюшном введении. Не вызывает аллергических осложнений и побочных реакций.

«Виролит» может применяться вместе с антибиотиками, сульфаниламидами, гормонами, сывороточными белками. Применение «Виролита» не препятствует использованию традиционной патогенетической и симптоматической терапии. Эффективные терапевтические дозы для мышей 50-100 мг/кг, терапевтический индекс болыне 10. При внутримышечном введении «Виролит» быстро проникает в кровь, достигая максимального уровня через 2 часа в неизменном виде.

Из организма выводится в неизмененном виде с мочой и через 24 часа в крови и моче не обнаруживается.

Нам не удалось после получения патента на «Виролит» найти средства на подготовку субстанции и проведение доклинических испытаний ни у отечественных фармкомпаний, ни у западных медицинских фондов. Уход из жизни руководителя этих работ д.м.н. Ф.С.

Носкова с его опытом и связями в области микробиологии и эпидемиологии затормозил развитие исследований по патенту.

В 2011 г. с АО «Медбиофарм» (Обнинск) испытал оставшуюся у нас субстанцию «Виролита» в институте вирусологии РАМН. В результате бьшо показано, что «Виролит» в культуре тканей имеет наивысшую эффективность против вируса герпеса в сравнении с известными препаратами.

Однако, патент [6] просрочен и не восстановим. С учетом замечаний российских фармпроизводителей о трудности создания инъекционной формы на базе мало растворимого «Виролита» мы, используя патент [6] в качестве прототипа, на базе нашей механохимической техники измельчения решили создать наноизмельченный «Виролит».

Кинетическая энергия удара может изменить характер связей и ионной и координационной с кислородом и азотом.

С другой стороны, мы синтезировали растворимую форму «Виролита»

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" на основе координационной связи солей лития с акридонуксусной кислотой. Исходя из общих соображений, мы полагаем целесообразным информировать медикобиологическую общественность о наличии препарата, его свойствах и возможности поставки его в форме по просроченному патенту, в нанодисперсной форме и в виде водорастворимой соли с координационной связью.

Кроме того сильный противогерпесный эффект может бьпъ использован в косметических средствах (зубной пасте и губной помаде) тем более, что их продвижение на рынок и по объему, и по затратам неизмеримо проще, чем продвижение фармпродукции.

ООО «Мастерица» (СПб) вьшускает одноразовые стерильные простьши для медицинских целей на основе финского вискозного композита Фибрелла. Введение «Виролита» в такой материал могло бы придать ему лечебные свойства.

Поскольку «Виролит» сохраняет органофильность и в форме субстанции по патенту, и в наноизмельченном состоянии, он может быть использован как наполнитель полимеров для придания им бактерицидности. Например, полиэтиленовая упаковочная пленка для соков, пива, бутилированной воды, или полиэтиленовая пленка для вакуумной упаковки скоропортящихся продуктов, или полиэтиленовая пленка колбас и сосисок.

Для организаций, занимающихся очисткой стоков, гранулы вторичного полиэтилена, модифицированные «Виролитом» могут быть рекомендованы как насадка фильтров очистки от бактерий, грибов, водорослей и вирусов (в случае необходимости очистки) как альтернатива обработки гипохлоритами, ультрафиолетом, ультра фильтрацией.

Несомненный интерес представляет проверка «Виролита» на обезвоживании и дезактивации бактериальных шламов очистных сооружений.

Высокая бактерицидность, вирулицидность, альгицидность и микоцидность «Виролита» может быть использована для создания лакокрасочных покрытий, модифицированных этим препаратом, для использования при решении ряда актуальных народно-хозяйственных задач. Например, защита хранилищ очищенной питьевой воды от вторичного биопоражения, защиты канализации, фундаментов, конструкций метрополитена от биокоррозии. Эти же свойства «Виролита» могут быть использованы при реставрационных работах.

Введение нанодисперсного «Виролита» в массу полимера перед получением ультрафильтрационных материалов, несущих объемный Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" электрический заряд на сверхтонком волокне (ткани Петрянова), могут повысить их бактерицидную, вирулицидную и другую биоцидную эффективность на очистке воздуха.

Литература 1. Мошковский М.Д. Лекарственные средства спр. В 2 томах Москва, Медицина, 1984г т1 с.503 с. 104-106.

2. Васичкин В. Эстетический массаж. Невская книга. Эксмо пресс СПб с.

393-403.

3. Skinnег О.К.В., Наг11еу С., Висhan А. еt а1. "Тhе еffect of Litium cloride оn the ерlication оf Негреs simplex virus”. Меd. Mickrobiol Immunol 1980, 168 p 139- 4. Патент РФ 2020941, «Ниовир»

5. Носков Ф.С., Кацалуха В.В. и др. «Новое противовирусное средство»

широкого спектра действия. Материалы научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» ВМА им. С.М.Кирова СПб 14.01. 2003 г.

6. Патент РФ 2202548 от 6.05.2001г. Носков Ф.С.,Бичурина М.А., Половцев С.В. и др. «Противовирусное иммуномодулирующее средство».

7. Патент США 4314061 МКИС 07 Д 413/ 8. David Horrobin (Lithium Research Institute, Cantvill, Nova Scotia, Canada) “Lithium in control of herpes virus infection” in book Lithium ed. Ricardo Obech, New York Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ГИДРОЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ TRICHODERMA ASPERELLUM ПРИ АНТАГОНИЗМЕ Романова И.В., Тазетдинова Д.И.

ФГАОУ КФУ, Институт фундаментальной медицины и биологии, кафедра биохимии iri.romanova.88@gmail.com Известно, что грибы рода Trichoderma способны паразитировать на большом количестве фитопатогенных грибов, распознавая их и прорастая на них, выделяя при этом комплекс метаболитов: антибиотики, гидролитические ферменты (хитиназы, глюканазы, протеазы) и другие вещества, разрушающие клеточные стенки этих фитопатогенов и подавляющие их жизнедеятельность. Ранее нами было показано, что Trichoderma asperellum обладает высокой антагонистической активностью против возбудителя фузариозного увядания Fusarium oxysporum. В связи с этим целью нашей работы явилась оценка гидролазной активности Trichoderma asperellum.

Нами был исследован комплекс гидролитических ферментов (1,3-бета-глюканаз, хитиназ, протеаз) T.asperellum, выращенной на стандартной среде Чапека с коллоидным хитином и на модельной среде Чапека с клеточными стенками фитопатогена F.oxysporum для индукции гидролитических ферментов. Глюканазную активность определяли методом, основанном на определении редуцирующий сахаров [Кonig, Anal. Boianal. Chem, 2002, 374: 80-87]. Хитиназу определяли спектрофотометрически по выходу N-ацетил-B-глюкозамина [Алимова, 2010: 41]. Протеолитическую активность определяли по казеину [Каверзнева, прикладная биохимия и микроб., 1971, 7: 225 - 228].

На стандартной среде максимальную общую активность глюканазы наблюдали на 4 сутки (5,7 мкМ/мл). Максимум хитиназной и протеазной активности на стандартной среде отмечен на 3 сутки (1,57мкМ/мл и 0, ПЕ/мл).

На модельной среде Чапека с добавлением в качестве индуктора фермента клеточных стенок максимальная общая глюканазная активность достигалась на 4 сутки (6,4 мкМ/мл). Максимальная хитиназная и протеазная активность достигалась на 3 сутки (5,46мкМ/мл и 0,23ПЕ/мл).

При сравнении активности гидролаз T.asperellum на модельной и Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" стандартной среде было показано увеличение хитиназной активности на модельной среде на 3 и на 6 сутки (на 148% и на 65% соответственно) по сравнению с активностью на стандартной среде. Достоверного увеличения глюканазной и протеазной активности на модельной среде по сравнению со стандартной не наблюдали.

Полученные результаты позволяют нам говорить о перспективности использования T.asperellum в биологическом контроле фитопатогенов.

Литература 1. Алимова, Ф. К. Методы определения гидролаз почв и почвенных микроорганизмов [Текст] / Ф. К. Алимова. - Казань: Казан¬ский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, 2010. - 68 с.

2. Каверзнева, Е. Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз [текст] / Е.Д.

Каверзнева. - Прикладная биохимия и микробиология, - 1971. – Том VII (2). – с.225 – 228.

3. Druzhinina, I. Trichoderma: the genomics of opportunistic success [Text] / I Druzhinina, Seidl-Seiboth V, Herrera-Estrella A, Horwitz BA, Kenerley CM, Monte E, Mukherjee PK, Zeilinger S, Grigoriev IV and CP Kubicek // Nature Reviews Microbiology, - 2011. – Vol.9. - P. 749 – 759.

4. Knig, J. Determination of xylanase, glucanase, and cellulase activity [Text] / J. Knig, R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel // Anal. Boianal. Chem. - 2002. V. 374. - P. 80-87.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ОЦЕНКА ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ГИПЕРРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ НА КЛЕТКАХ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO Романова Н.С., Мурадимова Р.Э., Кутырева М.П., Невзорова Т.А.

Казанский (Приволжский) федеральный университет zartlich15@yandex.ru Для модулирования биохимических процессов в клетке можно применять биологически активные молекулы (БАВ), которые необходимо доставить в клетку-мишень. Среди носителей БАВ перспективными и легко синтезируемыми являются гиперразветвленные полиэфиры (ГРПЭ), свойства и структуру которых можно изменять. Но при выборе носителя, в первую очередь, необходимо оценить их токсичность на клетку.

Цель работы: оценить цитотоксичность гипперразветвленных аминополиэфиров (ГРАПЭ) на клетках крови человека in vitro.

В работе использованы ГРАПЭ на основе Boltorn Н20 и Н30, синтезированные Кутыревой М.П. (КФУ).

Мононуклеарные клетки и эритроциты получали из крови человека методом центрифугирования на фиколл-верографине.

Оценку гемолитической активности ГРАПЭ проводили после соинкубирования с эритроцитами в течение 30 минут при 25С.

Оценку цитотоксичности ГРАПЭ проводили на первичной культуре мононуклеарных клеток крови человека in vitro после их сокультивирования при 37С, 5 % СО2 в среде RPMI-1640.

Минимальную гемолитическую активность проявляют ГРАПЭ №1 и №4. ГРАПЭ №1 и №4 значимого влияния на мононуклеарные клетки не оказывают. ГРАПЭ №2 в зависимости от концентрации стимулирует рост и деление клеток, ГРАПЭ №3, в основном, приводит к гибели клеток, что сопровождается изменениями выделения Н 2 О 2 и структуры ДНК хроматина клеток.

В дальнейшем в работе будут использованы ГРАПЭ №1 и №4, так как они обладают минимальной цитотоксичностью.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ДЕНДРОННЫЕ СФЕРИЧЕСКИЕ ПОЛИМЕРНЫЕ ЩЕТКИ.

МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕТОДОМ САМОСОГЛАСОВАННОГО ПОЛЯ Рудь О.В., Борисов О.В., Полотский А.А., Бирштейн Т.М.

Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия helvrud@gmail.com Равновесные структурные свойства полимерных щеток, сформированных дендронами, привитыми к сферической поверхности изучались с помощью метода самосогласованного поля Схойтенса-Флира.

Особенное внимание было уделено изучению влияния кривизны поверхности прививки на конформационные характеристики дендронов в щетке. Был проведен систематический анализ различий между дендронной и линейной полимерными щетками (щетки образованной линейными полимерными цепями).

Было показано, что различие в организации внутренней структуры дендронной и линейной щеток наиболее выражено при малом радиусе кривизны поверхности прививки. В частности, радиальное распределение полимерной плотности в дендронной щетке близко к однородному, в то время как у линейной оно подчиняется степенному закону. Квази-плато полимерной плотности у дендронной щетки обеспечивается широким радиальным распределением концевых сегментов. Для сравнения в линейной щетке концевые сегменты локализованы преимущественно на периферии щетки.

Рост радиуса кривизны поверхности прививки сопровождается возникновением расслоения на две или более, для большего числа генераций популяции дендронов, растянутых слабо и растянутых сильно.

Первые заполняют пространство вблизи поверхности пришивки дендронной щетки, а вторые внешнюю ее область (см рисунок №1).

Теоретические результаты находятся в качественном согласии с экспериментальными значениями гидродинамического радиуса линейной и дендронной щеток из полиэтиленгликоля на поверхности наночастиц оксида железа Fe3O4.[1].

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Рис. 1. Расслоение на две и три популяции общего числа дендронов в щетке при изменении ее кривизны.

Литература 1. Gillich, T.. Self-Organization of Catechol-Functionalized Dendrons for the Creation of Non-Interactive, Antifouling Biointerfaces in 2D and 3D.

PhD-thesis, ETH Zurich, 2011.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФИЗМА G894T ГЕНА ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ NO-СИНТАЗЫ С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РЕСТЕНОЗА ПОСЛЕ КОРОНАРНОГО СТЕНТИРОВАНИЯ У БОЛЬНЫХ ИБС Рукин К. Ю., Петрова И. В., Фаттахов Н. С.

Сибирский государственный медицинский университет nikola.fattahov@mail.ru Актуальность. Ишемическая болезнь сердца (ИБС) - ведущая причина смертности и потери трудоспособности среди взрослого населения развитых стран. Для лечения больных ИБС в настоящее время широко применяют эндоваскулярные методы лечения, такие как чрезкожная транслюминальная коронарная ангиопластика (ЧТКА) и стентирование коронарных артерий. Однако, при высокой эффективности ЧТКА через 3-6 месяцев после вмешательства возможно повторное сужение (рестеноз) сосуда в месте дилатации [1,2]. Рестеноз продолжает представлять собой проблему, которая уменьшается, но не устраняется при имплантации стента. Он является основной причиной возобновления ишемии, острого инфаркта миокарда и коронарной смерти. Несомненно, важным является поиск предикторов рестеноза, в том числе генетически обусловленных.

Цель исследования: изучить связь полиморфизма G894T гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) с развитием рестеноза после стентирования коронарных артерий голометаллическими стентами.

Материалы и методы. В исследовании принимало участие больных ИБС с развившимся рестенозом после ЧТКА, в контрольную группу входило 790 практически здоровых людей. Диагноз ИБС устанавливали на основании клинического обследования, данных лабораторных и инструментальных методов. Выделение геномной ДНК проводили методом фенолхлороформной экстракции. Исследование генотипа осуществляли методом ПЦР с последующей рестрикцией. Для статистической обработки использовали пакеты программ «Statcalc», «Statistica for Windows 6.0» и «Arlequin 3.1».

Результаты. Установлены генотипы ассоциированные с увеличением риска развития рестеноза: генотип ТТ полиморфизма G894T eNOS (OR = 1,4;

CI(95%) = 1,1-4,8;

p = 0,002). Таким образом выявлено, что полиморфизм G894T гена эндотелиальной NO-синтазы Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ассоциирован с формированием рестеноза стентов у больных ИБС.

Литература 1. Fischman DL, Leon MB, Baim DS et al. A randomized comparison of coronary-stent placement and balloon angioplasty in the treatment of coronary artery disease. N Engl J Med 1994;

331: 496-501.

2. Serruys PW, de Jaegere P, Kiemeneij F et al. A comparison of balloon-expandable-stent implantation with balloon angioplasty in patients with coronary artery disease. N Engl J Med 1994;

331: 489-95.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Т-ЛИМФОЦИТОВ У ЛЮДЕЙ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ Рябинина Ю.В., Скибо Ю.В., Абрамова З.И.

Казанский (Приволжский) федеральный университет mavka2502@rambler.ru Была поставлена задача: определить морфологические особенности Т-лимфоцитов периферической крови больных АБА.

С помощью метода трансмиссионной электронной микроскопии были получены микрофотографии Т-лимфоцитов здоровых доноров. Они имеют правильную округлую форму (рис. 1). Клеточная мембрана ровная, без выпячиваний и инвагинаций. Ядро, как правило, занимает большую часть клетки, округлой формы, расположено центрально: в нем заметно ядрышко, локализация хроматина периферическая, кариоплазма электронно-светлая. Все мембранные структуры целостны и хорошо прорисованы - митохондрии правильной формы с хорошо дифференцированными кристами. Чаще всего, скопления митохондрий наблюдаются медиально, недалеко от ядра. В цитоплазме различимы рибосомы, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Наличие микроворсинок на поверхности плазматической мембраны свидетельствует о функционально активном состоянии.

Большая часть Т-лимфоцитов больных легкой формой АБА обладает характерными морфологическими признаками Т-клеток, однако часть лимфоцитов имеет не значительные морфологические отличия по сравнению с контрольной группой (рис.2).

Для всех Т-клеток данной группы характерно наличие правильной овальной формой с выростами (пили) и инвагинациями на поверхности плазматической мембраны. Ядра лимфоцитов, как и сами клетки, имеют овальную, но чаще всего неправильную форму, ярко выраженный лопастной вид. Они расположены эксцентрично (по отношению к оболочке клетки). Структура ядра одних лимфоцитов неоднородная, с просветлениями между глыбками хроматина, а в других ядерное вещество распределено однородно–равномерно. Хроматин ядра – конденсированный и расположен по его периферии. В цитоплазме различимы клеточные компоненты (митохондрии, эндоплазматический ретикулум – ЭПР и т.д.).

В группе больных тяжелой формой АБА наряду с нормальными Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" клетками, встречаются Т-лимфоциты с морфологическими изменениями, значительно отличающиеся от Т-лимфоцитов как здоровых доноров, так и больных легкой формой астмы (рис. 3). Обнаруживаются глубокие инвагинации ядерных мембран. Обнаружены изменения цитолеммы и поверхностных структур клетки. У некоторых клеток наблюдается утрата микроворсинок и десмосом. Клеточная поверхность не ровная, с многочисленными выростами. На цитоплазматической мембране выявляются выпячивания и пузыри, получившие название «блеббинги».

Плохо различимы структуры клетки - митохондрии, ЭПР, аппарат Гольджи.

Отмечено наличие везикул с электронно-светлым содержимым, мультиламеллярных телец, а также аутофагосом с содержимым средней электронной плотности. Целостность мембран лимфоцитов не нарушена.

Пролонгацию аллергического воспаления при бронхиальной астме связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апоптозу (Бойчук, 2001;

Spinozzi, 2008), что проявляется в замедлении процессов фрагментации ДНК этих клеток. Установлено, что для лимфоцитов больных бронхиальной астмой характерно торможение апоптоза (Бойчук, 2001). Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерно формирование глубоких впячиваний поверхности с образованием полостей. Поэтому в нашем исследовании мы связываем морфологические изменения клеток с тем, что они находились в процессе апоптоза.

Рис. 1. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. Увеличение 12000 раз. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АГ – Аппарат Гольджи, ЭПР – эндоплазматический ретикулум.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Рис. 2. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой формой атопической бронхиальной астмой. Увеличение 12000 раз. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АФ – аутофагосома, ЭПР – эндоплазматический ретикулум.

Рис. 3. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных тяжелой формой атопической бронхиальной астмой.

Увеличение 12000 раз. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АГ – Аппарат Гольджи, АФ – аутофагосома, ЭПР – эндоплазматический ретикулум, БЛ - блеббинг.

Литература 1. Melis M., Siena L. 2002. Fluticasone induces apoptosis in peripheral T-lymphocytes: a comparison between asthmatic and normal subjects. Eur Respir J. 19: 257-266.

2. Vignola, A.M., Chiappara G., Gagliardo R. 2000.Apoptosis and airway inflammation in asthma. Apoptosis. 5: 473-485.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" РОЛЬ ЛИЗОФОСФАТИДНОЙ КИСЛОТЫ В ОБРАЗОВАНИИ МИЦЕЛЛ ПРИ СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ У E.COLI Рябичко С.С., Алимова Ф.К., Богданов М.В.

Казанский (Приволжский) федеральный университет anomalhead@mail.ru E.coli способна пластично регулировать биосинтез мембранных глицеролипидов в зависимости от изменений окружающей среды.

Количество насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, а также распределение и количество зарядов в мембране формирует степень ее текучести, что может быть критично при стрессовых условиях, таких как температурное нагревание. Показано, что лизофосфатидная кислота присутствует в норме в мембране E.coli в пределах 0,1-0,5% от общего содержания глицерофосфолипидов. Несмотря на малую концентрацию, играет важную роль в клеточных процессах, в частности, в образовании мицелл, вероятно за счет содержания одного липофильного «хвоста», что несет возмущающее, дестабилизирующее действие на жидкокристаллическую липидную бислойную структуру [1]. Упаковка мембранных белков при их избытке в мицеллы или при стрессовых условиях могла бы способствовать их сохранению и транспортировке.

Таким образом, увеличение количества лизофосфатидной кислоты в мембране при одновременной сверхпродукции мембранных белков позволит подтвердить или опровергнуть данную гипотезу.

Нами был получен штамм E.coli SM2-1, содержащий делецию гена 1-ацил-глицерол-3-фосфат ацилтрансферазы plsC, в результате которой предотвращается синтез фосфатидной кислоты из лизофосфатидной кислоты, что приводит к накоплению последней [2]. В качестве модели мембранного белка была выбрана пермеаза лактозы. Для сверхпродукции пермеазы лактозы штамм был протрансформирован двумя плазмидами последовательно pGP1-2 и pT7-5, содержащими Т полимеразу и пермеазу лактозы под Т7 полимеразным промотором. Для контрольного эксперимента штамм, имеющий фенотип «дикого типа»

JF618 протрансформировали по упомянутой схеме. Штаммы растили до середины log-фазы на LB среде при 30°С, затем переносили на водяную баню 42°С на 20 минут (для увеличения синтеза лизофосфатидной кислоты) и подавляли клеточную полимеразу добавлением рифампицина в среду (для преимущественного синтеза плазмидных белков). Для Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" фосфолипидного анализа при инокуляции в среду добавлялся радиоактивный фосфат 32Р.

В результате двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) экстрагированных фосфолипидов в нейтральном водном направлении и в кислом ацетатном, обнаружили, что исследуемый штамм имеет повышенное содержание лизофосфатидной кислоты до 6% по отношению к 0,3% в норме (рис. 1).

Методом Вестерн-блоттинга мембранных фракций определили, что уровень экспрессии пермеазы лактозы у контрольного штамма выше при сравнительно одинаковом содержании конформационно «правильной»

пермеазы лактозы в мембране. Цитоплазматическая фракция содержит увеличенное количество пермеазы лактозы у штамма SM2-1, что может свидетельствовать о миграции избытка мембранного белка в цитоплазму при увеличенном содержании лизофосфатидной кислоты в мембране.

Возможно, данный механизм осуществляется в стрессовых условиях для сохранения нативной конформации мембранных белков.

Рис. 1. Двумерная ТСХ с радиометкой 32P фосфолипидов мутантов E.coli в %. ЛФК – лизофосфатидная кислота Литература 1. Kooijman E.E., Chupin V., Fuller N.L., Kozlov M.M., de Kruijff B., Burger K.N., Rand P.R. Spontaneous curvature of phosphatidic acid and lysophosphatidic acid / Biochemistry.- 2005.- V.44(6).- pp.2097-2102.

2. Coleman J. Characterization of Escherichia coli cells deficient in 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase activity / The Journal of Biological Chemistry.- 1990.- V.265(28).- pp.17215-17221.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕКСТУРНО-СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ ДИОКСИДА КРЕМНИЯ Саенко Е.В., Кондрашова Н.Б., Лебедева И.И., Вальцифер В.А.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт технической химии Уральского отделения Российской академии наук saenko_ekaterina@mail.ru Пористые материалы на основе диоксида кремния с упорядоченной пористой структурой и высокой удельной поверхностью перспективны в качестве систем адресной доставки лекарственных препаратов.

Диапазон возможного применения подобных материалов обусловливает необходимость направленного регулирования их текстурных и структурных свойств, что требует изучения влияния параметров синтеза на характеристики мезопористых материалов.

Использование при синтезе диоксида кремния гидролизуемых органозамещенных триалкоксисиланов в качестве со-источника диоксида кремния может быть использовано как способ регулирования его текстурных и структурных свойств. Влияние органозамещенных триалкоксисиланов на характеристики мезопористого диоксида кремния определяется гидрофильностью/гидрофобностью и геометрическими размерами их органических групп и проявляется в способности этих групп стабилизировать или дестабилизировать мицеллы ПАВ в процессе образования мезофазы, облегчать или затруднять полимеризацию силикат-анионов.

В данной работе исследовано влияние добавок органозамещенных триалкоксисиланов: (3-аминопропил)триэтоксисилана (APTES), (2-цианоэтил) триэтоксисилана (CNETES) и трис (триметилсилокси) силана (TTMSS) – в качестве со-источников диоксида кремния на его текстурные и структурные свойства. Показано влияние этих добавок на изменение параметров пористой структуры диоксида кремния в процессе гидротермальной обработки (ГТО). Синтезированные образцы мезопористого диоксида кремния охарактеризованы методами низкотемпературной адсорбции азота, рентгенофазового анализа, сканирующей электронной микроскопии, термического и элементного анализов и КР-спектроскопии.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект № 12-03-33170.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕРАПИИ ПАЦИЕНТОВ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА НЕКОМПЛАЕНТНОСТЬ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА В РАМКАХ «ШКОЛЫ ХМЛ» В НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ Самарина И.Н.1, СамойловаО.С.2, Еременко Н.Н.3, Савельева М.И.3, Кащеева Н.Е. ГБУЗ НО «БСМП», г. Дзержинск,Россия, НОКБ им. Семашко, г. Нижний Новгород, Россия, ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия sin7405@rambler.ru Хронический миелолейкоз (ХМЛ) – клональное миелопролиферативное заболевание, развивающееся в результате приобретенной хромосомной транслокации t(9;

22)[1].Высокоэффективным препаратом для лечения хронического миелолейкоза является ингибитор тирозинкиназы иматиниб.В исследовании IRIS показано, что фоне терапии иматинибом полная гематологическая ремиссия достигнута у 97% пациентов, получавших иматиниб,большой цитогенетический ответ достигнут и сохраняется у 87% больных[ 2].Несмотря на эффективность иматиниба, иногда наблюдается субоптимальный ответ и неудача терапии. В связи с этим, резистентность к иматинибу стала рассматриваться в качестве серьезной клинической проблемы при лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) [ 3]. Особый интерес представляет фармакорезистентность, обусловленная субъективными факторами, а именно, несоблюдением режима терапии. Низкая концентрация иматиниба в плазме крови, может быть причиной неудачи лечения и служить поводом для образовательной беседы с пациентом о важности соблюдения режима терапии.Кроме того, важным аспектом оценки эффективности терапии является, на наш взгляд,качество жизни пациента.Многочисленные исследования показали, что оценка качества жизни, сделанная самим пациентом, часто не совпадает с оценкой КЖ, выполненной врачом, поэтому оценку КЖ должен проводить сам пациент. Данные о КЖ,наряду с традиционным медицинским заключением, сделанным врачом, позволяют составить полную и объективную картину болезни.К настоящему времени доказано, что параметры КЖ больного обладают независимой прогностической Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" значимостью и являются более точными факторами прогноза, чем общесоматический статус [4].В целом, можно говорить о том, что при хронических заболеваниях КЖ является одним из основных критериев оценки состояния больного [5].

Цель: Оптимизация терапии пациентов с подозрением на некомплаентность при лечении ХМЛ в рамках усовершенствованной «Школы ХМЛ» в Нижегородской области.

Задачи исследования:Усовершенствовать структуру и алгоритм работы «Школы ХМЛ» для оптимизации терапии пациентов с ХМЛ Провести сравнительное исследование мониторинга и оценки ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ до и после внедрения «Школ ХМЛ» в Нижегородской обл.

Оценить результаты терапевтического лекарственного мониторинга у пациентов с подозрением на некомплаентность при лечении ХМЛ в рамках «Школ ХМЛ» и оптимизировать терапию по полученным результатам.

Оценить результаты анкетирования пациентов в рамках «Школ ХМЛ» при динамическом наблюдении согласно временным критериям ELN Определить сопоставимость результатов анкетирования по опроснику «Приверженность терапии» (субъективная оценка) с результатами терапевтического лекарственного мониторинга (объективная оценка) у пациентов ХМЛ в Нижегородской области.

Материалы и методы: Исследование проведено на базе НОКБ им.

Семашко, г. Нижний Новгород, и на базе ГБУЗ НО «БСМП» г. Дзержинск с 2006-2010 гг.

Демографические характеристики исследуемых пациентов: в исследовании приняли участие 171 пациент,женщины-88 чел, мужчины-83чел,медиана возраста- 63,93,средняя длительность заболевания-64 мес.,средняя длительность терапии иматинибом-48, мес.

Вссем пациентам выполнялись: Цитогенетический анализ костного мозга (Получение препаратов хромосом человека из клеток костного мозга и проведение цитогенетического исследования).

Молекулярно-биологическое исследование крови(выявление и количественное определение мРНК химерного гена bcr-abl и мРНК гена abl в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) Высокоэффективная жидкостная хроматография с детекцией методом тандемной массспектрометрии (ВЭЖ Х / М С / МС).

Для оценки эффективности внедрения «Школы ХМЛ» в Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" Нижегородской области нами проведен анализ регулярности мониторинга и ответа на терапию иматинибом, в качестве первой линии (т.е. до 6 мес. после установления диагноза ХМЛ), у пациентов с установленным диагнозом ХМЛ, которые регулярно (1 раз в 3 месяца) посещали школы-семинары в период с 01 января 2008 года до 01 января 2012 года (Вторая группа). Группа сравнения - пациенты с впервые установленным диагнозом ХМЛ, которым был назначен иматиниб в качестве первой линии терапии (т.е. до 6 мес. после установления диагноза ХМЛ) в период с 01 января 2005 до 31 декабря 2007, с которыми не проводились семинары в рамках «Школы ХМЛ» (Первая группа). На момент исследования пациенты обеих групп сравнения получали иматиниб более 18 мес.Первую группу составили 44 пациента, мужчины - 20 чел. (45,45%), женщины - 24 чел. (54,55 %). Возраст пациентов от 2 лет до 72 лет, средний возраст - 45,35 лет Вторую группу составили 50 пациентов, мужчины - 23 чел. (46%), женщины - 27 чел.

(54%). Возраст пациентов от 14 до 82 лет. Средний возраст – 47, лет.Оценка эффективности терапии проводилась в соответствии с критериями ELN 2006/2009. Результаты динамики мониторинга на терапию иматинибом пациентов ХМЛ до внедрения «Школы ХМЛ» и в рамках «Школы ХМЛ» в периоды 6, 12 и 18 месяцев наблюдения представлены в таблице Таблица 1. Динамика мониторинга ответа на терапию иматинибом в группах 1 и 2 в периоды наблюдения 6, 12 и 18 мес. согласно критериям ELN Мониторинг «+» Мониторинг «-»

Период Вторая Вторая Первая Первая наблюдения группа группа группа (n=44) группа (n=44) (n=50) (n=50) 10 чел. 47 чел. 34 чел. 3 чел.

6 месяцев (22,72%) (94%) (77,28%) (6%) 49 чел. 1 чел.

12 месяцев 26 чел. (59%) 18 чел. (41%) (98%) (2%) 29 чел. 50 чел. 15 чел. 0 чел.

18 месяцев (65,9%) (100%) (34,1%) (0%) Кроме этого, нами проведен терапевтический лекарственный мониторинг ( исследование концентрации иматиниба в плазме крови) у пациентов с ХМЛ. При приеме иматиниба в дозах 300-800 мг однократно в сутки из 42 пациентов с диагнозом ХМЛ-ХФ у 23 отмечена неудача терапии и у 6 пациентов - субоптимальный ответ, согласно критериям ELN-2009, у всех пациентов было подозрение на некомплайнс. Было Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" проведено исследование остаточной концентрации иматиниба в плазме крови методом ВЭЖХ/МС/МС до проведения занятий в рамках «Школы ХМЛ» и после. По результатам первого определения концентрации иматиниба 6 пациентам (14,29%) эскалировали дозу с 300 до 400 мг/сут.

(n=1), c 400 до 600 мг/сут. (n=5), а с 35 пациентами (83,33%) было проведено только занятие в рамках «Школы ХМЛ» о необходимости соблюдения режима терапии. По результатам определения концентрации все пациенты были разделены на 4 квартиля: Q1 ( нг/мл), Q 2 (647-1170 нг/мл), Q 3 (1170-2000 нг/мл) и Q 4 (2000 нг/мл).

Динамику концентрации оценивали в каждом квартиле.

Нами разработаны мондификации "Школ ХМЛ": каждая "Школа ХМЛ" имеет образовательную, диагностическую и терапевтическую части.Выделяются группы пациентов для проведения "Школ ХМЛ":

пациенты с впервые установленным диагнозом, пациенты, получающие иматиниб до 18 мес., пациенты, получающие иматиниб более 18 мес. и имеющие оптимальный ответ на лечение, пациенты, получающие иматиниб более 18 мес. и не имеющие оптимального ответа на лечение.

С целью оценки качества жизни,нами проведено анкетирование пациентов с ХМЛ в разные периоды лечения и последующий анализ составляющих качества жизни. Нами были опрошены 25 пациентов в разное время от момента установления диагноза ХМЛ (до начала лечения, через 3, 6, 12, 18 мес. от начала терапии). Так как, опрашивались несколько раз одни и те же больные, но в разные периоды времени от момента установления диагноза и начала терапии, то тип выборки может быть определен как связанный. Всего проанализировано 115 анкет по оценке качества жизни.

Нами разработаны и внедрены в практику анкеты, позволяющие определить приверженность терапии у пациентов с ХМЛ на различных этапах лечения.

Результаты: Уровни ответа на терапию значительно различаются у пациентов,посещающих ( группа 2) и не посещающих( группа1) «Школы ХМЛ». В первой группе к 6 мес. терапии оптимальный ответ на лечение имели 4 человека, что составило 9,09% от всех пациентов этой группы, субоптимальный ответ имели 3 человека (6,81 %), неудача терапии зарегистрирована у 3 чел. (6, 81 %). Во второй группе оптимальный ответ через 6 мес. лечения имели 41 человек (82%), субоптимальный ответ имели 3 чел. (6%), неудача терапии зарегистрирована у 3 человек (6 %). Аналогичные показатели получены и в другие периоды наблюдения.

В Таблице 2 представлена Оценка ответов на терапию в группах 1 и Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" в периоды наблюдения 6, 12, 18 месяцев.

Таблица 2. Оценка ответов на терапию в группах 1 и 2 в периоды наблюдения 6, 12, 18 месяцев Оптимальный Субоптимальный Неудача терапии ответ ответ Период наблю-дения Группа Группа Группа 1 Группа 2 Группа Группа 1 (n=44) 2 (n=50) (n=44) (n=50) 1 (n=44) 2 (n=50) 4 41 3 3 3 6 месяцев (9,1%) (82,0%) (6,8%) (6,0%) (6,8%) (6,0%) 4 36 8 6 14 12 месяцев (9,1%) (72,0%) (18,2%) (12,0%) (31,8%) (14,0%) 11 31 3 9 15 18 месяцев (25%) (62,0%) (6,8%) (18,0%) (34,1%) (20,0%) При оценке результатов терапии по результатам терапевтического лекарственного мониторинга в группе 1 (улучшение) получена следующая динамика концентрации: в Q1 у 9 (25,71%) пациентов при первом определении и 0 (0%) при повторном определении;

в Q2 у 7 (20%) и 5 (14,29%) пациентов соответственно;

в Q 3 у 0 (0%) и 8 (22,86%) пациентов соответственно;

в Q 4 у 0% и 3 (8,57%) пациентов соответственно. В группе 2 (ухудшение) наблюдалась обратная динамика:

в Q 1 у 0 (0%) пациентов при первом определении и 3 (8,57%) при повторном определении;

в Q 2 у 3 (8,57%) и 4 (11,43%) пациентов соответственно;

в Q3 у 1 (2,86%) и 0 (0%) пациентов соответственно;

в Q у 2 (5,71%) и 1 (2,86%) пациентов соответственно. В группе 3 (без динамики) колебаний концентрации не отмечено: в Q 1 у 2 (5,71%) пациентов при первом определении и 1 (2,86%) при повторном определении;

в Q2 у 4 (11,43%) и 5 (14,29%) пациентов соответственно;

в Q3 у 4 (11,43%) и 4 (11,43%) пациентов соответственно;

в Q4 у 1 (2,86%) и 1 (2,86%) пациентов соответственно.

Проанализировав результаты опросов по параметрам «Качество жизни»(КЖ),мы отметили, что на фоне пролонгации терапии, улучшаются нарушенные до начала терапии показатели КЖ: так, если до начала терапии 100% пациентов отмечали, что чувствуют себя « измученными, уставшими», то через 3 мес. терапии процент таких пациентов снизился до 64%, через 6 мес.- до 8 %, а к 12 мес. составил 4%.КЖ восстанавливалось на фоне терапии следующим образом: в 3 мес.

лечения 20% пациентов уже чувствовали себя «бодрыми, полными сил и энергии», в 6 мес. этот показатель составил 52%, в 12 мес. - 76%, в мес. - 60%. Процент пациентов, которые чувствуют себя «спокойно, умиротворенно» также увеличивался по мере продолжения терапии и Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" составил: в 3 мес. - 16%, в 6 мес. - 40%, в 12 мес. - 20%, в 18 мес. - 36% пациентов.

При оценке приверженности терапии по результатам анкетирования выявлено снижение приверженности терапии,начиная с 12 мес.лечения.

Выводы: Пациенты, посещающие проводимые семинары в рамках «Школы ХМЛ», мониторировались регулярнее и своевременнее, чем пациенты, которые начали лечение до проведения Школ ХМЛ Пациенты, регулярно посещающие Школы ХМЛ, имеют значительно лучшие ответы на терапию в 6, 12, 18 мес.

Результаты проведенного нами исследования подтверждают, что терапевтический диапазон иматиниба находится в пределах 1000- нг/мл. Проведение образовательных бесед в рамках «Школы ХМЛ»

оказывает положительное влияние повышение приверженности терапии и способствует оптимизации терапии пациентов с ХМЛ по результатам определения концентрации иматиниба в плазме крови.

Терапевтический лекарственный мониторинг концентрации иматиниба в плазме пациента с ХМЛ полезен для контроля за комплаентностью пациента с целью своевременной коррекции терапии.

Показатели физической и психологической составляющей здоровья улучшаются у пациентов на фоне пролонгации терапии иматинибом.

Приверженность к терапии уменьшается по мере пролонгации терапии.

Практические рекомендации:

1. После верификации диагноза ХМЛ необходимо как можно раньше ( в течение первых з-х мес. после установления диагноза) приглашать пациентов на «Школы ХМЛ.

2. Оптимальным является проведение «Школ для пациентов ХМЛ»

1 раз в 3 мес.

3. Целесообразно выделение следующих «потоков» пациентов:

Первичные пациенты (диагноз был установлен в ближайшие 3 мес.) r Пациенты, принимающие имтиниб менее 18 мес r Пациенты, получающие иматиниб более 18 мес. и имеющие r оптимальный ответ на лечение Пациенты, получающие иматиниб более 18 мес. и не имеющие r оптимального ответа на лечение.

4. Практически оправданным является сочетание в работе каждой «Школы ХМЛ» следующих частей: образовательной, диагностической и терапевтической.

5. Внедрение «Дневников для пациентов с ХМЛ» способствует Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" продуманному, планомерному и последовательному подходу к лечению и мониторингу у каждого пациента с ХМЛ.

6. Терапевтический лекарственный мониторинг (определение концентрации иматиниба в плазме крови) имеет важное значение для пациентов с низкой приверженностью терапии, с целью выявления истинной и ложной резистентности к терапии.

7. Проведение анкетирования пациентов в различные моменты лечения (после установления диагноза, через 3 мес., 6 мес., 12 мес., 18 мес.

терапии) при посещении «Школ ХМЛ», имеет большое практическое значение:

Анкетирование по модифицированному опроснику «Качество r жизни» позволяет выявить и проанализировать трудности, возникающие у пациента на каждом этапе лечения и продумать план их предупреждения.

Анкетирование по опроснику «Приверженность терапии»

r позволяет оценить приверженность терапии на разных этапах лечения и выявить причину снижения приверженности в каждом конкретном случае. В дальнейшем это помогает врачу в работе с пациентом (беседы о причинах низкой приверженности носят адресный характер, повышая мотивацию к лечению и ответственность пациента).

Литература 1. Caspersson T.,Zech L.,Jphasson C.//Exp.Cell Res.-1970.-Vol.62.-P.490-492.] 2. Druker B.J For the IRIS Study Group.//Program/Proceedings ASCO.-2002.-Vol.21,part I.-P 1a,№ 1.

3. Cortes J.E., Talpaz M.,Giles F.,et.al.// Blood.-2003.-Vol.101.-P.3794-3800.

4. Новик А.А.,Ионова Т.И. Руководство по исследованию качества жизни в медицине.-М.: «Олма»,2007.- 313 с.

5. Новик А.А.,Ионова Т.И.,Кнайд П.Концепция исследования качества жизни.- Спб.: «Элби», 1999.-140 с.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ОСОБЕННОСТИ ЛОКАЛИЗАЦИИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ХОДЕ ПАССАЖА НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ Сибгатуллина Г.В., Румянцева Н.И.

КИББ КазНЦ РАН kam-guz@yandex.ru Введение. Ранее нами было показано, что неморфогенные каллусы гречихи, полученные в виде клонов на стабильном морфогенном каллусе, характеризуются увеличением содержания перекиси водорода и продукта перекисного окисления липидов малонового диальдегида по сравнению с исходными морфогенными культурами (Камалова с соавт., 2009). Исходя из этого, можно было предположить, что неморфогенные культуры гречихи татарской находятся в состоянии окислительного стресса. Тем не менее, с помощью электронной микроскопии мы не обнаружили признаков окислительного стресса в клетках неморфогенных каллусов (локализация перекиси водорода в вакуоли, на тонопласте и органеллах). Изучение цитохимической реакции перекиси водорода с хлористым церием показало, что перекись водорода в этих культурах локализована в клеточных стенках и межклетниках. Известно, что активные формы кислорода (АФК) играют значительную роль в регуляции многих клеточных процессов (Тарчевский, 2002), в том числе в регуляции пролиферации (Droge et al., 2002). Поэтому в дальнейшем представляло интерес более детальное изучение локализации АФК в клетках, что позволило бы оценить их функции и источники образования в каллусных культурах гречихи, характеризующихся высоким содержанием перекиси водорода и высокой пролиферативной активностью.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении локализации активных форм кислорода в клетках неморфогенного каллуса гречихи татарской в течение культурального цикла.

Исследования были проведены на неморфогенном каллусе гречихи татарской. Для визуализации АФК был использован флуоресцентный краситель дигидрородамин 123 (DHR 123). DHR 123 способен взаимодействовать с такими АФК как перекись водорода, пероксильный радикал и пероксинитрит (Crow, 1997;

Abele et al., 2002) с образованием флуоресцирующей формы - родамина. При этом существуют данные, Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" указывающие на преимущественное взаимодействие DHR 123 с перекисью водорода (Qin et al., 2008). Abele et al (2002) было отмечено, что DHR 123, в отличие от другого широко используемого красителя 2,7-дихлорфлуоресцеин диацетата, способен проникать через мембраны митохондрий, что позволяет оценивать общее содержание цитозольных и митохондриальных АФК.

Материалы и методы. В работе использовали неморфогенный каллус гречихи татарской (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn.). Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26 ± 2°С в темноте на каллусогенной среде RХ (Румянцева и др., 1989), содержавшей минеральные соли среды Гамборга В5 (Gamborg et al., 1968) с добавлением 2 мг/л тиамина-HCl, 1 мг/л пиридоксина-HCl, 1 мг/л никотиновой кислоты, 2 г/л гидролизата казеина, 2 мг/л 2,4-Д, 0.5 мг/л ИУК, 0.5 мг/л нафтилуксусной кислоты, 0.2 мг/л кинетина. Каллусы пересаживали через каждые 2 недели.

Локализацию АФК проводили с помощью флуоресцентного красителя дигидрородамина 123 (DHR 123) как описано у Булгакова с соавт. (2008).

Сток-раствор DHR 123 готовили на DMSO. Рабочий раствор красителя ( мкМ) готовили, используя PBS (рН 7.0). Образцы помещали в краситель и оставляли в темноте при комнатной температуре на 10 мин. Далее образцы троекратно промывали в PBS. Готовые препараты отсматривали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Axiovert 200M (Сarl Zeiss), фотографировали с помощью камеры AxioCam Hrc (Сarl Zeiss) и анализировали, используя программный пакет AxioVision 4.8 (Сarl Zeiss).

Результаты и обсуждение. Использование флуоресцентного красителя выявило несколько вариантов внутриклеточной локализации АФК (рис. 1). АФК были визуализированы в виде очагов флуоресценции в клеточной стенке, в виде отдельных точек и их скоплений в цитоплазме, а также локализованы в области ядер. При этом мы наблюдали два варианта локализации АФК в области ядер: либо тонкий слой равномерного свечения вокруг ядра, либо в виде мелких точек по всей области ядра.

Тот или иной тип локализации АФК был характерен для определенных суток культивирования. Так, на первые и последние сутки пассажа отмечалась преимущественная локализация АФК в виде очагов флуоресценции чаще на внутренней стороне клеточной стенки, реже – в цитоплазме.

На 3-и сутки культивирования отмечалась локализация АФК в виде мелких точек в цитоплазме. Такие мелкие флуоресцирующие частицы в Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" литературе описываются как митохондрии (Булгаков с соавт., 2008). В это же время появлялось свечение вокруг ядер.

На 7-е сутки культивирования обнаруживали более интенсивное свечение в клеточных стенках и локализацию АФК в виде точек по всей области ядер.

Следует отметить, что для неморфогенных каллусов гречихи татарской, как и для большинства недифференцированных каллусов и суспензий клеток, характерно синхронное деление клеток в начальный период культурального цикла (максимум митотического индекса на 3-4-е сутки), далее митотическая активность снижается, и клетки переходят в фазу растяжения и затем гибнут (Тимофеева, Румянцева, 1998).

Известно, что в процессах разрыхления и ограничения роста клеточных стенок могут участвовать АФК (Lin, Kao, 2001;

Fry, 1998). При этом разрыхление может происходить вследствие неферментативного разрушения полисахаридов, вызванного действием гидроксил радикала, образуемого в ходе реакции Фентона между апопластной Н2О2 и ионами металлов (железа или меди), содержащимися в клеточных стенках (Fry, 1998). Можно предположить, что обнаруженное нами усиление флуоресценции в клеточных стенках на 7-е сутки культивирования связано с переходом в фазу растяжения, сопровождающуюся процессами разрыхления клеточных стенок. Источником АФК в клеточных стенках в этом случае может являться НАДФН-оксидаза.

Наибольший интерес представляет обнаруженная нами локализация АФК в области ядер. На клетках животных показано, что в условиях гипоксии митохондрии могут перемещаться к ядру, что приводит к накоплению АФК в ядрах и вызывает окислительные модификации редокс-зависимых промоторов (Al-Mehdi et al., 2012). Murphy (2012) отмечает, что такой механизм регуляции может иметь место в ответ не только на гипоксию, но и на другие сигналы. На растениях к настоящему моменту подобные исследования проведены не были. Вместе с тем, известно, что регуляция разборки ядерной оболочки осуществляется протеинкиназами (Rose et al., 2004), активность которых может регулироваться с помощью перекиси водорода (Rhee et al., 2000). Таким образом, локализация в области ядра АФК, источником которых являются митохондрии, может быть необходима как для регуляции экспрессии генов, так и для изменения активности протеинкиназ. Оба этих процесса могут являться необходимыми для пролиферации клеток.

Следует отметить, что локализацию АФК в области ядер мы наблюдали в период активных делений (максимум делений на 4-е сутки), тогда как в фазу растяжения флуоресценцию наблюдали преимущественно в Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" клеточных стенках. Таким образом, нами было установлено, что в клетках неморфогенного каллуса происходит изменение локализации АФК в ходе пассажа. И эти изменения коррелируют с фазами культурального цикла неморфогенного каллуса.

Рис. 1. Локализация АФК в клетках неморфогенного каллуса: а) в клеточной стенке, б) вокруг ядра, в) в виде точек по всей поверхности ядра Работа поддержана грантом РФФИ № 12-04-31006.

Литература 1. Камалова Г.В., Акулов А.Н., Румянцева Н.И. // Биохимия. – 2009. – Т.74, вып. 6. – с. 842-852.

2. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. М.: Наука, 2002.– 294с.

3. Crow J.P. // Nitric oxide. – 1997. – vol. 1. – p. 145-157.

4. Abele D., Heise K., Portner H.O., Puntarulo S. // J. Exper.Biol. – 2002. – p.

1831 – 1841.

5. Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.В. и др. // Физиология растений. – 1989. – Т.36, №1. – С.187-194.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" 6. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima R. // Exp. Cell Res. - 1968. - vol. 50. - p.

151-158.

7. Qin Y., Lu M., Gong X. // Cell Biology International. - 2008, vol. 32. - p.

224-228.

8. Droge W. // Physiol Rev. – 2002. – vol. 82. – p. 47 – 95.

9. Bulgakov V.P., Aminin D.L., Shkryl Y.N. et al. // MPMI. - 2008, vol. (12). - p. 1561-1570.

10. Lin C.L., Kao C.H. // Plant Soil. – 2001. – Vol. 230. – P. 135-143.

11. Fry S.C. // Biochem. J. – 1998. – Vol. 332(Pt 2). – p. 507-515.

12. Al-Mehdi A-B., Pastukh V.M., Swiger B.M. et al. // Science Signaling. 2012, vol. 5 (231). - p. 47-57.

13. Murphy M.P. // Science Signalingю - 2012, vol. 5 (242). - p. 39- 14. Тимофеева О.А., Румянцева Н.И. Морфологические и физиологические особенности каллусных и суспензионных культур растений / Казань, 1998. – 31 с.

15. Rhee S.G., Bae Y.S., Lee S.R., Kwon J. // Sci STKE – 2000. – vol. 53. – p.1.

16. Rose A., Patel S., Meier I. // Planta – 2004. – vol. 218. – p. 327-336.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ХАРАКТЕРИСТИКА АПОПТОЗА И АУТОФАГИИ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ Скибо Ю. В., Абрамова З.И.

Казанский (Приволжский) федеральный университет yuliya_ksu@mail.ru Для полноценного и правильного развития и морфогенеза в многоклеточном организме существуют различные пути гибели клеток (Penaloza, 2006). Апоптоз, или программированная смерть клетки по типу I, является звеном многих биологических процессов у многоклеточных организмов (Green, 2009). Он связан с процессом развития и старения клеток, выполняя гомеостатическую функцию удаления поврежденных клеток (Мамонтова, 2005).

В ходе исследований программы апоптоза, стало ясно, что этот путь самоуничтожения клеток не уникален, и кандидатом на роль еще одного механизма гибели стала система аутофагии. Аутофагия происходит в большинстве тканей, способствует удалению цитоплазматических компонентов и может быть вызвана изменением внешних и внутренних условий, таких как истощение питательных веществ (Levine, 2004).

Аутофагия также может быть механизмом гибели (гибели клеток по типу II).

Бронхиальная астма является одним из заболеваний, в развитии которого установлено усиление выживаемости Т-лимфоцитов и утрата ими способности к апоптозу. Устойчивость Т-лимфоцитов к ПКГ I типа может быть связана с тем, что происходит переключение с апоптоза на аутофагию.

Целью настоящей работы является исследование роли апоптоза и аутофагии Т-лимфоцитов на развитие тяжести атопической бронхиальной астмы (АБА).

В работе было проведено изучение основных биохимических проявлений апоптоза Т-лимфоцитов, которые протекают в митохондриях и в ядре. Исследование показало, что этот процесс идет по-разному в зависимости от степени тяжести АБА. В качестве стимулирующего агента мы использовали дексаметазон.

Экспериментальное изучение показало, что на 3 сутки дексаметазон оказывал индуцирующее воздействие на апоптоз в группе с легкой Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" астмой, а на 6 сутки в группе с тяжелой формой астмы.

Поскольку были получены противоречивые данные относительно поведения Т-лимфоцитов больных АБА в культуре с дексаметазоном, на следующем этапе работы было необходимо изучить другой тип ПКГ – аутофагию, и влияние дексаметазона на данный процесс.

В результате исследований мы установили, что большая часть Т-лимфоцитов здоровых доноров обладает морфологией, соответствующей апоптотическим изменениям на ранней стадии процесс. Культивирование с дексаметазоном привело к стимуляции поздних этапов апоптоза, что согласовывалось с результатами биохимических исследований апоптоза.

Анализ микрофотографий Т-лимфоцитов больных легкой формой АБА показал, что большая часть клеток сохраняет типичную морфологию пролиферирующих клеток. Но при этом обнаружены крупные аутофагасомы. Помимо лимфоцитов с вышеописанными морфологическими признаками были обнаружены фрагменты погибших клеток, в которых большая часть содержимого представлена аутофагосомами. Это может свидетельствовать о том, что гибель клеток была опосредована запуском ПКГ по типу II или аутофагической гибели, а не апоптотической. Культивирование с дексаметазоном сказывалось на стимулировании ранних этапов апоптоза и ингибировании аутофагии.

В группе больных тяжелой формой АБА наряду с характерными признаками ранних и поздних этапов апоптоза было отмечено повышенное содержание вакуолей и аутофагасом. Культивирование с дексаметазоном способствовало интенсивной активации аутофагии.

Одновременно с аутофагией активируется апоптоз.

LC3B белок является специфическим маркером аутофагии, экспрессирующийся на активированной мембране аутофагосомы. В результате проведенных исследований мы установили наличие экспрессии этого белка в Т-лимфоцитах больных как с легкой, так и с тяжелой формой АБА, однако их количество и интенсивность экспрессии белка выше в группе больных с тяжелой формой АБА.

Результаты иммуноблоттинга согласовывались с результатами электронной и флуоресцентной микроскопий.

Подводя итог по полученным результатам можно сказать, что стрессовые условия влияют на активацию аутофагии в Т-лимфоцитах больных АБА, в отличие от здоровых доноров. Но проявления аутофагии были различными в зависимости от тяжести астмы. В группе с легкой формой АБА изначально в Т-клетках активируется аутофагия и затем переходит в ПКГ II типа (аутофагическую гибель). В группе с тяжелой Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" формой астмы апоптоз и аутофагия активировались одновременно.

Литература 1. Мамонтова, Т.В. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы / Т.В. Мамонтова, И.П.

Кайдашев // Аллергология. – 2005. - № 4. – С: 15-23.

2. Green, D. R. Immunogenic and tolerogenic cell death / D. R. Green, T.

Ferguson, L. Zitvogel, G. Kroemer // Nat Rev Immunol. – 2009. – V. 9. – P:

353-363.

3. Levine, B. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy / B. Levine, D. J. Klionsky // Dev Cell. – 2004. – V.6. – P: 463-477.

4. Penaloza, C. Cell death in development: shaping the embryo / C. Penaloza, L. Lin, R. A. Lockshin, Z. Zakeri // Histochem Cell Biol. – 2006. – V. 126. – P: 149-158.

Интернет-конференция "Актуальные проблемы биохимии" ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G СЫВОРТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИИ С НЕГАТИВНОЙ СИМПТОМАТИКОЙ Смирнова Л.П, Паршукова Д. А., Фаттахов Н. С., Кострикина И. А., Бородюк Ю.Н., Иванова С.А.



Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 9 |
 





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.