авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН

НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИИ РАН

РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО»

V МОЛОДЕЖНАЯ ШКОЛА–КОНФЕРЕНЦИЯ

С МЕЖДУНАРОДНЫМ УЧАСТИЕМ

«АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ»

ТЕЗИСЫ

26 – 27 ОКТЯБРЯ 2009 г.

Москва – 2009 СЕКЦИЯ I РАЗНООБРАЗИЕ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА KRIBBELLA А. Н. Автух1, Н. В. Присяжная2, Н. В. Василюк2, А. С. Шашков3, Н. Г. Винокурова1, Ф. М. Хасаева2, Л. М. Барышникова1 1 Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва, Россия Род Kribbella принадлежит к семейству Nocardioidaceae порядка Actinomycetales.

Представители разных видов рода Kribbella образуют воздушный и разветвленный субстратный мицелий с тонкими гифами, содержат LL-диаминопимелиновую кислоту в клеточной стенке и имеют высокую степень сходства по 16S рРНК (до 99,5%). От видов рода Nocardioides криббеллы отличаются наличием фосфатидилхолина в составе фосфолипидов и менахинонами МК-9(Н4).

В работе использовали 15 штаммов актиномицетов, выделенных из образцов почв и лиственного опада различных районов Центральных областей РФ, Кавказа и Урала.

Изученные штаммы имели 97–99% сходства нуклеотидных последовательностей 16S рРНК генов между собой и с типовыми штаммами известных видов рода.

Результаты исследования морфологических, хемотаксономических и физиолого биохимических характеристик (рост на различных источниках углерода, разложение сложных органических соединений, рост при различных значениях pH, температуры, концентрации солей, рост в аэробных и анаэробных условиях), а также масс спектрометрический анализ пептидов (MALDI–TOF) позволяют предполагать, что изученные штаммы относятся не менее чем к 7 новым видам рода Kribbella. Штаммы потенциально новых видов характеризуются уникальным сочетанием физиолого биохимических признаков, необычным составом полисахаридов клеточных стенок, в состав которых входят псевдаминовая кислота (5,7-диамино-3,5,7,9-тетрадеокси-L-глицеро-L манно-нонулозоновая кислота), бутират, мадуроза (3-O-метил-D-галактоза), 2,3-ди-O-метил D-галактоза и др., а также набором полярных липидов, включающих неописанные ранее компоненты. Вопрос о видовой принадлежности штаммов будет решен на основании сопоставления полученных фенотипических характеристик и данных ДНК-ДНК гибридизации геномной ДНК.





РАСТЕНИЯ КАК ВОЗМОЖНЫЕ РЕЗЕРВУАРЫ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА БАКТЕРИЙ А. Л. Алексеенко, Ю. А. Маркова, И. А. Граскова, Ю. В. Омеличкина, Т. Н. Шафикова, А. С. Романенко Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, Россия В природных условиях растения вынуждены существовать с огромным количеством различных видов микроорганизмов. Некоторые из них способствуют росту и урожайности растений, другие являются патогенами. Среди такого разнообразия обнаруживаются и патогенные для человека бактерии, которые могут попадать в растение через поливную воду, удобрение, руки рабочих, а также сохраняться в семенах и реализовывать свой патогенный потенциал в следующих поколениях [1, 2]. Это, главным образом, касается энтеробактерий, вызывающих вспышки кишечных заболеваний во многих странах мира.

В связи с этим, целью наших исследований стало изучение особенностей колонизации растений картофеля in vitro Escherichia coli (E. coli) (штамм XL-1Blue), а также выявление ответных реакций растений картофеля Solanum tuberosum и табака Nicotiana tabacum на внедрение этого микроорганизма. Исследования по взаимодействию Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Cms) (штамм CsR14), вызывающей кольцевую гниль клубней картофеля, с растениями картофеля, ведется в лаборатории фитоиммунологии СИФИБР СО РАН много лет, что определило выбор объекта для сравнения с E. coli.

При изучении особенностей колонизации E. coli картофеля in vitro было установлено, что бактерии уже через сутки достигали верхушки растения. Интересным моментом было то, что бактерии не вызывали симптомы болезни (некрозы, хлороз листьев), в то время как зараженные растения отставали в росте по сравнению с контрольными [3]. Результаты определения динамики активности пероксидазы у картофеля показало, что в корнях защитная реакция наступает через 15 минут после заражения. Особый интерес представляют результаты, полученные при исследовании активности пероксидазы верхушечной части стебля растения. Ее изменение через 15-30 минут после заражения как Cms, так и E. coli, когда микроорганизмы еще не успели распространиться по растению, свидетельствует о системной защитной реакции растения.

Для наблюдения генерации активных форм кислорода (АФК) в ходе взаимодействия растения с патогеном удобной модельной системой служит суспензионная культура клеток.

Для эксперимента использовалась суспензионная культура картофеля сорта Жуковский ранний. Пик образования АФК при инокуляции E.coli приходился на 40 минут после заражения. При взаимодействии с Cms через 40 минут уровень H2O2 также возрастал, но при этом его количество было примерно в два раза меньше. Таким образом, образование АФК у картофеля при взаимодействии с E. coli происходит более интенсивно, чем с Cms. Возможно, это связано с неспецифическим окислительным «взрывом», который возникает при несовместимых взаимодействиях.



При заражении суспензионной культуры клеток табака E. coli и Cms наблюдалось двухфазное повышение уровня АФК, причем при первом повышении концентрация в обоих вариантах была практически одинакова. Такое повышение уровня АФК, по-видимому, связано с неспецифическим «взрывом», так как ни для одной из исследуемых бактерий табак не является хозяином.

Для выяснения действия E. coli также использовали растения табака in vitro. Ранее в нашей лаборатории было показано, что Cms вызывала локальные некрозы на листьях табака.

Представляло интерес исследовать реакции табака при заражении E. coli. Листья растений инокулировали бактериальной суспензией. Спустя 5 дней после нанесения капли бактериальной суспензии E. coli на поверхность листовой пластинки табака, некротических пятен не наблюдалось. В варианте с предварительно зараженным Cms табаком, а затем инокулированным E. coli через 5 дней обнаруживались значительные некрозы в местах нанесения E. coli. Возможно, такая реакция связана с развитием у растения системного ответа.

Таким образом, патогенная для человека Escherichia coli способна проникать и распространяться в растении картофеля. В свою очередь растение системно реагирует на вторжение данного микроорганизма. Возникает ответная реакция в виде окислительного «взрыва», причем по сравнению с окислительным «взрывом», возникающим в ходе совместимых взаимодействий фитопатогенной бактерии с растением-хозяином он более выражен. По сравнению с окислительным «взрывом» несовместимых взаимодействий, его интенсивность практически не отличалась.

1. Guo, X., J. Chen, R. E. Brackett, L. R. Beuchat. 2001. Survival of salmonellae on and in tomato plant from the time of inoculation at flowering and early stages of fruit development through fruit ripening // Appl.Environ. Microbiol. V.68. P.4760-4764.

2. Ingham S. C., Losinski J.A., Andrews M.P., Breuer J.E., Breuer J.R., Wood T.M., T.H.

Wright. 2004. Escherichia coli Contamination of Vegetables Grown in Soils Fertilized with Noncomposted Bovine Manure: Garden-Scale Studies // Appl. and Environ.

Microbiology, V.70. No. 11. P. 6420-6427.

3. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Алексеенко А.Л., Саляев Р.К. Колонизация растений картофеля in vitro условно-патогенной бактерией Escherichia coli ApPTZ19 // Доклады РАН. 2008. Т. 420. № 2. С. 279 – 281.

ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ С. А. Аленькина1, О. И. Наконечная2, Матора Л.Ю.1, В. Е. Никитина Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Саратовский государственный университет, Саратов, Россия К настоящему времени многие аспекты функционирования ассоциативных симбиозов остаются неясными и неизученными, что тормозит процесс понимания и осмысления этого интереснейшего явления природы. К числу совершенно не изученных вопросов относится вопрос о молекулярных сигналах, лежащих в основе формирования и успешного функционирования ассоциативного симбиоза. Неясным является вопрос о том, как влияют макропартнер и микропартнер друг на друга.

В этой связи большой интерес представляют лектины, т.к. известно, что они выполняют информационные функции в различных биологических системах. В частности, в ассоциации пшеница-азоспирилла интересны в этом отношении лектины азоспирилл.

Ранее с поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности Azospirillum brasilense Sp7.2.3 были выделены лектины, являющиеся гликопротеинами с молекулярной массой 36 кDa, проявляющие специфичность к L-фукозе и к D-галактозе. Лектин мутантного штамма имел структурные и антигенные различия с лектином родительского штамма [1]. Было показано, что лектины азоспирилл способны не только осуществлять наряду с другими факторами адгезию - "заякоривание" белков на мембранах растительной клетки, но также стимулировать прорастание семян, проявлять по отношению к растительной клетке митотическую и ферментмодифицирующую активности [2, 3]. Все эти факты позволили предположить, что лектины азоспирилл могут играть роль вещества-сигнала для растительной клетки.

Ответом на многие биотические и абиотические воздействия может быть резкое увеличение образования растительными клетками перекиси водорода. Синтез перекиси водорода – один из наиболее быстрых ответов растительной клетки на индуцирующие воздействия. Считается, что основным источником перекиси водорода в клетках растений является дисмутация молекулы кислорода, катализируемая супероксиддисмутазой. Однако в последнее время большой интерес вызывают альтернативные пути образования перекиси водорода с помощью пероксидазы и оксалатоксидазы. Среди индукторов, способных вызывать быструю продукцию Н2О2 в клетках растений, наиболее хорошо исследована активность гликопротеинов, входящих в состав клеточных стенок многих фитопатогенных организмов[4]. Для оценки способности лектинов A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A. brasilense Sp7.2.3 индуцировать активность пероксидазы и оксалатоксидазы в корнях проростков пшеницы были взяты корни 3-х суточных проростков пшеницы Саратовская 29. Об активности ферментов судили по интенсивности окисления ОФД. Как показали результаты исследований, лектины обоих штаммов во всех изучаемых концентрациях (оценивали три концентрации – 10, 20 и 40 мкг/мл) вызывали увеличение активности пероксидазы, но только в том случае, когда время выдерживания корней с лектинами составляло 20 мин (изучались временные интервалы 10 и 20 мин). Самой эффективной концентрацией для обоих лектинов явилась концентрация 40 мкг/мл. Лектин родительского штамма вызывал увеличение пероксидазной активности в большей степени, чем лектин мутантного штамма. 10-минутная обработка корней проростков растений препаратами лектинов вызывала активацию оксалатоксидазы. Лектины родительского и мутантного штамма проявляли различия. Если лектин родительского штамма при указанной экспозиции вызывал эффект при концентрации 10 мкг/мл, лектин же мутантного штамма – при 20 мкг/мл. Так, активность для родительского и мутантного штаммов составила через мин после инициации реакции 11,2 ± 1,3 и 7,2 ± 0,5 ед. на 1 г сырой массы, соответственно, в контрольных проростках, т.е. не инкубированных с лектинами она была 6,0 ± 0,2 ед.

К настоящему времени накоплен большой экспериментальный материал о функционировании аденилатциклазной сигнальной системы в растениях. Аденилатциклазная сигнальная система участвует в формировании функциональных и структурных ответов организма на внешние раздражители. Об активности данной системы преимущественно судят по количеству эндогенного цАМФ. Влияние лектинов родительского и мутантного штаммов на изменение содержания ц-АМФ в клетках корней проростков изучали методом иммуноферментного анализа. В результате было показано, что лектин родительского штамма вызывал снижение концентрации цАМФ в растительных клетках на 30, 25 и 27% для 15, 30 и 60 мин инкубации, соответственно. Аналогичная зависимость была обнаружена для лектина мутантного штамма. Лектин также проявлял ингибирующий эффект, хотя уровень выраженности эффекта был несколько ниже по сравнению с лектином родительского штамма.

Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл могут изменять метаболизм растения в направлении, благоприятном для роста и развития путем регулирования содержания цАМФ и перекиси водорода.

1. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Микробиология. 1998. T. 67. N.6. C.782 787.

2. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. Известия АН. Серия биологическая. 2004. №4. С.431-435.

3. Alen’kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Plant and Soil. 2006.V.283. № 1-2. P. 147-151.

4. Хайруллин Р.М., Яруллина Л.Г., Трошина Н.Б., Ахметова И.Э. Биохимия. 2001. Т. 66. В.

3. С.354-358.

ИНАКТИВЦИЯ ГЕНА ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ В ГЕНОМЕ BACILLUS INTERMEDIUS А. И. Ахметова, А. Р. Каюмов, М. Р. Шарипова Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина, Казань, Россия Глутамилэндопептидаза из Bacillus intemedius была впервые выделена и очищена в нашей лаборатории. Ген фермента клонирован и секвенирован. Ранее было показано, что фермент имеет два пика накопления активности в стационарной фазе роста. Экспрессия гена протеиназы контролируется двухкомпонентной системой DegS/DeqU, системой Spo0A фосфопередачи, глабальных регуляторов CodY и CcpA. Однако вопрос о физиологической роли фермента остается открытым. Одним из подходов к выяснению функции белка в клетке является инактивация его гена и сравнительное изучение исходного и мутантного штаммов в различных условиях.

Целью работы явилась инактивация гена глутамилэндопептидазы в клетках B.

intermedius 3-19. В работе решались следующие задачи: создание рекомбинантной последовательности ДНК для инактивации гена глутамилэндопептидазы в штамме B.

intermedius 3-19 и получение мутантного штамма с нокаутированным геном фермента.

Для инактивации гена протеиназы было выбрано 2 подхода. В первом случае с помощью ПЦР синтезировали последовательность ДНК, содержащую ген глутамилэндопептидазы. В качестве матрицы была использована плазмида pD58.21, содержащая полный клонированный ген фермента. Полученный амплификат клонировали в бациллярный вектор pUP110 по сайтам BamHI и HindIII для образования плазмиды pUPG.

Лигазной смесью трансформировали лабораторный штамм B. subtilis BJ2036, из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ. Из полученных колоний, образующих зоны гидролиза казеина, выделяли плазмиды и проводили реакцию амплификации с праймерами, гомологичными к последовательности гена gseBi. Плазмиды, давшие положительный результат, рестрицировали и анализировали на наличие протеолитической активности по гидролизу субстрата, специфичного для глутамилэндопептидазы, что подтверждает наличие активного гена глутамилэндопептидазы на плазмиде pUPG.

Полученную плазмиду pUPG рестрицировали по сайту EcoRV и использовали для трансформации в B. intermedius 3-19.

В случае положительной гомологичной рекомбинации между хромосомой B.

intermedius 3-19 и полученной линейной ДНК ген глутамилэндопептидазы должен вырезаться из генома бактерии. При этом встраивание гена устойчивости к антибиотику (канамицину) не определено и происходит с очень низкой частотой. В нашем случае не удалось получить рекомбинантные штаммы на селективной среде с канамицином. Поэтому было решено использовать другой подход к нокаутированию гена глутамилэндопептидазы, а именно получить конструкцию ДНК, в которой ген устойчивости к антибиотику находится внутри открытой рамки считывания гена.

Полученный с плазмиды pD58.21 амплификат, несущий ген глутамилэндопептидазы, рестрицировали по сайтам BamHI и HindIII и лигировали в вектор pUC19, рестрицированный по этим же сайтам для конструирования вектора pUCG. Лигазной смесью трансформировали штамм E. coli XL1 Blue. Из колоний, не образующих синюю окраску на среде с IPTG и X Gal, выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее размер в агарозном геле по сравнению с исходным вектором. Отобрали клоны, плазмиды которых имели больший молекулярный вес, чем исходный вектор. Проводили реакцию амплификации с праймерами к гену глутамилэндопептидазы. В случаях, где был получен положительный результат, свидетельствующий о наличии вставки ДНК, несущей ген глутамилэндопептидазы, проводили рестрикцию по сайтам BamHI и HindIII и получали два фрагмента, один из которых соответствует ожидаемому размеру остатка вектора pUC19, а второй имеет молекулярный вес несколько меньше, чем исходный ампификат гена gseBi. Это объясняется тем, что при рестрикции продукта амплификации происходит его укорочение на 100 п.о.

На следующем этапе амплифицировали ген устойчивости к эритромицину с плазмиды pCB22 и клонировали в предварительно рестрицированные по сайту EcoRV, находящемуся в открытой рамке считывания гена gseBi, плазмиды pUCG. С клонов имевших молекулярную массу выше исходной pUCG проводили ПЦР с праймеров, комплементарных к гену эндопептидазы, к гену устойчивости к эритромицину. Полученные плазмиды рестрицировали по уникальному сайту HindII в гене устойчивости к эритромицину. При рестрикции по сайтам BamHI и HindIII образуется два фрагмента, один из которых соответствует остатку плазмиды pUC19, а второй имеет вес 2.4kb соответствующий гену gseBi со вставкой гена EmR. Этот фрагмент выделяли из геля и использовали в качестве нокаутирующей конструкции при трансформации в штамм B. intermedius 3- В результате трансформации были получены клоны, которые анализировали на наличие протеолитической активности на синтетическом субстрате, специфичном для глутамилэндопептидаз. Активность клонов была нулевой. Для подтверждения нокаута гена глутамилэндопептидазы проводили ПЦР – анализ на наличие в геномной ДНК гена устойчивости к эритромицину. Таким образом, нами получен штамм B. intermedius с инактивированным геном глутамилэндопептидазы.

РОЛЬ ПОЛИАМИНОВ В ЗАЩИТЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК ОТ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ФТОРХИНОЛОНОВ А. В. Ахова, М. С. Шумков, Е. В. Зырянова Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Известно, что основной мишенью для антибиотиков из группы фторхинолонов в клетках E. coli является ДНК-гираза, а одним из аспектов бактерицидного действия – фрагментация ДНК. В наших экспериментах in vivo левофлоксацин аналогичным образом вызывал фрагментацию плазмидной ДНК (pBR322), что выражалось в появлении на электрофореграмме фрагментов плазмидной ДНК в виде «шмера», причем степень расщепления зависела от концентрации антибиотика.

Мы обнаружили, что в ответ на добавку фторхинолоновых антибиотиков в клетках Escherichia coli индуцируется активность полиаминсинтезирующей системы, в частности орнитиндекарбоксилазы. Возрастание активности орнитиндекарбоксилазы, которая является ключевым ферментом синтеза путресцина и спермидина, приводило к накоплению данных полиаминов в бактериальной клетке.

Полиамины, являясь поликатионами, способны взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами. Среди природных полиаминов именно путресцин и спермидин (благодаря особому расположению положительных зарядов в молекуле) обладают наибольшим сродством к ДНК. Связывание полиаминов приводит к компактизации молекулы ДНК и более прочному удерживанию комплементарных нитей от расхождения. Повышение синтеза путресцина и спермидина в ответ на добавку фторхинолонов могло бы быть адаптивной реакцией, направленной на предохранение ДНК.

Для выявления роли полиаминов в защите бактериальной ДНК путресцин, кадаверин и спермидин вносили в культуры с добавкой левофлоксацина. Мы установили, что путресцин и спермидин оказывали протекторное действие на плазмидную ДНК, практически полностью нивелируя разрушающее действие антибиотика. В то же время другой исследованный полиамин – кадаверин – даже несколько усиливал повреждающее действие фторхинолона.

Предполагается, что фрагментация ДНК является следствием взаимодействия фторхинолона с ДНК-гиразой и ДНК, сопровождающегося формированием тройного комплекса. Возможно, полиамины, присоединяясь к ДНК, каким-либо образом препятствуют его образованию.

С другой стороны, повреждение ДНК может быть вызвано активными формами кислорода (АФК), роль которых в противомикробном действии широкого спектра антибиотиков в настоящее время обсуждается все чаще. Наибольший вред нуклеиновым кислотам наносит гидроксильный радикал, образующийся в реакции Фентона при участии металлов с переменной валентностью. Полиамины могут вступать в конкурентные взаимоотношения с катионами металлов и вытеснять их с мест связывания с ДНК, отводя, таким образом, продукты реакции Фентона от мишени. Наряду со способностью полиаминов компактизировать нуклеиновые кислоты, вытеснение ионов металлов с переменной валентностью ограничивает доступ АФК к ДНК.

Кроме того, обнаруженное нами протекторное действие полиаминов может быть связано с их способностью непосредственно улавливать АФК.

Предположение, что в основе протекторного действия полиаминов могут лежать их антиоксидантные свойства, подтверждается исследованием уровня экспрессии гена soxS.

Данный ген кодирует транскрипционный регулятор генов адаптации к окислительному стрессу, и уровень его экспрессии прямопропорционален количеству супероксида в клетке.

Сублетальные концентрации антибиотиков вызывали индукцию soxS. Добавка путресцина и спермидина в этих условиях снижала экспрессию soxS, что свидетельствует о снижении количества АФК в их присутствии. Добавка же кадаверина не изменяла экспрессию soxS, индуцированную антибиотиком.

В конечном итоге протекторное действие полиаминов сопровождалось повышением устойчивости E. coli к антибиотикам. Так в культурах с добавкой левофлоксацина в концентрации, приводящей практически к полной гибели клеток к 6 часу культивирования, в присутствие путресцина количество жизнеспособных клеток достигало 20%. Определение минимальных ингибиторных концентраций методом двукратных серийных разведений также показало, что в присутствие полиаминов происходит повышение антибиотикоустойчивости E. coli. МИК левофлоксацина и соответственно антибиотикоустойчивость возрастала с увеличением концентрации добавляемого полиамина, причем максимальный эффект также оказывали путресцин и спермидин.

Таким образом, полиамины путресцин и спермидин, уменьшая повреждающее воздействие фторхинолонов на ДНК, способствуют повышению устойчивости E. coli к антибиотикам данного класса.

Работа выполнена по программе МКБ Президиума РАН и поддержана грантом РФФИ №09-04-99006-р-офи.

ИЗМЕНЕНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ВНЕШНИХ УСЛОВИЙ Ю. М. Бардаева, Е. А. Жигалова, Ю. В. Журавлева Иркутский государственный медицинский университет, Иркутск, Россия В процессе эволюции представители мира микробов, переходя на симбиотические взаимоотношения, адаптировались к существованию в организме человека. Являясь открытой саморегулирующей биологической системой – «макроорганизм и его микрофлора», способна противостоять в пределах нормы реакции изменяющимся условиям внешней среды и колебаниям плотности микробных популяций. Вместе с тем, многочисленные и разнообразные факторы внешней среды могут приводить с одной стороны к нарушению гомеостатического равновесия в организме человека, а с другой – к стрессовому воздействию на микрофлору. Это ведет к микроэкологическим нарушениям, которые нередко служат запускающим механизмом возникновения, а в последующем и поддерживают патологические процессы, возникающие в организме человека под влиянием инфекционных агентов.

В связи с этим целью представленной работы явилось изучение влияния факторов внешней среды на изменчивость патогенного потенциала в структуре микробных популяций, вызывающих инфекционные заболевания у человека. В качестве объектов исследования были выбраны бактерии рода Staphylococcus и дрожжеподобные грибы рода Candidae, принадлежащие к нормальной микрофлоре человека, а также простейшее семейства Тrichomonadidae, отнесенная к классическим патогенам.

В ходе исследования была установлена взаимосвязь между цитоморфологической формой Тrichomonas vaginalis и клиническим состоянием больного. У 21% больных возбудитель трихомонадной инфекции имел грушевидную форму и преимущественно встречался при остро протекающей форме заболевания. У больных с хроническим течением инфекции были выделены атипичные формы возбудителя, среди которых округлая и овальная формы паразита обнаруживались соответственно у 36,0% и 15,0% обследованных.

Достаточно часто отмечалось одновременное присутствие различных цитоморфологических форм возбудителя у одного обследуемого (25,3%). Амебоидные трихомонады встречались крайне редко (2,0%) у больных со стертым течением трихомонадной инфекции. Изменение морфологических форм возбудителя инфекционной болезни человека является результатом его защитной реакции на воздействие лекарственных препаратов, используемых для лечения, а также ответной реакции со стороны макроорганизма на внедрение возбудителя.

Микроэкосистема человека в норме имеет сбалансированный набор разных видов микроорганизмов, находящихся в состоянии близком к стационарному. Благодаря системе кооперации между микробными популяциями и человеком, выступает как единое целое и работает в их интересах. Так, в популяции здоровых людей выделены культуры S. aureus, обладающие факторами патогенности, спектр которых характеризовался большим разнообразием. 53,2% проанализированных культур S. aureus имели полный набор, определяемых факторов патогенности: лецитиназа, фибринолизин, гемолизины, ДНКаза, антилизоцимная активность. Сочетание трех факторов патогенности, в разных комбинациях, было отмечено у 31,1% идентифицированных культур. Вместе с тем, среди выделенных штаммов 92,2%, по уровню вирулентности, дифференцированы как низко вирулентные штаммы. И только у 3,9% здоровых людей биотип S. aureus был охарактеризован как средне вирулентный.

В то же время, если по каким-либо причинам биологическая система выводится из состояния равновесия с превышением ее компенсаторных возможностей, то в микробиоценозе происходят сукцессионные изменения, способные формировать патологические состояния в организме человека. Качественные изменения в состоянии нормальной микрофлоры были обнаружены у онкологических больных. Было установлено, что частота встречаемости S. aureus, выделяемого из естественного биотопа у онкологических больных, не отличается от таковой у здоровых людей. Но степень гетерогенности у данной категории больных значительно ниже, чем в популяции S. aureus, выделенной от здоровых. Между качественными изменениями в микрофлоре и степенью злокачественности у онкологических больных установлена прямая корреляционная связь.

Кроме того, штаммы S. aureus отличаются повышенной степенью вирулентности, а спектр выделенных факторов патогенности носит специфический характер. Сукцессии, особенно на ранних этапах развития онкологического заболевания, характеризуются быстрой сменой одних эковариантов другими, резкими изменениями численности в микробной популяции, нарушается взаимоотношения с иммунными механизмами, что и создает условия для развития патологического процесса. Микроэкологический дисбаланс в микробиоценозе может формировать клоны с повышенным потенциалом патогенности, устойчивые к действию антимикробных препаратов и другими свойствами.

В условиях внешнего воздействия возникают предпосылки для формирования «искусственных экосистем» с измененными параметрами среды обитания микроорганизмов.

В таких условиях филогенетически сложившиеся взаимоотношения коактантов экологической системы «человек – микроорганизмы» претерпевают изменения. Одним из его проявлений может быть синдром нарушения колонизацонной резистентности, который ведет к развитию эндогенной инфекции, вызванной грибами рода Candidae и проявляющихся в виде поверхностных форм кандидозной инфекции. Среди клинических штаммов Candidae оценивалась их агрессивность в условиях действия разных температур.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что повышение температуры, подавляющее жизнедеятельность этих микроорганизмов, с другой стороны индуцирует не только большую устойчивость к факторам внешней среды, но и вызывает большую интенсивность их проявления.

На основании выше изложенного становится понятным, что важнейшей задачей экологической микробиологии является сохранение биоразнообразия в естественной микрофлоре человека. Механизм взаимодействия в биологической системе «макроорганизм и его микрофлора» носит симбиотический характер. При этом межвидовые взаимоотношения в биоценозах сложны, разнообразны и динамичны. Но их форма определяется биологическими свойствами микробов.

БИОРАЗНООБРАЗИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ВОДАХ ЧЕРНОГО МОРЯ А. Л. Брюханов1,2, В. А. Корнеева1, Т. А. Канапацкий2, Е. Е. Захарова2, Е. В. Менько2, Н. В. Пименов Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра микробиологии, Москва, Россия Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Черное море представляет собой самый большой в мире меромиктический водоем [Lin et al., 2006]. В центральной части аэробные воды простираются от поверхности до глубин около 100 м, тогда как исчезновение кислорода в водной толще континентального склона наблюдается в районе 130–170 м.

Глубже границы аэробных и анаэробных вод в черноморских водах присутствует сероводород, концентрация которого на глубине 2000 м достигает 370 мкМ. Накопление H2S в водной толще Черного моря происходит, главным образом, в результате жизнедеятельности сульфатредуцирующих бактерий (CPБ) [Ivanov, Lein, 2006]. Наибольший интерес при исследовании биоразнообразия и интенсивности микробиологических процессов в Черном море представляет именно граница аэробных и анаэробных вод (так называемый хемоклин). В серии биогеохимических работ было показано, что в зоне хемоклина наблюдаются активные процессы микробной трансформации окисленных и восстановленных соединений серы [Pimenov, Neretin, 2006].

Считается, что CPБ являются строго анаэробными микроорганизмами, однако многие виды сульфатредукторов (в частности, представители рода Desulfovibrio) сохраняют жизнеспособность и даже метаболическую активность в поверхностных аэробных водах, обладая эффективными механизмами антиокислительной защиты [Dolla et al., 2006].

В данном исследовании был проведен анализ распространения СРБ в водах Черного моря с помощью метода гибридизации in situ с 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами, меченными флуоресцентным красителем цианином 3 (метод FISH). Пробы воды отбирались с борта НИС «Профессор Штокман» в глубоководной зоне Черного моря в марте 2009. Для определения СРБ методом FISH, отобранные с глубин от 30 до 1940 м водные пробы фиксировали 4%-ным раствором формальдегида, концентрировали на поликарбонатных мембранных фильтрах 25 мм (объем фильтрата составлял от 7 до 15 мл) и проводили гибридизации в рекомендованных условиях с олигонуклеотидными зондами. Общую численность микроорганизмов в пробах оценивали с помощью универсального ДНК-красителя ДАФИ в концентрации 0,5 нг/мкл.

Микроскопический анализ осуществляли с использованием люминесцентного микроскопа AxioImager.D1 (Carl Zeiss, Германия) с цифровой камерой AxioCam HRc. Кроме того, проводили FISH анализ накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий, полученных из водных проб с глубин 30, 70 и 180 м.

В работе использовали следующие зонды в концентрации 50 нг/мкл: DSV214 (на большинство Desulfomicrobium), DSV1292 (на некоторые Desulfovibrio), DSV698 (на некоторые Desulfovibrio), SRB385 (на большинство Desulfovibrionales), Dtm229 (на Desulfotomaculum cluster I), DSB129 (на большинство Desulfobacter) и DSB985 (на Desulfobacter, Desulfobacula, Desulfospira и Desulfotignum).

В аэробной зоне на глубине 30 м были обнаружены СРБ родов Desulfotomaculum и Desulfovibrio. Иная картина наблюдалась в пробах, отобранных с глубины 115 м, где содержание O2 не превышает 0,1 мг/мл. Здесь преобладали представители рода Desulfomicrobium (они же обнаруживались в относительно большом количестве и в накопительных культурах, полученных из проб с глубины 70 м). Однако необходимо отметить, что количество обнаруженных СРБ как в поверхностных водах, так и на глубинах в районе хемоклина было значительно меньше, чем в водных пробах, отобранных в летний период на континентальном склоне в районе Геленджика.

Присутствие жизнеспособных СРБ в аэробных водах Черного моря коррелирует с данными гидрохимиков [Волков и др., 1992], которые отмечали следы восстановленных форм серы в аэробной зоне моря.

1. Lin X., Wakeham S.G., Putnam I.F., Astor Y.M., Scranton M.I., Chistoserdov A.Y., Taylor G.T. Comparison of vertical distributions of prokaryotic assemblages in the anoxic Cariaco Basin and Black Sea by use of fluorescence in situ hybridization // Appl.

Environ. Microbiol. 2006. V. 72. No. 4. P. 2679-2690.

2. Ivanov M., Lein A. In “Past and present water column anoxia.” / NATO Science series. Ed. L.

Neretin 2006. Springer. Fractionation of stable isotopes of carbon and sulfur during biological processes in the Black Sea. P. 373-418.

3. Pimenov N., Neretin L. In “Past and present water column anoxia.” / NATO Science series.

Ed. L. Neretin 2006. Springer. Composition and activities of microbial communities involved in carbon, sulfur, nitrogen and manganese cycling in the oxic/anoxic interface of the Black Sea. P. 501-522.

4. Dolla A., Fournier M., Dermoun Z. Oxygen defence in sulfate-reducing bacteria // J.

Biotechnol. 2006. V. 126. No. 1. P. 87-100.

5. Волков И.И., Розанов А.Г., Демидова Т.П. Соединения неорганической восстановленной серы и растворенный марганец в воде Черного моря. Ред. М.Е. Виноградов. / Зимнее состояние экосистемы открытой части Черного моря. 1992. ИО РАН.

Москва. С. 38-50.

СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПОЧВЕННЫХ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM Г. Л. Бурыгин1, Ю. А. Филипьечева2, А. Е. Беляков1, И. А. Попова2, Э. В. Шувалова2, Л. Ю. Матора1, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия Почвенные азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в исследовании феномена ассоциативности благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяйственных растений. Предполагается существование нескольких возможных факторов стимулирующего действия азоспирилл на растение: азотфиксация, гормональный эффект, общее улучшение роста корней, нитратредукция, улучшение минерального и водного питания растений, а также подавление развития растительных патогенов. При этом данные бактерии не проявляют жёсткой специфичности по отношению к растению-хозяину и являются основными колонизаторами корней многих растений Мажорные антигены азоспирилл играют определяющую роль в начальных этапах формирования симбиоза с растением-партнёром. Так, специфическое распознавание бактериальных антигенов растением в процессе формирования симбиоза обеспечивает успешное взаимодействие симбионтов.

Целью данной работы было изучение разнообразия штаммов азоспирилл и закономерностей их распространения в почвах Юго-Востока России. Были проведены исследования иммунохимических свойств поверхностных антигенов 60-ти штаммов азоспирилл, относящихся к четырем видам: A. amazonense, A. brasilense, A. irakense и A. lipoferum.

Родоспецифичные антитела, полученные на интактные клетки типового штамма A.

brasilense Sp7, выявляли в экстрактах наружных мембран всех исследованных штаммов консервативные термолабильные белковые антигены. Термостабильный Н-антиген азоспирилл – гликозилированный флагеллин полярного жгутика – продемонстрировал, с одной стороны, высокую консервативность белковых детерминант, а с другой – штаммовую вариабельность антигенных свойств углеводных фрагментов исследованных флагеллинов.

Анализ результатов изучения разнообразия липополисахаридов (О-антигенов) азоспирилл позволил разделить на 4 группы каждый из видов A. brasilense и A. lipoferum.

При этом в каждом из этих видов выявлено по 5 штаммов, не имеющих антигенных перекрёстов с О-антигенами модельных штаммов, но взаимодействующих с родоспецифичными антителами. Для видов A. brasilense (33 штамма) и A. lipoferum (19 штаммов) предложена система серотипирования штаммов, основанная на способности и характере взаимодействия липополисахаридов с антителами к О-антигенам 5 модельных штаммов азоспирилл.

Два исследованных нами штамма A. irakense оказались иммунохимически близкими между собой, но отличались от представителей других видов. Так, они с одинаковой интенсивностью взаимодействовали с антителами к О-антигену типового штамма A. irakense KBC-1, а родоспецифичные антитела выявляли только по одному термолабильному белковому антигену в экстрактах их наружных мембран. Также серологически обособленным оказался и единственный изученный нами представитель вида A. amazonense штамм Am14.

Полученные данные говорят о широкой вариабельности углеводных детерминант наружной мембраны азоспирилл и весьма высокой консервативности мажорных белковых антигенов данных бактерий. Эти результаты были использованы для иммунохимического выявления азоспирилл в различных почвах Юго-Востока России с применением антител к О-антигенам модельных штаммов.

Было проведено исследование распространённости представителей серологических групп азоспирилл в основных типах почв Саратовской области (солонец, аллювиальная, серая лесная, чернозём типичный и чернозём южный) методом сравнительного иммуноферментного анализа почвенных суспензий. Было обнаружено, что для всех проанализированных почв характерно преобладание антигенов азоспирилл, относящихся к серотипу модельного штамма Sp245, при этом чернозём южный и серая лесная почва демонстрировали наибольший уровень выявления этих детерминант. В то же время, чернозём южный отличался также более заметным присутствием антигенов серотипа штамма Sp7.

Таким образом, иммунохимический подход к изучению разнообразия азоспирилл позволил разделить штаммы на серотипы и идентифицировать представителей этих серотипов в почвенных суспензиях.

Работа поддержана грантом Президента РФ НШ-3171.2008.4.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ–СИМБИОНТОВ МИКРОНУКЛЕУСОВ ИНФУЗОРИЙ PARAMECIUM BURSARIA И PARAMECIUM CAUDATUM Н. Д. Ваккеров–Коузова1, М. С. Раутиан Агрофизический институт, Санкт-Петербург, Россия Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия Инфузории рода Paramecium являются хозяевами разнообразных внутриклеточных бактерий. Местом локализации симбионтов могут быть как цитоплазма, так и оба ядра хозяина – макронуклеус (МА) или микронуклеус (МИ). Внутриядерные бактерии впервые были описаны почти 120 лет назад Владимиром Хавкиным [Hafkin, 1890], который и дал название роду Holospora. Оказалось, что внутриядерные бактерии проявляют специфичность не только к виду, но и к типу ядра: каждый вид Holospora обитает в определенном виде парамеций и только в одном из ядер – МА или МИ.

Для Holospora характерен сложный жизненный цикл, в котором представлены две основные формы: репродуктивные (вегетативные, РФ) и инфекционные (ИФ).

Репродуктивные формы способны к делению, они попадают в дочерние ядра при делении клетки-хозяина, обеспечивая вертикальную передачу симбионта. Они дифференцируются в неделящиеся инфекционные формы, которые могут выводиться из клетки парамеции и заражать новых хозяев, обеспечивая, таким образом, горизонтальную передачу симбионтов [Осипов, 1981]. Формирование инфекционных форм сопряжено со сложной цитодифференцировкой, включающей, в частности, значительную гипертрофию периплазматического пространства, которое у зрелой ИФ занимает до половины клетки.

После проникновения бактерий в ядро, периплазма вновь сокращается.

В настоящее время описано девять видов рода Holospora. Секвенирование полноразмерного гена 16S рРНК для H. obtusa и фрагмента гена для H. elegans показало, что они относятся к Alphaproteobacteria [Amann et al., 1990], формируя самостоятельную ветвь, рано дивергировавшую от основного ствола Rickettsia [Emelyanov, 2003]. Показано, что геномы голоспор представлены единственной хромосомой и не содержат естественных плазмид [Тимофеева и Раутиан, 1997]. Размер генома небольшой для грамотрицательных бактерий и варьирует у разных видов от 1,2 Mb до 2 Mb.

В литературе высказывались предположения об искусственном объединении в роде Holospora неродственных бактерий [Fokin, 1997]. Однако анализ нуклеотидных последовательностей 16S рДНК для нескольких изолятов ранее не исследованных видов рода показал, что они формируют компактную в эволюционном отношении группу внутри порядка Rickettsiales [Rautian and Wackerow-Kouzova, 2007]. Также нами было показано, что в исследуемой симбиотической системе сначала сформировалась видовая специфичность партнеров, а затем, внутри вида и независимо в каждом виде хозяина дивергировали виды симбионтов, специфичные к разным ядрам – микронуклеусу и макронуклеусу.

В настоящей работе мы получили и проанализировали последовательности гена, кодирующего 16S рДНК, для изолятов микронуклеусов двух видов инфузорий - P.caudatum и P. bursaria, а именно для H. undulata, H. elegans, H. recta и H. acuminata. Для изолятов H. undulata было выявлено отличие по 1 из 1492 нуклеотидов. Различия между разными видами Holospora составляет от 3% (48 замен H.curviuscula vs. H. undulata) до 1,6 один штамм H. elegans. Полученная нами последовательность 16S рДНК (1235 п.н.) отличалась на 1 и на 2 нуклеотида ( 0,01% и 0,015%, соответственно) от последовательностей двух изолятов H. undulata. Сравнение полученной последовательности с небольшим фрагментом (346 п.н.) 16S рДНК H. elegans в BLAST показал, что этот фрагмент полностью идентичен соответствующему фрагменту нашей последовательности.

Исследованный изолят H.recta также имел отличие только по одному нуклеотиду от H. elegans из GenBank. Полученные данные показывают, что уровень различий между H.

undulata, H. elegans и H. recta по крайней мере на два порядка меньше уровня межвидовых различий. Это позволяет нам предположить, что они представляют собой один вид. То, что H. undulata, H. elegans и H. recta в действительности представляют один вид мы предполагали ранее, т.к. они выделены на основании только морфологических отличий инфекционных форм (ИФ) этих симбионтов: ИФ извитые или прямые. В нашей коллекции линий симбионтов был представлен клон Holospora undulata, популяция симбионтов в котором была представлена смесью прямых и извитых ИФ бактерий. Используя метод предельных разведений, была экспериментально получена клетка P. caudatum, инфицированная единственной извитой формой. Процесс инфекции контролировался под микроскопом с интерференционным контрастом Номарского и хорошо документирован.

Полученный от этой клетки клон первоначально содержал лишь извитые ИФ, но затем начали появляться и прямые, доля которых постепенно возрастала. Таким образом, прямые ИФ могут образовываться у обычных H. undulata, возможно, в результате геномных перестроек. H. acuminata, симбионт микронуклеуса другого вида инфузорий – P. bursaria, представлял собой отдельный вид, более близкий H. curviuscula.

МОНИТОРИНГ БАКТЕРИАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ПОЧВЫ Н. Д. Ваккеров–Коузова, А. Ф. Петрушин Агрофизический институт, Санкт-Петербург, Россия Основную роль в процессах саморегуляции и самовосстановления любой экосистемы играет биота, т.е. совокупность всех её живых организмов. Биоразнообразие (качественный и количественный состав видов, составляющих экосистему) является критерием и признаком устойчивости экосистемы. Искусственно создать устойчивую экосистему, способную к саморегуляции и длительному поддержанию своего биологического разнообразия, практически невозможно, поэтому глобальной экологической проблемой современности является изучение и сохранение биоразнообразия природных экосистем.

Среди естественных местообитаний живых организмов почва, вследствие своей гетерогенности, является наиболее сложной для изучения средой. Гетерогенность почвы связана с тем, что она является полифункциональной трёхфазной системой и образуется в результате жизнедеятельности организмов и выветривания горных пород, т.е. биогенных и абиогенных факторов. Благодаря своим широким метаболическим возможностям микроорганизмы играют ключевую роль во всех процессах, протекающих в почве. Они участвуют в формировании гумуса, и, следовательно, плодородия почвы. Микроорганизмы принимают участие в химических превращениях основных биогенных элементов – C, N, H, O, P и S, которые входят в состав основных полимеров любой живой клетки. Их превращения в биосфере во многом определяют работу главного звена биологического цикла – образование первичной растительной продукции. Микроорганизмы энергично изменяют как органическую, так и минеральную часть почвы. Почвенные микроорганизмы влияют также на свойства почвенного покрова, например, поглотительную способность почвы, и в определённой степени влияют на её агрегатный состав, склеивая мелкие минеральные компоненты почвы. Микроорганизмы в почве выполняют также функцию регуляции своего состава, находясь в постоянном взаимодействии между собой. Некоторые из них выделяют вещества, способствующие росту растений.

Разнообразие почвенных микроорганизмов велико, поскольку почва служит «буфером», куда поступают микроорганизмы из воздуха, воды, с поверхности растений и животных. Однако истинно почвенными целесообразно считать функционально активные микроорганизмы, которые способны размножаться и функционировать в почве, а не только сохраняться. Последние десятилетия в микробиологии идёт оживлённая дискуссия по поводу оценки реального прокариотического разнообразия естественных местообитаний. В англоязычной литературе [Staley and Konopka, 1985] даже был предложен термин “great plate count anomaly”, описывающий следующий феномен: численность прокариот при микроскопическом изучении всегда значительно превышает численность, полученную при подсчёте КОЕ. В связи с этим, считается, что значительная часть (до 99%) прокариот естественных местообитаний является некультивируемыми. Молекулярными методами было показано, что в 1 г почвы может содержаться свыше 1000 различных видов [Torsvik et al., 1990]. На самом деле, на различие между данными микроскопического анализа и подсчёта КОЕ обращали внимание ещё в 30-е годы Виноградский С.Н. и его современники [Виноградский, 1952]. Понятно, что некоторые бактерии до сих пор некультивированы только потому, что их пищевые потребности до сих пор неизвестны. Важно также учитывать различные условия культивирования. Некоторые патогенные бактерии, такие как Salmonella и Vibrio, могут переходить в некультивируемое состояние под воздействием различных факторов, например, соленость воды или низкие температуры [Amann et al., 1995].

В настоящей работе на основании Bergey's Manual of Systematic Bacteriology и The Prokaryotes были составлены ключи для идентификации почвенных прокариот, выделены и фенотипически идентифицированы почвенные прокариоты. Полученные изоляты были также идентифицированы с помощью анализа последовательности гена rrs.

Затем был проведён сравнительный анализ результатов фенотипической идентификации и филогенетического анализа. Эти результаты совпали в большинстве случаев родовой идентификации, кроме рода Ochrobactrum (был выделен свободноживущий азотфиксирующий штамм, хотя известны только азотфиксирующие симбионты этого рода или патогены человека), Arthrobacter (один из изолятов не имел характерного для рода цикла «палочка кокк»), некоторые изоляты родов Sphingomonas и Stenotrophomonas иногда было трудно фенотипически отличить от рода Pseudomonas. Для изолятов семейства Bacillacea совпали даже данные видовой идентификации. Фенотипические признаки, по которым обнаруживалось по некоторым изолятам несовпадения с описанием рода, мы исключили из финального ключа для идентификации почвенных прокариот до рода. Для экологической оценки биоразнообразия на основании общепринятых индексов [Одум, 1986] нами было разработано программное обеспечение BIODIVERSITY с целью дальнейшего анализа сельскохозяйственно-ценных почв.

НОВЫЕ АЭРОБНЫЕ МЕТИЛОБАКТЕРИИ – СИМБИОНТЫ РАСТЕНИЙ А. А. Гоглева Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино, Россия Аэробные метилотрофные бактерии, использующие окисленные или замещённые производные метана (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии, широко распространены в природе и часто ассоциированы с растениями. Относительно недавно стало известно, что метан, метанол и другие летучие C1-соединения являются естественными продуктами метаболизма растений. Основным источником метанола, выделяемого растениями, служит деметилирование пектина в клеточных стенках под действием пектинметилэстеразы. Наряду с метаном и метанолом, растения могут выделять метилированные амины, галометаны, метилсернистые соединения, хотя их вклад в глобальный цикл углерода намного меньше. Следовательно, образование растениями большого количества различных С1-соединений, и прежде всего метанола, создает предпосылки постоянной взаимосвязи с метилобактериями. Преобладающим типом метилотрофов, обнаруженных ранее на поверхности растений, являются типичные представители розовоокрашенных факультативных метилобактерий (РОФМ) рода Methylobacterium.


Из филлосферы дуба (Quercus robur L.) и берёзы (Betula pendula L.) нами выделены два штамма бесцветных метилобактерий Db и 1ж, использующих метанол и метиламины в качестве источников углерода и энергии. Изоляты представлены грамотрицательными подвижными клетками размером 0,5–0,7 1,0–1,2 и 0,3 0,35 мкм соответственно. В жирнокислотном составе клеток преобладают омега-7-октадеценовая (18:1 7) и 11-метил-октадеценовая (11 Me18:1). В фосфолипидном составе обоих изолятов доминируют фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерол.

Судя по данным секвенирования гена 16S рРНК, оба штамма принадлежат к классу Alphaproteobacteria и наиболее близки представителям родов Methylopila и Hanssсhlegelia (Рис.1).

Изоляты окисляют метанол классической PQQ-зависимой метанолдегидрогеназой, и имеют высокие активности ключевых ферментов серинового пути:

L-серин-глиоксилатаминотрансферазы и оксипируватредуктазы. У обоих штаммов отсутствует активность изоцитратлиазы, следовательно, они реализует ицл– вариант серинового пути С1-метаболизма. Штамм 1ж способен окислять метиламин аминооксидазой (8-10 нмоль/мин/мг белка), однако у него отсутствуют метиламиндегидрогеназа и N-метилглутаматдегидрогеназа. Ассимиляция аммония у штаммов Db и 1ж осуществляется через глутаматный цикл, о чём свидетельствуют активности глутаминсинтетазы и глутаматсинтазы. Помимо этого, штамм Db обладает НАДФН-зависимой формой глутаматдегидрогеназы и способен к восстановительному аминированию -кетоглутората.

0. Hansschlegelia plantiphila S2 DQ Hansschlegelia plantiphila S1 T DQ 67 Hansschlegelia plantiphila S4 DQ 53 Db Methylosulfonomonas methylovora M2 (U62893) 1g Methylopila capsulata IM1 (AF004844) Methylopila helvetica IFO13257 (D14501) Albibacter methylovorans DM10T (AF273213) Xanthobacter autotrophicus T102 (U62888) Ancylobacter aquaticus ATCC 25396 (M62790) Methylobacterium extorquens TKOO1 (AF531770) Methylosinus trichosporium OBBP (AF150804) Methylocystis parvus SM6 (AF150805) Paracoccus denitrificans LMG 4218T (X69159) Agrobacterium tumefaciens CCBAU 65237 (AY504963) 100 Rhizobium tropici IFO15247 (D11344) Agrobacterium rhizogenes IFO13257 (D14501) Escherichia coli O157:H7 (AY513502) Рис. 1 Филогенетическое положение штаммов Db и 1ж, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов (эволюционным расстоянием). Корень определен включением последовательности E. coli в качестве внешней группы. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap»-анализа 100 альтернативных деревьев.

Исследуемые штаммы способны синтезировать фитогормоны – ауксины, и таким образом влиять влиять на рост и развитие колонизованных растений. Полученные данные существенно расширяют представление о биоразнообразии метилотрофных фитосимбионтов.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СИНЕРГИДНОГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ АМПИЦИЛЛИНА И КАНАМИЦИНА В ОТНОШЕНИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК О. И. Гулий, О. В. Игнатов Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Для предупреждения возникновения устойчивых к антибиотикам форм микроорганизмов и повышения эффективности антибиотикотерапии могут применятся одновременно два и более антибиотика. Особый интерес, с нашей точки зрения, представляет изучение синергидного действия антибиотиков на микробные клетки. Ранее нами была показана возможность определения чувствительности микробных клеток по отношению к некоторым антибиотикам с помощью электрооптического (ЭО) анализа клеточных суспензий. С нашей точки зрения, перспективным направлением дальнейших исследований является использование метода ЭО анализа клеточных суспензий при одновременном воздействии на них антибиотиков с различными механизмами действия.

Можно предположить, что деструкция мембраны в результате проникновения антибиотиков внутрь клетки и последующие нарушения биохимических процессов в них должны приводить к изменению электрофизических свойств микробных клеток. Последние отражаются в изменениях ЭО характеристик клеточных суспензий, регистрируемых с использованием эффекта ориентации клеток в электрическом поле. При использовании антибиотиков важное значение имеет определение оптимальных доз препаратов с учетом их синергидного действия. Оптимальными являются такие дозы антибиотиков, при которых концентрация антибиотиков в 2–3 раза превышает величину его минимальной подавляющей концентрации (МПК) в отношении возбудителя. Имеются данные об усилении антибактериального эффекта ампициллина при сочетанном применении с другими антибиотиками, например, с канамицином. В наших исследованиях изучалось влияние ампициллина и канамицина на электрофизические свойства клеток Escherichia coli К-12.

Установлено, что существенные изменения в ориентационных спектрах (ОС) суспензий клеток, инкубированных с различными концентрациями антибиотиков ампициллина и канамицина, имели место только на первых пяти частотах ориентирующего электрического поля (10–1000 кГц). Показано, что ампициллин в концентрации 1,0 мкг/мл и канамицин в концентрации 0,5 мкг/мл практически не оказывали влияние на величину электрооптического (ЭО) сигнала клеток чувствительного к данным антибиотикам штамму, однако зафиксировано. значительное изменение величины ЭО сигнала при одновременной инкубации клеток К-12 с ампициллином (1 мкг/мл) и канамицином (0,5 мкг/мл), что объясняется синергидным действием двух антибиотиков.

Полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности использования ЭО анализа клеточных суспензий для контроля воздействия антибиотиков на микроорганизмы. В том числе, показана эффективность электрофизических методов анализа микробных клеток для регистрации синергетического эффекта антибиотиков.

Работа была частично поддержана грантом Президента РФ для молодых докторов наук МД-57.2008.4 и государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации НШ-3171.2008.4.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРИБОВ РОДА CANDIDA, ИЗОЛИРОВАННЫХ ПРИ ВАГИНАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ В. А. Дробкова ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера Росздрава, Пермь, Россия Актуальность проблемы кандидоза обусловлена, прежде всего тем, что это - наиболее распространенная грибковая инфекция. На его долю приходится подавляющее большинство случаев грибковых поражений слизистых оболочек. Вызывает кандидоз около 20 видов Candida, при этом наиболее частыми возбудителями остаются Candida albicans (А.Ю. Сергеев, 2001;

С.А. Лисовская, 2008). На практике их потенциальную патогенность принято характеризовать на основе «феномена ростовых трубок», определения адгезивных свойств и активности ферментов изолируемых культур. Гидролитические ферменты нарушают целостность эпителиального покрова слизистых оболочек, способствуя проникновения элементов гриба в ткани. Более того, это создает условия для внедрения возбудителей бактериальной природы, минуя барьер, который представляет собой неповрежденная слизистая для большинства микробов. Уровень продукции ферментов инвазии может существенно отличаться у разных штаммов, а степень их активности зависит от целого ряда причин. Так, среди C. albicans, например, регистрируются фосфолипазоположительные и фосфолипазоотрицательные штаммы, их протеолитическая активность подвержена значительным колебаниям.

Цель настоящего исследования – анализ ферментативной активности штаммов C. аlbicans, изолированных от пациенток гинекологического стационара.

Материалы и методы. Объектом исследования служили 40 штаммов грибов рода Candida, изолированных из вагинального отделяемого женщин, проходивших лечение в гинекологическом отделении МУЗ ГКБ №7 в 2008 г. Первичный посев клинического материала проводили на среду Сабуро с левомицетином. Инкубировали 48 часов при 37°С.

Выросшие колонии микроскопировали, идентифицировали культуры Candida на основе морфологических, культуральных и биохимических (ферментация сахаров) признаков.

Способность к филаментации и образованию хламидоспор оценивали на специальных средах («Hi-Media», Индия). Фосфолипазную активность грибов определяли на среде Сабуро с добавлением яичного желтка и CaCl2.2H2O при pH = 5,6 и 7,4, длительность инкубации – 10 суток. Протеолитическую способность Candida оценивали на среде с добавлением бычьего альбумина. Для получения эндоплазмакоагулазы готовили взвесь культуры C.

albicans в физиологическом растворе. После центрифугирования, осадок ресуспендировали в физиологическом растворе в соотношении 1 : 2 и замораживали, затем растирали до оттаивания. Процедуру повторяли 3 раза. Вновь центрифугировали, надосадочную жидкость смешивали с 0,5 мл разведенной кроличьей плазмы, инкубировали при 37°С в течение часов (Н.П. Елинов, 1964).

Результаты и обсуждение. Исследованные штаммы в значительной степени различались по культуральным свойствам, набору и уровню продукции определяемых ферментов. Процессы филаментации и образования хламидоспор у грибов происходили значительно быстрее на средах с pH = 7,4, чем при pH = 5,6, зависели от температуры и продолжительности инкубации. Спустя 48 часов хламидоспоры наблюдали у 68,4% культур C. albicans, к концу 6 суток при 37°С и pH среды 7,4 процессы филаментации регистрировали у всех штаммов. При идентичном температурном режиме, но pH = 5,6 способность грибов к образованию ростовых трубок значительно снижалась. На 7-е сутки культивирования только 15,8% изолятов были способны к филаментации.

Параллельно с изучением культуральных особенностей оценивали ферментативную активность C. albicans. Продукция фосфолипазы проявлялась на 4 сутки инкубации лишь у 2% культур, а на 10 сутки при 37°С у каждого четвертого штамма. На питательной среде с pH = 5,6 половина изолятов продуцировали фосфолипазу через 8 дней культивирования. В условиях инкубации грибов при T = 22°С продукция этого фермента на протяжении 10 дней не выявлена. Значительно активнее C. albicans экскретировали протеиназу. Помутнение среды с добавлением бычьего альбумина наблюдали у 10% культур через 24 часа, у 17,5% через 72 часа, а на 10-е сутки инкубации при 37°С – у 92,5% штаммов. 90% Candida обладали эндоплазмакоагулазой в то время как ни одна из изученных культур не проявляла липазной активности.


Таким образом, изолированные из вагинального отделяемого штаммы C. albicans, обладали разнообразным спектром фементативной активности: высокой протеолитической, фосфолипазной и плазмокоагулирающей способностью. Примечательно, что при культивировании изолятов в условиях, сходных с обычно существующими в вагинальном биотопе (рН = 5,6;

Т =37°С), продукция ферментов была наиболее значительной. Штаммы, проявляющие наибольшую ферментативную активность при рН = 5,6, были изолированы от кандидоносителей и больных острым кандидозом. Изоляты, характеризующиеся выраженной фосфолипазной активностью и способностью к филаментации при рН = 7,4 выделены от женщин, страдающих бактериальным вагинозом. Следовательно, проявление тех или иных свойств C. albicans – это в значительной степени адаптивная реакция в ответ на особенности микроэкологических условий, формирующихся в вагинальном биотопе при различных состояниях.

РОЛЬ СЕРИН–ТРЕОНИНОВЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В РЕГУЛЯЦИИ ОТВЕТА НА ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС У ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCYSTS SP. PCC А. А. Зорина, М. П. Синетова, Д. А. Лось Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН, Москва, Россия zorina.anna@yahoo.com Цианобактерии являются уникальными представителями мира микроорганизмов.

Заселяя почти все освещаемые места обитания, обладая пластичным метаболизмом, они в настоящее время являются удобными модельными объектами для изучения целого ряда биологических процессов, таких как фотосинтез, азотфиксация, адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды.

Разнообразие цианобактерий, приспособленность к различным условиям обитания также отражаются в сложности их сигнальных систем. В передаче сигнала важную роль играет процесс фосфорилирования белков, катализируемый ферментами – протеинкиназами.

Кроме гистидиновых киназ (наиболее широко представленных у бактерий), у цианобактерий присутствуют и серин-треониновые протеинкиназы (СТПК).

В геноме цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 обнаружено 12 генов СТПК эукариотического типа (spkA-L). К настоящему моменту функционально охарактеризованы некоторые из них: протеинкиназы SpkA, SpkB участвуют в регуляции подвижности клеток цианобактерии, протеинкиназа SpkС вероятно вовлечена в регуляцию азотного метаболизма, а SpkD регулирует соотношение метаболитов цикла трикарбоновых кислот в зависимости от количества неорганического углерода в питательной среде.

В настоящей работе изучалась роль СТПК в ответе на тепловой стресс у цианобактерии Synechocystis.

Проведенный на начальном этапе скрининг коллекции мутантов (spkA-L) методом Нозерн блот-гибридизации позволил отобрать двух мутантов по протеинкиназам SpkH и SpkK, у которых в условиях теплового стресса была ослаблена экспрессия ряда стресс индуцируемых генов (hspA, sodB, slr0967, sll0528) по сравнению с диким типом. Это позволило предположить, что эти протеинкиназы вероятно влияют на экспрессию генов теплового шока. Поэтому в дальнейшем наше внимание было сосредоточено на изучении физиологических характеристик именно этих двух мутантных штаммов.

Анализ ростовых кривых и данных электронно-микроскопического исследования дикого типа и отобранных мутантных штаммов показал, что в нормальных условиях (32°С) жизнеспособность этих штаммов не отличается, тогда как в условиях теплового шока (44°С) выживаемость мутанта spkK выше, чем дикого типа и мутанта spkH. Также можно предположить, что различия, наблюдаемые в накоплении включений на начальных стадиях теплового шока, вероятно связаны с повышенной выживаемостью мутанта spkK в условиях стресса.

Исследование динамики накопления транскриптов генов (groEL2, sodB, sigB, htpG, clpB1), индуцируемых тепловым стрессом, у мутантов spkН и spkK и дикого типа методом Нозерн блот-гибридизации выявило отличие кинетики и запаздывание во времени максимума экспрессии активируемых повышенной температурой генов у spkК от кинетики экспрессии этих генов у дикого типа и второго исследуемого мутанта.

Вероятно, протеинкиназа SpkK регулирует продолжительность экспрессии стрессовых генов и, т.о., участвует в ответе цианобактерии Synechocystis на тепловой шок.

Поскольку показанная ранее ослабленная индукция экспрессии некоторых генов теплового шока у обоих мутантов по СТПК SpkK и SpkH может свидетельствовать о непосредственном взаимодействии в процессе передачи стрессового сигнала, то на основании этого предположения был сконструирован рекомбинантный штамм Synechocystis, дефектный по двум генам, кодирующим серин-треониновые протеинкиназы.

Исследование экспрессии индуцируемых тепловым стрессом генов у двойного мутанта выявило значительное сходство динамики накопления транскриптов генов clpB1 и sigB у двойного мутанта и дикого типа, однако при этом наблюдается пониженная интенсивность сигнала у мутантного штамма по сравнению с диким типом. Профиль экспрессии генов groEL2, groES у двойного мутанта по динамике схож с результатами для мутанта spkH.

Возможным объяснением полученных результатов может быть то, что исследуемые протеинкиназы находятся не в начале сигнального пути (т.к. отсутствуют трансмембранные домены), и поэтому сигнал передается также иными регуляторными элементами.

В настоящее время проводится работа по определению вероятного внутриклеточного субстрата исследуемых протеинкиназ.

Полученные данные позволяют заключить, что серин-треониновые протеинкиназы являются сигнальными элементами, играющими важную роль в адаптации цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803 к условиям температурного стресса. Однако особенности взаимодействия этих протеинкиназ с другими сигнал трансдуцирующими элементами и непосредственное положение в каскаде реакций требуют дальнейшего изучения.

КООРДИНАЦИОННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ CO(II) И NI (II) КАК РЕГУЛЯТОРЫ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ У ЦИАНОБАКТЕРИИ SPIRULINA PLATENSIS Л. С. Зосим1, Н. В. Ефремова1, Д. И. Еленчук2, Ч. М. Бивол1, Л. М. Батыр2, С. В. Джур1, О. П. Олан Молдавский государственный университет, Кишинев, Молдова Институт Микробиологии и Биотехнологии АН РМ, Кишинев, Молдова Несмотря на то, что многие живые организмы (облигатные аэробы) не могут существовать без кислорода, он является агентом, действующим разрушающе на все живое, с чем он соприкасается. Нарушение баланса окислитель/антиокислитель может привести к окислительному стрессу [1]. Передовой линией защиты от токсического действия свободных радикалов являются энзимы: супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза и др. [2].

Супероксиддисмутаза (SOD) осуществляет рекомбинацию радикалов O2– с образованием перекиси водорода и триплетного кислорода, являясь единственным среди известных антиоксидантных энзимов, непосредственно обеспечивающих обрыв цепей кислородзависимых свободнорадикальных реакций в клетках живых организмов [3].

Биомасса цианобактерии Spirulina platensis может служит источником SOD [4]. Благодаря ярко выраженным антирадикальным свойствам SOD, перспективным является его использование в области медицины и косметологии.

В связи с вышесказанным, целью данного исследования является изучение возможности использования координационных соединений Co(II) и Ni(II) в качестве регуляторов активности SOD в биомассе спирулины.

Объектом исследования являлась цианобактерия Spirulina platensis CNM-CB-02, хранящаяся в Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов Института Микробиологии и Биотехнологии АН РМ. В качестве регуляторов активности супероксиддисмутазы в биомассе цианобактерии Spirulina platensis были использованы координационные соединения Co(II) с адипиновой кислотой: [Co(COO(CH2)4COO) • 2H2O] в концентрациях 1, 5, 10, 20 мг/л и Ni(II) с яблочной кислотой в качестве лигандов:

[Ni(COO(CHOHCH2)COO) • 2H2O] в пределах концентраций 1-4 мг/л. Определение активности SOD осуществлялось по методу Winterbourn [5].

В ходе исследования было установлено, что влияние тестируемых координационных соединений Co(II) и Ni(II) на активность SOD находится в зависимости от концентрации и природы комплексов. Результаты биохимического анализа показали, что активность супероксиддисмутазы в биомассе спирулины, культивируемой в присутствии координационных соединений Co(II) и Ni(II) во всех используемых концентрациях превышает значения контрольной пробы. Максимальное увеличение активности SOD (1,35 и 1,40 раз по сравнению с контрольной пробой) было достигнуто при внесении в среду [Co(COO(CH2)4COO) • 2H2O] культивирования спирулины комплексов и [Ni(COO(CHOHCH2)COO) • 2H2O] в оптимальной концентрации 3 и 5 мг/л, соответственно.

Данный факт может объясняться значительным влиянием металла, входящего в состав координационного соединения. Так как никель и кобальт являются металлами, вызывающими явление окислительного стресса, ответной реакцией на него может служить повышение активности SOD, обладающего антиоксидантными свойствами [6].

Исходя из полученных результатов, можно заключить, что тестируемые координационные соединения никеля и кобальта в пределах исследуемых концентраций могут быть рекоммендованы в качестве стимуляторов активности супероксиддисмутазы в биомассе цианобактерии Spirulina platensis.

1. Flora S. J. Role of free radicals and antioxidants in health and disease. Cell Molecular Biology. 2007, vol. 53, no. 1, p.1-2.

2. Wolf F. L. The role and evolution SOD in algae. New Jersey, 2006, 132 p.

3. Ruth G., Heath L. Role of superoxiddismutases (SOD) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany. 2002, vol 53, no. 372, p.1331-1341.

4. Desai K., Sivakami S. Purification and biochemical characterization of a superoxide dismutase from the soluble fraction of the cyanobcterium Spirulina platensis. World J Microbiol.

Biotehnology. 2007, vol. 23, no.11, p. 1661-1666.

5. Winterbourn C. et al. The estimation of red cell superoxide dismutase activity. In: J. Lab.

Clin. Med. 1975, vol. 85, no. 2, p. 337-341.

6. Sultan S., Fatma, T. Phytotoxicity of heavy metals on Spirulina platensis. In: Phykos. 1999, vol. 38, no. 1-2, p. 87-92.

Выражаем искреннюю благодарность член-корреспонденту АН РМ, заведующему кафедрой „Неорганической и физической химии”, профессору Аурелиану Гуля и сотрудникам лаборатории „Координационной химии” Молд. ГУ за предоставленные координационные соединения. Исследования были выполнены в рамках проекта 09.819.18.02A, финансируемого Высшим Советом по Науке и Технологическому Развитию АН РМ.

АНАЛИЗ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССИНГА В ПОПУЛЯЦИИ E. COLI В ТЕЧЕНИЕ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА Р. С. Иванов, Т. С. Тропынина Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия Бактерии кишечной группы, типичным представителем которой является E. coli, присутствуют в нормальной микрофлоре кишечника животных и человека. Находясь в постоянном взаимодействии с макроорганизмом, бактериальное сообщество представляет собой динамичную систему, равновесие которой способствует поддержанию здорового метаболизма, иммунитета и адаптационного резерва макроорганизма, поддерживающего баланс с патогенными микроорганизмами. Деление микроорганизмов на патогенные и непатогенные является условным. Роль конкретного микроорганизма определяется его микроокружением и факторами внутренней среды макроорганизма. Изучение биохимических процессов, происходящих на разных фазах роста популяции бактерий, позволяет раскрывать возможные пути регулирования механизмов взаимодействия макро- и микроорганизмов. Целью данной работы был биохимический анализ особенностей Арг-X протеолитического процессинга в супраструктурах популяции прокариотических клеток на разных фазах роста в периодической культуре. При работе с протеомом прокариотической клетки использовался штамм E. coli JC-158 (Hfr PO1, thi, serA6, lacI22, relA1) (любезно предоставленный нашими коллегами И.В. Ступак и Е.Э. Ступак). Клетки E. coli JC- выращивали на богатой питательной среде LB (Лурия-Бертани) до полной логарифмической фазы, собирали центрифугированием и промывали трис-буфером. Первая проба была взята через 50 минут после начала инкубирования. Все клетки, собранные в течение от 50 мин до 430 мин с интервалами в 20 мин, были законсервированы в глицерине. Протеом E. coli фракционировали на основе разрыва слабых и сильных взаимодействий надмолекулярных структур с использованием ступенчатого повышения солевого градиента: 0,14 M NaCl;

0,35 M NaCl;

2 M NaCl;

6 M гуанидин – гидрохлорида с 0,004 % – меркаптоэтанолом на 0,01 М трис – HCl буфере при pH 6,8. Количество белка в надмолекулярных структурах определяли методом Бредфорд. Арг–X активность оценивали по расщеплению Арг–X связей в аргининбогатом белке – протамине («Merk») во всех вышеперечисленных фракциях. При переходе клеток в стационарную фазу экспрессия большинства бактериальных генов существенно уменьшается. В этих условиях происходит индукция экспрессии генов, обеспечивающих синтез белков, которые необходимы для устойчивости бактерий к неблагоприятным условиям. В этот период отмечается высокая непрерывная активность Арг–X процессинга на уровне клеточного остатка или «цитоскелета» клетки. Понимание механизмов регуляции экспрессии генов в разных фазах роста в периодической культуре, возможно, позволит найти способы воздействия на бактериальные клетки, которые в свою очередь обеспечат выгодное взаимодействие макроорганизма и микрофлоры.

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ РОДА SACCHAROMYCES ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ А. В. Кантерова, Г. И. Новик Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь Основной задачей коллекций является сохранение культур в жизнеспособном состоянии с присущими им диагностическими и хозяйственно-ценными свойствами. Для этой цели необходима разработка и применение эффективных методов длительного хранения микроорганизмов, таких как криоконсервация.

Дрожжевые грибы в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (БКМ) представлены 64-мя видами, относящимися к 32-м родам. Наибольшее количество штаммов (28) относится к роду Saccharomyces. Известно, что в спиртовом и винном производстве используют особые расы дрожжей рода Saccharomyces, которые способны переносить высокое осмотическое давление из-за больших концентраций в сбраживаемом субстрате сахаров, солей, а также спирта, образующегося в процессе ферментации.

Ранее в БКМ были проведены исследования по изучению сбраживающей активности у штаммов дрожжей рода Saccharomyces при ферментации солодового сусла. В результате адаптационной селекции по технологически важным признакам из штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-717 получен штамм S. cerevisiae Y-717С, который обладал термоустойчивостью и толерантностью к высокому содержанию этанола в сбраживаемом субстрате. Также в наших исследованиях использовались широко применяемые в течение длительного периода времени в промышленности дрожжи Saccharomyces cerevisiae р. ХП (в БКМ этот штамм поддерживается как БИМ Y-177), и БИМ Y-178 - винные дрожжи с высоким уровнем сбраживающей активности.

Культурально-морфологические особенности всех проверенных штаммов практически не отличались. Клетки дрожжей имели, в основном, овальную форму, располагались одиночно или в парах, наблюдалось активное почкование, размер клеток варьировал от 6 10 до 7 12 мкм. Через трое суток культивирования на сусло-агаре при +25°С колонии дрожжей имели диаметр 5–6 мм, круглую форму с ровными краями, светло-палевый цвет, блестящую поверхность, мажущуюся консистенцию.

Исследуемые штаммы были заложены на хранение при –70°С. Криоконсервации подвергались культуры, находящиеся в стационарной фазе роста (72 часа). Непосредственно перед закладкой культур на хранение, затем через 1 сутки и через 1 год хранения определялось количество живых клеток дрожжей методом предельных разведений.

Результаты экспериментов представлены в таблице.

Выживаемость ( КОЕ/мл ) дрожжей рода Saccharomyces после криоконсервации при –70°С Штамм Протектор Исходная Хранение в Хранение культура течение 1 суток в теч. 1 года 8 108 4 108 1 Y- 177 Глицерол, 10% об.

1,8 109 1,5 109 2 Сахароза, 10% об.

6 108 4 108 9 Y- 178 Глицерол, 10% об.

109 8 108 7,5 Сахароза, 10% об.

2,5 108 108 8 Y-717 Глицерол, 10% об.

2 108 9,4 107 7 Сахароза, 10% об.

2 108 1,3 108 1,1 Y-717 C Глицерол, 10% об.

3 108 7,2 107 6,9 Сахароза, 10% об.

Несмотря на то, что показатели выживаемости дрожжей после 1 года хранения при –70°С несколько ниже исходных, они были достаточно высокими, в связи с чем метод криоконсервации можно рекомендовать для длительного сохранения жизнеспособности сахаромицетов.

НИТРИЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ АЛИФАТИЧЕСКИЕ НИТРИЛЫ С. В. Козлов, В. А. Демаков Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Бактериальная трансформация нитрилов включает два известных метаболических пути:

нитрилазный и нитрилгидратазный. Нитрилазы гидролизуют нитрилы до соответствующих кислот без образования амидов и могут быть использованы в процессах биокаталитического синтеза карбоновых кислот. Поиск новых активных продуцентов обусловлен явными преимуществами биоконверсии нитрилов по сравнению с традиционным химическим синтезом [1-2]. В связи с этим актуальным является совершенствование методов выделения микроорганизмов, обладающих нитрилгидролизующими ферментами.

Методами накопительной культуры и прямого высева выделены клоны микроорганизмов, способные утилизировать нитрилы. Отбор штаммов бактерий, проявляющих нитрилгидролизующую активность, проводили по ранее разработанным схемам с применением сред, содержащих ацетонитрил, акрилонитрил или изобутиронитрил в качестве единственного источника азота и энергии. Для обнаружения и дифференцирования системы нитрилазной метаболизма от нитрилгидратазно-амидазной проведен ПЦР-анализ со специфическими праймерами к генам нитрилаз из шести известных бактериальных штаммов-продуцентов.

Наличие у изучаемых штаммов нитрилазной и нитрилгидратазно-амидазной системы метаболизма было подтверждено результатами реакции трансформации нитрилов с последующим газохроматографическим определением соответствующих продуктов трансформации. В результате скрининга образцов 10-ти типов почв, характерныхдля Пермского края, получено 36 штаммов, обладающих детектируемой нитрилазной (более 0, активностью мкмоль/мг/мин по отношению какрилонитрилу), в т.ч. 15 высокоактивных штаммов (более 3 мкмоль/мг/мин).

Показана высокая устойчивость нитрилазной активности изолятов к повышенным температурам (максимум активности проявлялся при 50–65°С) и высокая стабильность при хранении, что важно для их использования в биотехнологии.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 годы» (ГК№ 02.740.11.0078) и программой междисциплинарных исследований, финансируемой УрО РАН.

1. Chauhan S. Purification, cloning, sequencing and over-expression in Escherichia coli a regioselective aliphatic nitrilase from Acidovorax facilis 72W / S. Chauhan, S. Wu, S.

Blumerman et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – V. 61. – P. 118-122.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 



Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.