авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ИМ. С. Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН

НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИИ РАН

РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

АНО «НАЦИОНАЛЬНЫЙ КОМИТЕТ

ПО НАУКЕ И ПРОМЫШЛЕННОСТИ»

МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО»

МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ

«МИКРООРГАНИЗМЫ И БИОСФЕРА»

ТЕЗИСЫ

19 – 20 НОЯБРЯ 2007 г.

Москва - 2007 Организационный комитет конференции Председатель Гальченко В.Ф., член-корр. РАН, директор Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Заместитель председателя Пименов Н.В., д.б.н., зам. директора Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Члены оргкомитета Иванов М.В., академик РАН, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Заварзин Г.А., академик РАН, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Бухарин О.В., д.м.н., профессор, чл.-корр. РАН, академик РАМН, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН Ившина И.Б., д.б.н., профессор, чл.-корр. РАН, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН Пиневич А.В., д.б.н., профессор, Санкт-Петербургский Государственный Университет Дрюккер В.В., д.б.н., профессор, Лимнологический институт СО РАН Головлева Л.А., д.б.н., профессор, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН Мелентьев А.И., д.б.н., профессор, Институт биологии УНЦ РАН Намсараев Б.Б., д.б.н., профессор, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН Турковская О.В., д.б.н., профессор, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Грабович М.Ю., д.б.н., Воронежский Государственный Университет Евдокимова Г.А., д.б.н., профессор, Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра РАН Карначук О.В., д.б.н., Томский государственный университет Коробова Л.Н., к.б.н., Новосибирский Государственный Аграрный Университет Гальченко Н.В. –

Ученый секретарь Оргкомитета Адрес оргкомитета: 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Тел.: (495) 135-01-80, Факс: (495) 135-65- E-mail: natgal@inmi.host.ru ОСОБЕННОСТИ АНТАГОНИСТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП БАЦИЛЛ С ПОЧВЕННЫМИ ГРИБАМИ Г. Э. Актуганов, А. И. Мелентьев, Н. Ф. Галимзянова Институт биологии Уфимского научного центра РАН, Уфа, Россия Важной задачей современной биотехнологии является разработка безопасных и эффективных биологических средств борьбы с патогенными и вредными грибами.

Одно из решений этой задачи предполагает широкое применение препаратов на основе бактерий-антагонистов и их метаболитов, проявляющих активность против широкого спектра грибных патогенов. Для эффективного использования таких средств существенное значение приобретают накопленные знания о механизмах микробного взаимодействия на уровне антагонист – патоген. Изучение разнообразия и специфичности данных механизмов, а также влияния на них факторов внешней среды, будет способствовать лучшему пониманию особенностей антагонистического взаимодействия, направления их ко-эволюции и выработке основных критериев эффективности тех или иных штаммов-антагонистов. Эта проблема остается актуальной и при исследовании антагонистических свойств различных видов бацилл, представляющих собой обширную и гетерогенную в таксономическом отношении группу, многие представители которой традиционно широко применяются для контроля патогенных грибов.

В настоящей работе нами было изучено взаимодействие in vitro между тремя различными штаммами бацилл (Bacillus subtilis ИБ-54, Paenibacillus ehimensis ИБ-30, P.

ehimensis ИБ-X-b) и фитопатогенным грибом Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker.

Эксперименты проводили в условиях смешанной статической культуры в жидкой питательной среде при избытке, ограниченном доступе и дефиците питательных веществ.

В качестве исследуемых параметров изучали интенсивность роста гриба и бактерий в течение 6 сут при 28°С, продукцию ими внеклеточных антигрибных и антибактериальных соединений, а также активность миколитических ферментов в смешанной культуре.

Полученные нами результаты выявили существенные различия между штаммами групп B.

subtilis и P. ehimensis. В отличие от B. subtilis ИБ-54, оба штамма P. ehimensis были способны к индуцибельному синтезу хитинолитических ферментов и конститутивной продукции -1,3-глюканаз. Однако, в условиях репрессии синтеза соответствующих ферментов при избытке глюкозы/сахарозы (среда Чапека) B. sorokiniana проявлял высокую конкурентоспособность и повышенную устойчивость к действию миколитического штамма ИБ-30, что выражалось в секреции грибом антибактериальных веществ и снижении исходного титра бактерий. Напротив, более быстрорастущий штамм B. subtilis ИБ-54, не обладающий способностью к синтезу миколитических ферментов, полностью подавлял рост гриба в аналогичных условиях, как и близкий к ИБ-30 штамм P.

ehimensis ИБ-X-b. Оба этих штамма продуцировали большие количества антибиотических веществ, механизм действия которых на гриб, однако, существенно различался. В условиях ограниченного доступа легко усваиваемых питательных веществ, штаммы ИБ- и ИБ-X-b проявляли высокую миколитическую активность, которая коррелировала с секрецией таких ферментов, как -1,3-глюканаза и протеаза. Характер и эффективность действия B. subtilis ИБ-54 существенно не отличались в условиях избытка или недостатка питательных веществ. При дефиците органических источников углерода и азота все штаммы подавляли рост гриба, несмотря на резкое снижение скорости их размножения. В этих условиях увеличение количества вносимого в среду посевного материала B.





sorokiniana приводило к значительному возрастанию интенсивности роста миколитических штаммов ИБ-30 и ИБ-X-b, сопровождавшемуся секрецией заметных количеств хитиназы и -1,3-глюканазы.

Сходные результаты были получены при исследовании взаимодействия этих штаммов с грибом Fusarium culmorum (W.G. Smith) Sacc. и рядом сапротрофных микромицетов, что свидетельствует о существенном различии в механизме антагонистического действия и его опосредованности от факторов внешней среды даже у близких в таксономическом отношении штаммов аэробных спорообразующих бактерий.

РОЛЬ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ РАСТИТЕЛЬНО–МИКРОБНОЙ АССОЦИАЦИИ С. А. Аленькина, В. Е. Никитина Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Образование азотфиксирующих систем, подобно как и любых других биологических межклеточных взаимодействий, согласно современным представлениям, включает функционирование молекул белковой природы – лектинов. Исследование функциональной роли лектинов азоспирилл – представителя ассоциативной азотфиксирующей системы является перспективным направлением в выяснении молекулярных механизмов "узнавания", рецепции, контактных взаимодействий бактериальной и растительной клеток. Не менее важный научный интерес представляет изучение влияния лектинов на метаболизм клеток, поскольку, с одной стороны, это связано с решением фундаментальных вопросов взаимодействия микро- и макроорганизмов, с другой, знание биологической роли является задачей, решение которой приблизит исследователей к созданию наиболее эффективных и экологически чистых сообществ в прикорневой зоне растений, включающих сложные взаимоотношения между самими микроорганизмами и в ассоциации с растением.

Ранее нами было показано, что лектины азоспирилл выполняют роль адгезинов, обеспечивая специфическое прикрепление бактериальных клеток к корням пшеницы [1].

Было также показано, что лектины Azospirillum. brasilense Sp7 и Azospirillum. brasilense Sp7.2.3 (мутантный по лектиновой активности штамм)азоспирилл, находящиеся на поверхности бактерий способны оказывать влияние на активность,-глюкозидаз, галактозидазы корней проростков пшеницы. Обработка лектинов специфическими гаптенами (L-фукозой и D-галактозой) перед инкубированием с фракциями корней продемонстрировало уменьшение эффекта, оказываемого лектинами на ферментативные активности [2].

Детальное изучение механизма взаимодействия лектинов азоспирилл с гидролитическими ферментами проводилось на модельной системе, включающей лектины A.

brasilense Sp7, Sp7.2.3 и коммерческий препарат -глюкозидазы (sweet almonds). Было показано, что лектины оказывают ингибирующее действие на активность фермента, причем лектин мутантного штамма обладает большей активностью. С помощью метода дот-анализа на нитроцеллюлозной мембране было показана способность лектинов образовывать комплексы с -глюкозидазой. Было показано, что предобработка лектинов специфическими гаптенами также уменьшала эффект, но полного ингибирования не наблюдалось, что свидетельствовало о существовании неспецифических механизмов. В присутствии этанола и ряда солей(KCl, NaCl, СаCl2 для родительского и KCl, NaCl для мутантного штаммов), происходило усиление ингибирования лектинами активности фермента, что позволило сделать вывод о том, что при образовании лектин-ферментных комплексов наряду со специфическими существенную роль играют электростатические и гидрофобные взаимодействия.

С помощью метода химической модификации были идентифицированы функционально важные для образования комплексов с ферментом и проявления ингибирующего эффекта, аминокислотные остатки в молекулах лектинов. Показано, что 2, – пентандион, модифицирующий лизин, диэтилпирокарбонат – реагент на остатки гистидина, 2,3 – бутандион, модифицирующий аргинин, тетранитрометан – реагент для нитрования тирозина нивелировало действие лектинов на активность фермента.

Модификации аминокислотных остатков лектина мутантного штамма вызывали более значительное уменьшение ингибирующего эффекта по сравнению с лектином родительского штамма.

1. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы// Микробиология. 1996. Т.65. вып.2. С. 165-170.

2. S.A. Alen’kina, O.A. Payusova, V.E. Nikitina. Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic enzymes" // Plant and Soil.- 2006.- V.283.- № 1-2.

P. 147-151.

ОСОБЕННОСТИ АНТИМИКРОБНОЙ И ИНСЕКТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЕЙ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВЫ И ИСТОЧНИКОВ ДОЛИНЫ ГЕЙЗЕРОВ (КАМЧАТКА) И. С. Андреева, Л. И. Пучкова, Н. И. Печуркина, И. В. Саранина, О. В. Морозова1, Л. И. Бурцева2, Г. В Калмыкова2, В. Е. Репин ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская область, Россия;

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия Институт систематики экологии животных СО РАН, Новосибирск, Россия Энтомопатогенная активность, а также действующее начало биоинсектицидов с использованием Bacillus thuringiensis (Bt) обусловлены преимущественно присутствием параспоральных включений, состоящих из белков, известных как инсектицидные белки (Сry белки) или -эндотоксины. Известно, что различные подвиды Bt обладают также избирательным действием не только в отношении насекомых, но и микроорганизмов и других беспозвоночных. При микробиологическом анализе образцов почвы, воды и осадков источников Долины гейзеров выделены штаммы кристаллосодержащих, спорообразующих бактерий, предварительно определенне как относящиеся к виду Bacillus thuringiensis. Проведен сравнительный анализ морфологии и биохимических свойств этих штаммов, исследовано наличие у выделенных бацилл инсектицидной и антимикробной активностей.

Кристаллообразующие, содержащие эндоспоры бактерии (обозначены как Dg 1011, Dg-1015, Dg-1018, Dg-1024, Dg-992, Dg-994, Gi-47, Gi-117, Gi-416, Gi-424, Gi-429, Gi-443, Gi-466, Gi-528, Gi-530, Gi-535, Gi-542, Gi-719), обнаружены в пробах почвы, воды и осадков источников Долины гейзеров, взятых на различных участках ее территории, депонированы в коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Фенотипические признаки микробных изолятов изучены стандартными методами.

Для определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих фрагментам гена 16S рРНК, из чистых культур выделены суммарные ДНК. ПЦР проводили с универсальными праймерами, соответствующими гену 16S рРНК эубактерий: F1 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ и R1 5` CGGCTACCTTGTTACGACTT-3`. Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли с использованием BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit и автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США).

Филогенетический анализ проводили с использованием программы MEGA версии 3,1 для нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, определённых в данной работе и из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Наличие антагонистических свойств исследуемых бактерий определяли методом отсроченного антагонизма и изучая антибиотическую активность растворенных -эндотоксинов относительно тест-штаммов из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Анализ нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих гену 16S рРНК в совокупности с полученными фенотипическими признаками изолятов подтверждают их принадлежность к виду Bacillus thuringiensis. Надо отметить, что выделенные штаммы Bt имеют ряд характерных особенностей: часть штаммов на агаризованной среде образуют выпуклые, ослизненные, сливные, блестящие колонии, клетки могут иметь хорошо выраженные капсулы, что нетипично для Bt;

споры и кристаллы после разрушения спорангия остаются соединенными, морфологически это соединение отличается у разных штаммов и сохраняется длительное время. При наличии крупных параспоральных включений не для всех штаммов удалось получить электрофоретические картины составляющего их белка. Инсектицидная активность штаммов, с использованием тест-объектов Hyponomeuta evonymellus, Leptinotarsa decemlineata и Aedes aegypti, отсутствует или слабо выражена. Растворы -эндотоксинов штаммов Bt Долины гейзеров не угнетали рост Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonela thyphimurium, Shigella sonnei и C. albicans, в разной степени и в разных сочетаниях проявляли антагонистические свойства относительно тест-штаммов рода Micrococcus и фитопатогенов Pseudomonas fluorescens, Enterobacter sp. и Xantomonas malvacearum. Антибиотическая активность, определенная методом отсроченного антагонизм дала обратную картину: все штаммы подавляли рост Сandida albicans, штаммы Dg-1024, Dg-994, Gi-528 и Gi-530 обладали выраженным антибиотическим действием относительно бактерий кишечной группы и S. aureus. Штамм Gi-117 активно подавлял рост только C.albicans, ни один из штаммов не проявил антагонизма по отношению к B. subtilis. Полученные данные подтверждают известные сведения о различной природе инсектицидной и антимикробной активности штаммов Bt. Отличия исследованных штаммов Bt в антагонистических свойствах могут быть использованы при разработке на их основе биопрепаратов избирательного действия. Совокупность полученных данных позволяет предположить принадлежность выделенных авторами штаммов к новым, не описанным ранее подвидам Bacillus thuringiensis, возможно, являющихся эндемиками Долины гейзеров.

РАСТИТЕЛЬНЫЕ ЛЕКТИНЫ МОГУТ ИСПОЛЬЗОВАТЬСЯ РИЗОБАКТЕРИЯМИ КАК ФАКТОРЫ РОСТА Л. П.Антонюк, В. Е.Смирнова, Е. Ф.Соболева, Ю. Н.Садовникова, А. В. Шелудько Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Известно, что эубактерии, природным местообитанием которых является макроорганизм (животное или растение), способны использовать продуцируемые хозяином биологически активные вещества (например, интерлейкины млекопитающих) в качестве факторов собственного роста. Мы исследовали один из подобных случаев – стимуляцию роста эндофитных ризобактерий под влиянием растительных лектинов.

Эксперименты проводили, главным образом, с лектином пшеницы (wheat germ agglutinin, WGA) и лектином сои (soybean agglutinin, SBA): изучали их воздействие на рост азоспирилл и ризобий, известных в качестве эндофитов пшеницы. Кроме того, исследовали влияние SBA на рост Bradyrhizobium japonicum М-8, природного эндофита сои – компонента коммерческого препарата для стимуляции клубенькообразования и улучшения роста этой культуры.

Установлено, что WGA стимулирует размножение Azospirillum brasilense при росте этой бактерии как на жидкой, так и на полужидкой среде. В случае жидких сред ростовые параметры оценивали с использованием 3-х подходов: учитывали общее число клеток, биомассу 66-часовой культуры, высушенной до постоянного веса, а также число жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ). Показано, что рост A.

brasilense Sp245 в присутствии 5.6. 10-9 М WGA приводит к увеличению числа жизнеспособных клеток, однако при этом общее число клеток и биомасса в контроле и опыте остаются одинаковыми. Это, в свою очередь, позволяет предположить, что лектин пшеницы снижает количество клеток-персистеров в стационарной культуре A. brasilense и повышает в ней долю пролиферирующих бактерий. Стимулирующее влияние WGA на рост A. brasilense Sp245 и Sp7 варьировало в отдельных экспериментах в очень широких пределах – от нескольких десятков процентов до почти 5-кратного увеличения КОЕ в опыте по сравнению с контролем.

В случае полужидких сред стимулирующее влияние WGA на рост A. brasilense не удавалось выявить на агаризованной среде, однако эффект был хорошо воспроизводимым, когда для создания полужидкой среды использовали фитагель (Phytagel, Sigma).

Предполагается, что это связано с присутствием в составе агара N-ацетил-D-глюкозамин содержащих примесей, которые блокирует специфическое связывание лектина с клетками азоспириллы. На полужидкой синтетической среде с 1.4. 10-8 М WGA увеличение числа жизнеспособных клеток A. brasilense Sp245 составляло 1.5–4.3 раза по сравнению с контролем. Присутствие лектина в среде роста влияло также и на размер колоний;

так, число крупных колоний (более 4 мм) на среде с WGA было в полтора раза выше, чем в контроле, в то время как число мелких (менее 2 мм) снижалось примерно в два раза.

Важно отметить, что замена лектина пшеницы в среде роста азоспириллы на конконавалин А (лектин, специфичный к -D-маннозе и -D-глюкозе) или на бычий сывороточный альбумин приводила к элиминации стимулирующего эффекта белка.

Известно, что WGA экскретируется клетками корня в местах локализации азоспирилл и других ризобактерий, а также обнаруживается в межклетниках корня, колонизируемых азоспириллами. Это, в свою очередь, позволяет думать, что способность WGA стимулировать рост A. brasilense реализуется и в естественных условиях, т.е. лектин является одним из факторов формирования эффективного ассоциативного симбиоза пшеницы и A. brasilense.

Эксперименты с B. japonicum М-8 показали, что лектин сои стимулирует размножение бактерий при их росте на жидкой среде. SBA был активен при концентрациях 0.05, 5 и 50 мкг/мл и вызывал статистически достоверное, но невысокое (17 – 46 %) увеличение числа жизнеспособных клеток при их оценке традиционным чашечным методом. Замена SBA на WGA в среде культивирования бактерии приводила к ингибированию роста B. japonicum. Цитотоксический эффект WGA по отношению к ризобиальным клеткам был умеренным – число жизнеспособных клеток снижалось в среднем на 37 %, но проявлялся в широком диапазоне концентраций лектина пшеницы – от 10-10 до10-6 М. Можно предположить, что цитотоксический эффект WGA, описанный ранее для эукариотических клеток, может иметь физиологическое значение в тех случаях, когда эндофитная колонизация растений пшеницы ризобиями не стимулирует, а ингибирует рост макроорганизма-хозяина.

Таким образом, получены экспериментальные доказательства того, что растение может активно регулировать рост своих микросимбионтов посредством лектинов, экскретируемых им в окружающую среду. Данное явление описано, насколько нам известно, только для двух групп ризобактерий – для азоспирилл и ризобий;

остается пока неизвестным, насколько распространена компетентность к данным регуляторным молекулам растения среди ризобактерий. Остаются также невыясненными молекулярные механизмы, через которые реализуется стимуляция роста бактерии лектином или его цитотоксический эффект.

(Поддержано грантом Президента РФ, проект НШ-6177.2006.4.) ДЕТЕКЦИЯ SPIRONUCLEUS BARKHANUS (DIPLOMONADIDA: HEXAMITIDAE) В ЧЕРНОМ БАЙКАЛЬСКОМ ХАРИУСЕ МЕТОДОМ ПЦР Н. Л. Белькова1, Е. В. Дзюба1, Е. В. Суханова Лимнологический институт СО РАН, Иркутск, Россия Иркутский государственный университет, Иркутск, Россия Гексамитоз (спиронуклеоз) – инвазионное заболевание лососевых рыб, выращиваемых в искусственных условиях, возбудителем которого являются представители семейства Hexamitidae. Локализуются паразитические жгутиковые в желчном пузыре и передней части кишечника хозяина. Для лососевидных рыб специфичным паразитом является Spironucleus barkhanus Sterud, Mo, & Poppe, (Diplomonadida: Hexamitidae) – эукариотический организм, существующий в двух морфологически подобных типах. Первый – пресноводный тип, выделен из кишечника и желчного пузыря европейского хариуса Thymallus thymallus, а так же желчных пузырей сибирского хариуса Thymallus arcticus и арктического гольца Salvelinus alpinus, и не вызывает заболевания хозяина. Второй – морской тип, вызывает серьезные системные инфекции у выращиваемых в аквакультуре рыб, таких как атлантический лосось Salmo salar и арктический голец (Норвегия), чавыча Oncorhynchus tshawytscha (Канада) (Mo et al., 1990;

Kent et al. 1992;

Sterud et al., 1998 и др.). Периодические вспышки заболеваний лососевых рыб, вызванные представителями р. Spironucleus приносят огромные убытки рыбоводческим хозяйствам (Jorgensen, Sterud, 2006).

Черный байкальский хариус (Thymallus arcticus baicalensis Dybowski, 1874) эндемичный байкальский подвид, распространен в Байкале по всему побережью и в притоках озера (Сиделева, 2004). В литературе отсутствуют данные о находках S.

barkhanus в рыбах байкальского региона. При исследовании микрофлоры желудочно кишечного тракта черного байкальского хариуса из р. Ангары нами кроме бактериальных были получены последовательности S. barkhanus (Белькова и др., в печати). В связи с чем, цель настоящего исследования – оценить ареал распространения S. barkhanus в черном байкальском хариусе молекулярно-генетическим анализом.

Материалом для отработки метода послужили рыбы, выловленные из различных районов озера Байкал и его притоков: южная котловина озера (падь Кедровая) и напротив пос. Голоустное (р. Еловка), средняя котловина (о-в Ольхон, Ушканьи о-ва, м.

Орловский), Малое море (пос. Харанцы), а также из рек Ангара и Белая. Для анализа были взяты как свежеотловленные (59 экз.), так и замороженные (22 экз.) при температуре – 18°С рыбы разных возрастных групп (половозрелые и сеголетки). Для выделения суммарной ДНК отбирали фрагменты кишечника с остатками пищи (переваренные амфиподы) и желчные пузыри. Выделение суммарной ДНК из образцов проводили методами ферментативного лизиса с фенол-хлороформной экстракцией и модифицированной цетавлоновой очистки (Грачев и др., 2006). Суммарную ДНК использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции на паре праймеров Spiro-1F– Spiro-2R (Jorgensen, Sterud, 2004). Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе в Иркутском приборном центре коллективного пользования СО РАН. Сравнительный анализ последовательностей проводили с помощью пакета программ BLASTA. Филогенетическое древо строили с помощью пакета программ Mega v3.1.

Мы адаптировали видо-специфичную амплификацию непатогенного генотипа Spironucleus barkhanus с препаратов суммарной ДНК из желчных пузырей и кишечников хариуса. Нами показано, что оптимальной является температура отжига 55°С для праймеров Spiro-1F–Spiro-2R и 30 циклов амплификации. Специфичный ПЦР-продукт был получен только на препаратах ДНК, выделенных из свежеотловленных, а не замороженных рыб. Следует отметить, что не все особи являлись носителями этого паразитического организма. Из 13 проанализированных особей, отловленных с мыса Орловский, заражен был только один экземпляр, а из 20 проанализированных хариусов из южного Байкала, отловленных в устье ручья Еловка (пос. Голоустное) положительный ПЦР-продукт детектировали в 6 случаях. Кроме Байкала, из четырех экземпляров, выловленных в р. Ангара, в одном был также получен положительный результат.

Мы провели сравнительный анализ последовательностей, полученных из кишечника хариуса из р. Ангара с известными последовательностями, выделенными из лососевидных рыб водоемов Канады и Норвегии. На филогенетическом древе нуклеотидные последовательности байкальских представителей S. barkhanus образуют кластер вместе с другими непатогенными S. barkhanus. В то время как изоляты, имеющие патогенный генотип, с высоким показателем бутстреп анализа образуют отдельный кластер.

Таким образом, нами предложен быстрый и эффективный метод детекции непатогенного генотипа S. barkhanus в черном байкальском хариусе. Филогенетический анализ и видо-специфичная амплификация показали его идентичность с непатогенными представителями S. barkhanus из лососевых рыб, обитающих в пресных водах. В настоящий момент становится очевидным необходимость молекулярно-генетической детекции S. barkhanus в других видах лососевидных рыб из озера Байкал и других водоемов Сибири для уточнения ареалов его распространения.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 05-04-97221-р-байкал-а, № 07 04-00883-а.

СОВРЕМЕННЫЕ МИКРОБНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИИ ПОВЫШЕНИЯ НЕФТЕИЗВЛЕЧЕНИЯ С. С. Беляев1, И. А. Борзенков1, Т. Н. Назина1, А. Е. Иванова1, Р. Р. Ибатуллин2, М. В. Иванов Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Татарский научно-исследовательский и проектный институт нефти, г. Бугульма, Россия Микробные биотехнологии в последние годы находят все более широкое применение в нефтяной промышленности. Среди таковых следует отметить биотехнологии: 1) повышения нефтеотдачи пластов – улучшение процессов заводнения с использованием ферментативных микробных процессов;

модификация профиля проницаемости и селективная закупорка;

заводнение с применением биосурфактантов;

целенаправленная активация пластовой микрофлоры;

2) стимуляция добывающих скважин;

3) очистка скважинного оборудования от асфальто-парафиновых отложений.

Названные биотехнологии привлекают внимание малой инвестиционной потребностью, высокой эффективностью и экологической безопасностью.

Микробные технологии увеличения нефтеотдачи можно разделить на две основные группы. К первой – относятся технологии, в которых используются микробные метаболиты, полученные в промышленных установках – ферментерах. Эти методы близки к химическим и основаны на улучшении нефтевытесняющих свойств воды за счет таких соединений, как биоПАВы, полисахариды, растворители, эмульгаторы и другие.

Вторая группа, которая активно разрабатывается нашими научными коллективами, предусматривает активное целенаправленное развитие микробиологических процессов с образованием микробных метаболитов непосредственно в пласте. Образование микробных метаболитов, обладающих нефтевытесняющими свойствами, осуществляется либо присутствующими в пласте микроорганизмами, либо дополнительно интродуцированными. Субстратами для микроорганизмов являются питательные вещества, имеющиеся в пласте (остаточные углеводороды, минеральные компоненты), в других случаях, вводимые в пласт дополнительно (меласса, органические отходы, минеральные соединения и другие).

Разработанная нами базовая биотехнология повышения нефтеотдачи (БТПН) для месторождений в терригенными коллекторами, имеющими температуру менее 50°С, основана на активации геохимической деятельности микроорганизмов. Применение БТПН осуществляется на месторождениях, эксплуатирующихся с использованием заводнения пресной или слабо минерализованной водой, в результате чего в призабойной зоне нагнетательных скважин формируется микробиологическое сообщество (биоценоз), состоящее прежде всего из комплекса аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов и анаэробных метанобразующих бактерий. Технология метода циклическая и состоит из двух последовательных этапов: первый – целенаправленная активация аэробной микрофлоры в призабойной зоне нагнетательной скважины, результатом которого является образование жирных кислот, спиртов, био-ПАВ, биополимеров, СО2 и других нефтевытесняющих соединений. Второй этап – обычное заводнение, продвигающее выработанный на первом этапе комплекс нефтевытесняющих агентов к добывающим скважинам. На втором этапе, по мере создания анаэробной обстановки в пласте, часть продуктов метаболизма углеводородов утилизируется метаногенами с образованием метана – также известного нефтевытесняющего агента.

Опытно-промышленные испытания базовой БТПН и последующее внедрение на нефтяных месторождениях Татарстана позволили получить более 700,0 тыс. т дополнительной нефти при технологических затратах около 5 $ за тонну нефти. С целью расширения применения БТПН на месторождениях со сложными геофизическими условиями разрабатываются новые варианты биотехнологии.

PHENOTYPIC AND GENOTYPIC VARIABILITY OF LUPINE NITROGEN FIXING BACTERIA ISOLATED FROM TWO AGRICULTURAL PRACTICES B. Bir1, L. Kdbcz1, A. A. Kamnev, L. P. Antonyuk Research Institute for Soil Science and Agricultural Chemistry of Hungarian Academy of Sciences (RISSAC HAS), Budapest, Hungary Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences (IBPPM RAS), Saratov, Russia Bacteria with well-known properties for the biological nitrogen-fixation are important components of the various soil-plant ecosystems. Interrelation between the hosts and the microsymbionts, however is highly influenced by the biotic and abiotic environmental stress factors (Bir et al. 1993). More knowledge could be required about the capacities of such nitrogen-fixing populations for the stress-tolerance especially in case of the different agricultural practices (Bir, Antonyuk 2006;

Kdbcz et al. 2006). The former methodologies for estimating the microbial abundance of the nitrogen-fixing bacteria were using selective plates and a soil-dilution analysis, as it was described by J.M. Vincent (1970). This protocol was slightly modified in the every-day screening by Angerer et al. (1988). In parallel a novel “finger print”, BOX-PCR method was suggested by Kdbcz et al. (2005), which was appropriate for the population studies. It is known, that great differences might be found between the conventional and the organic agricultural practices, when considering the abundance and functioning of the nitrogen-fixing populations. Diversity of those microbes can be rather sensitive to any environmental conditions. The BOX-PCR method was used to study the genotypic variability in comparison with the more conventional phenotypic one, tested by some antibiotics.

Rhizobium bacteria were isolated from the root-nodules of lupine (Lupinus albus L. var.

nelly) grown either in a conventional arable field (n=25) or in the Westsik long-term, organic crop-rotation experiment (n=15) in Hungary. Isolates were stored in YEM agar slants (Vincent, 1970), including authentic lupine strains from the DSMZ collection (Germany). Antibiotic sensitivity of the isolates was measured on agar plates as diameter (d) of clear zones (mm) around the antibiotic (n=10) discs in 3 replicates. A BOX-PCR method was also used to study the genotypic population diversity (Kdbcz et al. 2005), by calculating the Shannon (H), the Margalef (R) and Pielou (E) indexes for the species composition-, richness- and evenness.

ANOVA was used to calculate the statistical differences.

Antibiotic sensitivity of Rhizobium loti strains, originating from the conventional arable fields of the lupine was rather balanced (d = 8–15 mm), independently in general from the sampling sites of the field or the particular plant-nodules. In case of the organic Westsik crop rotation experiment, when the rotated series of different crops (wheat, potato, lupine) or the fallow was combined with only organic fertilizer addition (farmyard manure and straw), the nitrogen-fixing bacteria was keeping their great variability of antibiotic-tolerance (d = 3– mm), with high variability within one plots or one plants. This higher phenotypic variability on the other hand was not accompanied with the genotypic characteristics, studied by the BOX-PCR assay. The opposite trend could be found, therefore between the arable lupine fields and the small plots of the organic crop rotation experiment when considering the phenotypic and genotypic variabilities. According to the Table 1, all diversity indexes was lower in the Westsik experiment, where no other leguminous plants was grown from 1921, than the lupine.

Table 1. Microbial diversity indexes of the lupinus Rhizobium loti isolates, originating from the conventional- and the long-term organic field experiments (n=15, 25 respectively).

Origine of lupine isolates Microbial diversity indexes Shannon (H) Margalef (R) Pielou (E) 2.75 5.29 0. Conventional agriculture 2.38 3.64 0. Westsik crop rotation experiment It is assumed, that the genotypic variability of rhizobium bacteria might be related to the presence or absence of the leguminous plants in the soil–plant ecosystems, especially on a long term level. Phenotypic characteristics, such as the antibiotic sensitivity are more particularly related to the current agricultural practices.

Supports of the Hung. Res. Funds (OTKA T046610), the CSIC-HAS, RAS-HAS agreements and the NATO grant (ESP.NR.NRCLG 982857) are highly acknowledged.

References:

1. Angerer I.P., BirB., Kves-Pchy K., Anton A., Kiss E. 1998: Indicator microbes of chlorsulfuron addition detected by a simplified soil dilution method. Agrokmia, Talajtan, 47: 297- 2. Bir B., Kves-Pchy K., Szili-Kovcs T., Szegi J. 1993: Effect of fertilizer on spontaneous rhizobium infection in Hungarian soils. Agrokmia, Talajtan, 42: 207- 3. Bir B., Antonyuk L.P. (2006): Factors affecting the Azospirillum-maize interaction and the success of artificial inoculation. p. 6-7. In: Proc. of. “Strategy of microorganisms and plants in stressed environments” (ed. Ignatov VV), Saratov, Russia (in Russian).

4. Kdbcz L., Halbritter A., Mogyorsi T. Bir B. 2005: BOX-PCR characterisation of Rhizobium populations. In: Understanding and modelling plant-soil interactions in the rhizosphere environment. Handbook of methods used in rhizosphere research.

(eds: R. Finlay, R. Sen). On-line version:

http://www.descience.net/COST631/handbook 5. Kdbcz L., Antonyuk L.P, Bir B. (2006): Fate of Azospirillum strains preceeding the soil inoculation in some organic carriers. P. 27-28. In: Proc. of. “Strategy of microorganisms and plants in stressed environments” (ed. Ignatov VV), Saratov, Russia (in Russian).

6. Vincent J.M. (1970): A manual for the practical study of the root nodule bacteria.

Blackwell, Oxford, pp. 164.

НОВЫЙ ВИД ANAEROBRANCA SP. СО СЛОЖНЫМИ ТРОФИЧЕСКИМИ ПОТРЕБНОСТЯМИ Ю. В. Болтянская, В. В. Кевбрин Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия В ходе поиска новых видов алкалофильных микроорганизмов из термальных полей Камчатки была выделена строго анаэробная термоалкалофильная органотрофная неспорообразующая бактерия штамм JW/VK-KS5Y. Проведенный филогенетичекий анализ с использованием 16S рДНК сиквенса показал принадлежность изолята к роду Anaerobranca. Согласно данным ДНК-ДНК гибридизации штамма с ближайшим родственником по кластеру A. horikoshii (51%) предполагается, что он составит новый вид. Штамм JW/VK-KS5Y растет в интервале температур 34–64°C с оптимумом при 54– 60°C. Интервал pH для роста составляет 7.7–9.9, оптимум – 8.5–9.0.

Первоначальное тестирование различных органических субстратов показало, что штамм JW/VK-KS5Y рос исключительно на дрожжевом экстракте, из 5 г/л которого образовывалось (мМ): ацетата – 3.1, водорода – 2.9, формиата – 1.9, пропионата – 0.7. В ходе детального исследования было выяснено, что рост на дрожжевом экстракте обусловлен одновременным использованием содержащихся в нем трегалозы (68.4 мг на г дрожжевого экстракта) и неидентифицированных пептидов. В модельном опыте, где дрожжевой экстракт (5 г/л) был заменен смесью трегалозы (1 г/л) и пептона (5 г/л), в котором трегалоза отсутствовала, урожай клеток был таким же, как в случае дрожжевого экстракта. Наличие трегалозы в составе различных дрожжевых экстрактов обнаружено нами впервые, поскольку производители не указывают этот дисахарид в технических условиях на продукт. Из других коммерческих субстратов сложного состава трегалозу содержит сойтон (продукт энзиматического гидролиза соевого белка), чем объясняется слабый рост на этом субстрате.

Тестирование дисахаридов (1 г/л), не входящих в состав дрожжевого экстракта, но представляющих биохимический интерес, показало, что сахароза и мальтоза утилизируются частично, а целлобиоза практически не используется. Таким образом, только трегалоза утилизируется полностью.

Микроорганизмы со сложными трофическими потребностями часто способны к одновременному использованию нескольких субстратов, что было проверено нами у штамма JW/VK-KS5Y. При росте с дрожжевым экстрактом в качестве основного субстрата помимо трегалозы, сахарозы и мальтозы организм использует как косубстраты пируват (полностью), глюкозу, крахмал, пектин и полигалактуронат.

Кроме брожения штамм оказался способен к восстановлению следующих акцепторов в присутствии 5г/л дрожжевого экстракта в качестве источника углерода и донора:

фумарата до сукцината, элементной серы до сульфида, тиосульфата до смеси сульфида и сульфита. Обнаруженное нами восстановительное диспропорционирование тиосульфата штаммом JW/VK-KS5Y является вторым подобным сообщением. Поскольку этот процесс относительно новый, то его значимость в природе может быть недооценена. Сульфат, нитрат, диметилсульфоксид, ацетон и сульфит не восстанавливались и не влияли на рост, тогда как нитрит и триметиламин-N-оксид полностью его ингибировали.

Проведенное физиологическое исследование показало, что в термофильном сообществе, откуда был выделен штамм JW/VK-KS5Y он, выполняет, вероятно, функцию диссипотрофа, питающегося продуктами распада растительных клеток, что подтверждается обнаруженной гидролитической активностью по отношению к вторичным растительным биополимерам.

АНАЛИЗ ПЕРЕСТРОЕК ГЕНОМА AZOSPIRILLUM BRASILENSE ПРИ ФАЗОВЫХ ВАРИАЦИЯХ В ПОДВИЖНОСТИ И. В. Борисов, Е. И. Кацы Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Подвижность бактерий является ключевым фактором при их адаптации к окружающей среде. Особенно это важно для почвенных микроорганизмов, существующих в гетерогенных условиях. Азоспириллы способны как к свободноживущему стилю существования в почве, так и к ассоциации с растениями;

подобное разнообразие экологических ниш требует сложной регуляции подвижности.

В настоящей работе выявлены фазовые вариации по подвижности на полужидких средах у модельного для исследований взаимодействия “однодольные растения – бактерии” штамма A. brasilense Sp245 и продемонстрировано влияние на частоту вариаций экссудатов проростков пшеницы.

Анализ с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и праймеров, соответствующих консервативным мотивам в повторяющихся последовательностях нуклеотидов (REP-ПЦР, BOX-ПЦР, ERIC-ПЦР), продемонстрировал перестройки в геноме A.brasilense Sp245, сопровождающие фазовые изменения характеристик подвижности.

Полученные результаты позволяют нам говорить о существовании сети регуляции подвижности в ответ на внешние факторы через внутригеномные перестройки.

Работа была частично поддержана грантами Президента РФ (НШ-6177.2006.4) и РФФИ (06-04-48204-а).

ЦИАНОБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СООБЩЕСТВА ЩЕЛОЧНЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ А. В. Брянская1, З. Б. Намсараев Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия В щелочных экосистемах круговорот биогенных элементов осуществляется преимущественно прокариотным сообществом алкалофильных микроорганизмов, основной фототрофной частью которого являются цианобактерии. Проведение анализа сходства цианобактериальных сообществ, развивающихся в различных градиентах рН и минерализации являлось задачей нашей работы.

Анализ был проведен на 9-ти предварительно хорошо изученных в гидрохимическом, гидробиологическом и альгологическом аспектах озерах Южного Забайкалья. Основные отличия в физико-химических характеристиках воды исследованных озер заключались в значительной разнице рН (от 7,4 до 9,9) и минерализации, которая колебалась от значений менее 0,01 до 40 г/л и более.

Проведенные нами ранее исследования позволили установить, что в большинстве щелочных озер Южного Забайкалья наблюдается активное развитие микробных матов, основу которых составляют цианобактерии. При определении таксономического состава было выявлено большое разнообразие морфотипов цианобактерий. Всего в озерных экосистемах Забайкалья к настоящему времени обнаружено 142 вида, разновидности и формы данной группы организмов. В сообществах, которые мы подвергли анализу, развивается 43% от всех обнаруженных таксонов. Доминирующими по численности и частоте встречаемости являются нитчатые формы класса Гормогониевые.

Предварительное сравнение состава сообществ показало, что цианобактериальные комплексы водоемов существенно различаются в качественном и количественном отношении.

С помощью коэффициента флористической общности Жаккара (k) в координатах:

виды;

роды – рН (7,0–8,0;

8,0–9,0;

9,0–10,0);

минерализация (0,0–0,1;

0,1–5,0;

5,0–10,0;

10,0–50,0 г/л) было проведено сравнение сходства цианобактериальных сообществ в озерах различного типа.

Самые низкие коэффициенты сходства (k = 0,05–0,16) получены при сопоставлении видового и родового спектров озер с пограничными значениями минерализации 0,0–0,1 и 10,0–50,0 г/л соответственно, что свидетельствует о значительном морфологическом отличии пресноводных форм от форм, развивающихся при высоком содержании солей.

Наибольшие коэффициенты сходства (0,62 для родов и 0,24 для видов) были получены при сопоставлении таксономического состава озер с минерализацией 0,1–5,0 и 5,0–10, г/л. Изменение минерализации как в сторону уменьшения, так и увеличения усиливало разнородность сообществ.

На видовом уровне сообщества цианобактерий, развивающиеся в диапазоне значений рН 7,0–9,0 имели несколько большее сходство (k = 0,22), чем те же, развивающиеся в диапазоне 8,0-10,0 (k = 0,20). Мало общего имели сообщества, развивающиеся при низко- и высокощелочных условиях (k = 0,15). В этом эксперименте максимальный k (0,55) отмечен на родовом уровне в диапазоне рН 8,0–10,0;

а минимальный также, как и для видового спектра при 7,0–8,0 – 9,0–10,0.

Сравнение состава цианобактерий щелочных озер Забайкалья показало, что сообщества, развивающиеся при близких значениях рН и минерализации, имеют высокий коэффициент сходства на родовом уровне. При этом при пограничных значениях рН (7,0– 8,0 и 9,0–10,0) и минерализации (0,0–0,1 и 10,0–50,0) четко прослеживается высокий уровень несходства как на родовом, так и на видовом уровне.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы РАН «Происхождение и эволюция биосферы», грантов Президиума СО РАН № 24, Министерства образования и наук

и РФ НОЦ «Байкал».

БИОСИНТЕЗ ЛИПОКСИГЕНАЗЫ И ЛИПИДОВ У АКТИНОМИЦЕТОВ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ –ИЗЛУЧЕНИЯ С. А. Бурцева, Н. И. Попова, И. О. Растимешина Институт Микробиологии и Биотехнологии Академии Наук Молдовы, Кишинев, Республика Молдова Липоксигеназе (ЛОГ) отводится большая роль в индуцировании защитных ответных реакций в клетке в различных стрессовых ситуациях, в том числе, при воздействии радиации, биогенных и абиогенных стрессоров. Результат включения ЛОГ-системы – образование оксигенированных производных жирных кислот (оксилипинов), многие из которых вызывают экспрессию «защитных» генов. В этих случаях наблюдается увеличение количества свободных ненасыщенных жирных кислот, которые под действием ЛОГ превращаются в оксилипины различного типа.

Проведены исследования с выделенной из почв Молдовы культурой Streptomyces levoris 22, ее естественным вариантом S. levoris 22 var. K-I и вариантами, полученным при -облучении штамма S. levoris 22 в дозах 1000 и 3000 Гр.

Результаты показывают, что после обработки -лучами в дозах 1000 и 3000 Гр выживаемость спор штамма S. levoris 22 составляла 1,85% и 0,09% соответственно.

При рассеве необлученной культуры S. levoris 22 в популяции преобладают колонии с белым воздушный мицелием (61,7%) и альтерколерный вариант. Карликовые и олигоспорогенные формы появляются после -облучения (9,2-13,2% и 3,4-4,6% соответственно).

У вариантов штамма S. levoris 22, полученных после -облучения в дозе 1000 Гр наблюдается уменьшение количества биомассы (на 23,6-48,3%), наряду с увеличением содержания липидов (на 5,6-39,5%). У вариантов, полученных после -облучения в дозе 3000 Гр отмечается снижение образования как биомассы, так и липидов (на 19,7-67,8%).

При определении фракционного состава липидов исходного штамма и вариантов выявлено некоторое уменьшение содержания фосфолипидов и стеринов наряду с увеличением содержания триглицеридов и суммарной фракции эфиров стеринов и восков у полученных вариантов.

Следует отметить, что ЛОГ активность резко возрастает (примерно в 10 раз) у вариантов, подвергнутых -облучению в дозе 3000 Гр. По-видимому, снижение содержания фосфолипидов в этих условиях обусловлено их участием в ЛОГ-защитной системе: распадаясь под действием фосфолипазы, они поставляют жирные кислоты для ЛОГ.

При сравнении жирнокислотного состава липидов у исследуемых стрептомицетов необходимо подчеркнуть значительное увеличение содержания полиненасыщенных жирных кислот у вариантов, полученных после -облучения: уровень линолевой кислоты возрос почти в 4 раза, а эйкозапентаеновой кослоты – почти в 7 раз.

Вероятно, наблюдаемое в нашем случае резкое повышение ЛОГ-активности способствует предотвращению губительного «удара» -излучения. Снижение количества фосфолипидов и увеличение содержания полиненасыщенных жирных кислот также направлено на эту цель, т.к. полиненасыщенные жирные кислоты являются субстратами для ЛОГ и интермедиатами в цепи ЛОГ-защитной системе.

СТИМУЛЯЦИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ У ЧЕРЕНКОВ ВИНОГРАДА ЭКЗОМЕТАБОЛИТАМИ STREPTOMYCES LEVORIS С. А.Бурцева1, О. Ф.Ткачук2, И. О.Растимешина1, С. Д.Тофилат Институт Микробиологии и биотехнологии АН РМ, Кишинев, Республика Молдова Государственный Аграрный Университет Молдовы, Кишинев, Республика Молдова Использование микробов-активаторов становится особенно актуальным в условиях ведения интенсивного сельского хозяйства и обеспеченности растений питательными веществами. Будучи потомками древних обитателей Земли, микроорганизмы, несомненно, могли вступать в разнообразные взаимоотношения с высшими формами жизни, и в первую очередь с растениями, на всех стадиях эволюции последних (Калакуцкий, Шарая, 1990). Особое внимание в последнее время уделяется представителям рода Streptomyces, так как современные исследования свидетельствуют, что среди продуктов метаболизма стрептомицетов обнаружены гиббереллины, ауксины и другие фитогормоны. Находясь в ризосфере и обладая способностью к образованию различных физиологически активных веществ, актиномицеты играют существенную роль в жизни растений (Возняковская, 1989). В связи с этим целью наших исследований явилось изучить влияние экзометаболитов стрептомицета (Streptomyces levoris 22) на корнеобразовательную способность у черенков винограда, характеризующихся разной регенерационной способностью. Раннее нами была выявлена способность этого штамма синтезировать гетероаксины.

Исследования по изучению действия экзометаболитов стрептомицетов (ЭМ) на регенерационные процессы черенков винограда проводились в лаборатории искусственного климата кафедры ботаники и физиологии растений ГАУ Молдовы, в контролируемых условиях, на технических (Виорика) и столовых (Молдова) сортах винограда, устойчивых к филлоксере. Для испытания комплекса ЭМ Streptomyces levoris 22, выделенного из почвы Молдовы и отличающегося от других изолятов хорошим ростом и способностью задерживать рост фитопатогенных микроорганизмов, использовали ряд растворов в концентрации 1,0;

2,0;

4,0%. Контролем служили черенки вымоченные в воде. ЭМ получили в результате культивирования стрептомицета на питательных средах М-I или SP, содержащих кукурузную муку или кукурузную + соевую муку, как основных источников углерода, на вибростоле в течение 5 суток при температуре 27°С. Культуральная жидкость, содержащую комплекс ЭМ Streptomyces levoris 22, отделяли от биомассы центрифугированием.

Регенерационную активность черенков винограда (образование корневых зачатков, корней, а также рост побегов) определяли в динамике на 14, 21, 28 и 35 дни проращивания.

Выявлено, что корнеобразование у черенков исследуемых сортов винограда зависит от сортовых особенностей и физиологической активности тканей. Сорт Молдова характеризуется высокой ризогенной активностью, Виорика – средней. Установлено, что реакция черенков винограда на обработку ЭМ S.levoris 22 специфична и зависит от среды культивирования штамма, концентрации раствора и сортовых особенностей черенков винограда. После обработка черенков винограда ЭМ Streptomyces levoris 22 замечено ускорение формирования корневых зачатков и образования корней на более ранних этапах проращивания. Причем этот процесс происходит активнее в вариантах опыта с применением ЭМ этого штамма, выращенного среде SP. Определена оптимальная концентрация растворов ЭМ: после культивирования на среде SP – 1,0% и на среде М-I – 4,0%. После обработки ЭМ стрептомицета количество укоренившихся черенков составляет 90,0 –96,7% С увеличением концентрации раствора ЭМ (среда SP) или уменьшением (среда М-I) происходит снижение ризогенной активности черенков.


Установлено, что у исследуемых сортов винограда под влиянием ЭМ стрептомицета возрастает количество корней, а также их длина и рост побегов. Показано, что при обработке ЭМ S.levoris 22 возникают разные корреляционные взаимоотношения между числом корней, параметрами роста побегов и корневой системы. Эффективность действия ЭМ Streptomyces levoris на регенерацию черенков проявляется как на сортах с высокой (Молдова), так и на сортах, характеризующихся средней ризогенной активностью (Виорика).

Таким образом, проведенные исследования показывают перспективность практического применения экзометаболитов стрептомицетов для стимуляции корнеобразования у черенков винограда с разной ризогенной активностью.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ПОЧВ И ИХ МОНИТОРИНГА И. Н. Волкова, О. В. Старкова Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова проезд Матросова, 9150057, Ярославль, Россия Тел. (4852) 48-07- E-mail: ver@bio.uniyar.ac.ru В решениях международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» одним из наиболее востребованных в ближайшее время направлений природоохранных исследований обозначена разработка информативных показателей экологического состояния почв и надежных, доступных методов их определения. Эти показатели и методы необходимы для адекватного определения экологического качества почв, их ценовой стоимости, регламентации использования. Данная работа относится к исследованиям названного направления, ее целью является отбор наиболее надежных и доступных методов диагностики антропогенных нарушений дерново-подзолистых почв на основе ряда микробиологических показателей. В качестве объектов исследования были выбраны почвы разной степени нарушенности г. Ярославля и его южного промышленного узла.

В силу разнокачественности антропогенных воздействий на почвы городов и промышленных зон (рекреация, загрязнение, перемешивание, скальпирование) диагностика степени их нарушенности, по-видимому, возможна только по интегральным показателям. Таким интегральным показателем служит плодородие – способность почвы производить урожай не только в агрономическом, но и общебиологическом смысле.

Общепризнано, что из всех представителей почвенной биоты микроорганизмы наиболее чутко реагируют на изменение условий обитания. Немаловажно и то, что микроорганизмы чувствительны именно к первым, часто мало заметным этапам нарушения, к низким концентрациям поллютантов. Эта особенность делает микроорганизмы крайне привлекательными как для целей мониторинга, так и для теоретического обоснования устойчивости различных почв к антропогенным воздействиям.

К категории интегральных показателей биологической активности следует, в первую очередь, отнести реальную биологическую активность, определяемую по интенсивности выделения газов в полевых условиях. На наш взгляд, существуют две объективные причины, по которым эти методы не часто используются для мониторинговых целей. Во первых, особенностью показателей реальной биологической активности является их зависимость от гидротермических и пространственных условий. Флуктуации, связанные с сезонностью, могут в ряде случаев быть больше, чем от антропогенных воздействий. Во вторых, эти методы требуют хорошей приборной базы от исследовательских учреждений.

Поэтому вполне понятен интерес к менее затратным, но не менее надежным критериям оценки состояния почв.

В 2004-2005 гг. нами были изучены 16 почв г. Ярославля и его пригородов разной степени нарушенности: техноземы и урбаноземы (сильно нарушенные), урбо-дерново подзолистые (средненарушенные), дерново-подзолистые почвы городских парков и лесопарков (малонарушенные) – относительный контроль и почвы пригородных территорий (не нарушенные) – абсолютный контроль. В сезонной динамике (лето-осень) были проанализированы: реальная и потенциальная ферментативная активность, определявшаяся по интенсивности накопления белков и аминокислот, протеолитическая активность, фитотоксичность (по проросткам). Для диагностики степени антропогенных изменений и устойчивости к ним почв использовали метод инициированного микробного сообщества.

Накопление аминокислот зависит от степени нарушенности почвы и изменяется однотипно как in situ, так и in vitro. Так, самые низкие значения показателя характерны для техноземов. Урбаноземы и урбо-дерново-подзолистые дают значительный разброс показателей накопления нингидринположительных веществ – от средних до высоких. Эта закономерность уже отмечалась другими исследователями и связана со стимулирующим эффектом низких концентраций загрязняющих веществ. Почвы фоновых территорий имеют средние показатели нингидринположительной активности. При этом лабораторные показатели в 1,1–1,6 раза выше таковых, полученных в природе. Однотипная закономерность получена и для белков. Сезонные колебания этого показателя (лето – осень 2004г.) составляют 3–15% для одной и той же почвы (как in situ, так и in vitro);

осенние показатели, как правило, выше летних. Мониторинг в контролируемых условиях лаборатории может дать более рельефно выявляющиеся тенденции в многолетних наблюдениях, так как позволяет отмести влияние сезонных флуктуаций в разные годы.

Протеолитическая активность измененяется однотипно с показателем накопления аминокислот и белков. Показатель фитотоксичности, определяемый по проросткам, малочувствителен и не подходит для ранней диагностики нарушений почвы. Исходя из вышесказанного, мы считаем, что для целей мониторинга лучше использовать именно показатели потенциальной активности микробиоты, получаемые в строго контролируемых условиях лаборатории.

Для исследования структуры микробных сообществ почв промзоны г. Ярославля определяли общую численность сапротрофных микроорганизмов, численность углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) на среде Бушнела-Хааса, изучали видовое разнообразие сапротрофов в каждом образце, выявляли доминанты, субдоминанты, редко встречающиеся виды и на основе этих данных строили синэкологические диаграммы. Общее число сапротрофных видов каждого образца близко (0.1–8, 0.2–9 и 0.3–8). Около 50 % всех культур каждого образца составляют кокки, примерно 25% – палочки и столько же – актиномицеты;

абсолютное большинство штаммов – грамположительные неспорообразующие. По величине зоны гомеостаза можно говорить о сходной буферности к выбранным загрязнителям дерново-глеевой (1мл/кг для ДТ и 0,5–1 мг/кг для нефтешлама) и дерново-подзолистой почв (0,7–0,8 мл ДТ/кг и 0,5–1 мг шлама/кг). Однако анализ структуры микробного сообщества у этих образцов в других адаптивных зонах позволяет говорить о большей потенциальной устойчивости к загрязнению дерново-подзолистой почвы (0.1), т.к. она обладает очень протяжённой зоной стресса 0,7–70 мг ДТ/кг и значительной зоной репрессии 70– мгДТ/кг. У дерново-глеевой почвы границы зоны стресса гораздо уже (1–8 млДТ/кг).

Функциональные показатели потенциальной микробиологической и ферментативной активности в сочетании с классическими химическими анализами почвы, по нашему мнению, целесообразно использовать для мониторинга почв. Структурные микробиологические показатели дают более объемную информацию о состоянии почв и позволяют, в определенной мере, прогнозировать их устойчивость к нарушениям, особенно к химическому загрязнению. Эти показатели подходят для экспрессной диагностики нарушенности почв. Такие показатели, дополненные данными о реальной физиологической активности микроорганизмов (например, о дыхании, азотфиксации) будут наиболее надежными и достоверными и подходят для детальной диагностики антропогенных нарушений почв.

ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ МИКРОБНОГО ЦЕНОЗА В ПОЧВЕ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ДИМЕТИЛФТАЛАТОМ К. В. Волкова Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь Промышленные предприятия, производящие пластификаторы, синтетические волокна, пластические массы и изделия из них, загрязняют окружающую среду фталевыми эфирами, содержащимися в атмосферных выбросах и сточных водах. Фталаты обнаруживаются в почве, воде, озерных и морских отложениях, атмосферном воздухе, ракообразных, рыбе, готовых пищевых продуктах, оливковом масле, молоке, консервах, длительно хранившихся в полимерной упаковке, в крови, моче и жировой клетчатке животных и людей.

Диметиловый эфир орто-фталевой кислоты (ДМФ) токсичный слаборастворимый субстрат, широко применяемый в промышленности как пластификатор, растворитель, репеллент, а также используемый при изготовлении косметики, смазочных материалов, тканей и пр. В объекты окружающей среды данный токсикант может попадать вследствие несовершенства технологических процессов, в процессе утилизации промышленных и бытовых отходов, а также, из-за отсутствия прочных химических связей с полимерами, из пластиковых упаковочных материалов и изделий бытового назначения. К сожалению, в проанализированной литературе нами не обнаружено работ, освещающих токсическое действие ДМФ на микрофлору почвенных и водных ценозов. Известно, что в невысоких концентрациях (до 0,05%) ДМФ может быть утилизирован многими почвенными бактериями и грибами. Однако при этом зачастую накапливаются продукты первичного метаболизма, являющиеся более токсичными, чем исходное вещество. Чрезвычайно мало известно о воздействии высоких концентраций данного токсиканта на клетки микроорганизмов.

Целью настоящей работы было изучение действия диметилфталата на численность микроорганизмов различных эколого-трофических групп, общую биомассу бактерий и микромицетов в почве. В модельном эксперименте использовали дерново-подзолистую почву Биологической опытной станции Института генетики и цитологии НАН Беларуси, которую обрабатывали диметилфталатом (ДМФ) в концентрации от 0,2 (минимальная) до 2 (максимальная) мл/100 г почвы. Компостирование почвы проводили в течение 60 суток при постоянной температуре (25°С) и влажности (60% от полной влагоемкости).


Количество микроорганизмов различных эколого-трофических групп определяли методом разведений и последующего высева на элективные питательные среды. Биомассу бактерий и микромицетов учитывали с помощью прямого микроскопического метода, используя люминисцентную микроскопию.

Установлено, что уже в минимальной концентрации ДМФ угнетает рост различных групп почвенных микроорганизмов: количество микромицетов, актиномицетов и энтеробактерий на 10-е сутки снижалось в 2 раза, спорообразующих бактерий – в 1,5 раза, количество олиготрофов и микроорганизмов, усваивающих минеральные формы азота, уменьшалось на 20%.

При концентрации ДМФ свыше 1 мл/100 гр почвы микромицеты через 30 суток культивирования не обнаруживались вовсе, количество спорообразующих бактерий снижалось в 30 раз, количество микроорганизмов, усваивающих минеральные формы азота снижалось в 50 раз.

Среди микроорганизмов, устойчивых к действию высоких концентраций ДМФ следует особо отметить бактерии рода Pseudomonas. При максимальной концентрации ДМФ в почве количество микроорганизмов, усваивающих органические формы азота, снижалось до 20% от исходного. Среди устойчивых к действию ДМФ микроорганизмов превалировали псевдомонады.

Микроорганизмы-деструкторы, способные утилизировать ДМФ в концентрациях 0,1 % и выше, в образцах исследуемой почвы выявлены не были.

Таким образом, ДМФ в концентрациях свыше 0,2 г/100 г. почвы значительно нарушает структуру микробного ценоза почвы, вызывая снижение численности всех исследованных групп почвенных микроорганизмов. При этом наиболее чувствительными к действию данного токсиканта оказываются микромицеты и актиномицеты. Можно предположить, что в природных условиях, не столь благоприятных, как экспериментальные, уровень ингибирования будет значительно выше.

В связи с этим можно заключить, что аварийные выбросы ДМФ в биосферу в больших количествах могут неблагоприятно влиять как на отдельные компоненты биоценозов, так и состояние естественного баланса микро- и макрофлоры в целом.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ РОДА ARXULA ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА Е. А. Воронова1, П. В. Ильясов2, Т. Н. Кувичкина2, А. Е. Китова2, Е. В. Емельянова2, А. Н. Решетилов Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия В настоящее время актуальны разработки методов и аппаратуры для экспресс анализа проб воды. Список объектов, для которых данный тип анализа актуален, включает образцы сточных вод (муниципальных и промышленных), образцы вод, полученных из объектов окружающей среды (реки, озера, водохранилища). Одним из параметров, определяющим загрязненность проб воды, является биологическое потребление кислорода (БПК). В соответствии с мировой практикой эффективным подходом для оценки БПК является биосенсорный. Он основан на том, что в рецепторном элементе сенсора используется биоматериал, обладающий широкой субстратной специфичностью при окислении органических соединений. За рубежом в анализаторах подобного типа применяются запатентованные штаммы микроорганизмов, представляющие коммерческую ценность [1]. В связи с этим имеет значение исследование штаммов, принадлежащих коллекции Российской Федерации. Известно, что из всех описанных дрожжевых организмов вид Arxula adeninovorans способен утилизировать широкий круг органических соединений [2]. В работе была использована дрожжевая культура A.

adeninovorans ВКМ Y-2676, полученная из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Данный штамм применяется в качестве производственной культуры на гидролизных заводах [2].

Целью работы являлось создание лабораторной модели биосенсора для детекции БПК на основе дрожжевой культуры A. adeninovorans ВКМ Y-2676.

Культуру поддерживали на сусло-агаре. Для засева инокулята использовали 2-3х дневные скошенные культуры. Инокулят выращивали часов на глюкозо-пептонной среде в витаминных пробирках на качалке при 37°С в течение 40 ч. Дрожжи отделяли центрифугированием. Клетки бактерий иммобилизовали методом физической адсорбции на хроматографической бумаге Whatman GF/A (Великобритания). Полученный биорецептор помещали на рабочую поверхность кислородного электрода, который использовали в качестве преобразователя. Измерения проводили в открытой кювете объемом 2 мл, объем пробы составлял 20 мкл. В качестве базового раствора использовали первоначально калий-фосфатный буфер 30 мМ, рН 7.6. Измерения проводились при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Измеряемым параметром (сигналом сенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов. В экспериментах по созданию БПК-сенсора в качестве контрольного раствора использовали глюкозо-глутаматную смесь (ГГС), концентрация в кювете составляла 150 мг/л. Для построения субстратной специфичности использовали растворы субстратов, концентрация которых в кювете составила 10 мМ.

Исследование кривой роста дрожжевой культуры A. adeninovorans ВКМ Y показало, что начало стадии замедления роста приходится на 15–16 часов, что соответствует максимальному накоплению ферментов, их высокой активности.

Полученную биомассу использовали в качестве биорецептора биосенсора для детекции БПК. Для определения оптимального количества адсорбированной на мембране биомассы строили зависимость ответов сенсора от количества иммобилизованной биомассы.

Оптимальным нанесением на мембрану является 1 мг сырого веса. Подобраны оптимальные значения рН и ионной силы буферного раствора. Оптимальным базовым раствором является 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 7.0. Диапазон детекции ГГС составлял 0.003-0.15 г/л. Ошибка измерения составляла не более 5%. Сенсор позволял выполнять анализ единичной пробы в течение 20 мин. Сенсор обладал широкой субстратной специфичностью. Получены ответы на все 33 использованные субстрата.

Сенсор характеризовался наибольшей чувствительностью к углеводам (целлобиоза, мальтоза, манноза, арабиноза, сорбит), низшим алифатическим спиртам (бутанол, пропанол, этанол, изобутанол), а также к аскорбату, глутамату и додецилсульфату натрия.

В течение 4-х дней ответы сенсора были стабильны, на 5-е сутки наблюдалось падение на 50%.

1. Liu J., Mattiasson B. Microbial BOD sensors for wastewater analysis // Water Research.

2002. V. 36. P. 3786–3802.

2. Голубев В.И. Таксономическая характеристика дрожжей, используемых в гидролизно-дрожжевых производствах. // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30. Вып. 1. С. 132-136.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ СООБЩЕСТВА ГИДРОТЕРМ КАЛЬДЕРЫ УЗОН (КАМЧАТКА) В. Ф. Гальченко1, Е. С. Баринова1, О. А. Подосокорская2, В. Н. Акимов Институт микробиологии им. Н.С.Виноградского РАН, Москва, Россия Воронежский государственный университет, Воронеж, Россия Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, Россия Методами молекулярной биологии, световой, УФ и электронной микроскопии исследованы бактериальные сообщества гидротермальных источников Кальдеры Узон (Камчатка) с диапазоном температур 26–60°С и разнообразными гидрохимическими параметрами (рН, Eh, катионно/анионный состав воды, газовые компоненты). Изученные микробные сообщества представляли собой бактериальные маты, выстилающие стенки и чаши гидротермальных источников на глубине 5–25 см. Основная цель исследования – оценка таксономического разнообразия микробных сообществ и физиологического статуса клеток микроорганизмов. Таксономическую структуру сообществ изучали методом клоновых библиотек, физиологический статус клеток (вегетативные, лизированные и покоящиеся формы, минеральные бактериоморфы) определяли на основе цитологических характеристик и элементного состава клеток.

Количество выявленных филотипов в клоновых библиотеках каждого из 5-ти исследованных гидротермальных источников варьировало от 2 до 5. Клоновые доминанты (олигодоминанты) выявлены в четырёх из пяти источников: I (температура источника 60оС) – Sulfurihydrogenibium sp.;

II (43°С) – некультивируемый организм класса Gammaproteobacteria;

III (40°С) – близкий к Rhodoferax ferrireducens;

IV (37°С) – близкий к Chlorobium tepidum. Их доминирующее положение было также подтверждено цитологическими исследованиями. В источнике с более мягкими условиями (26°С) соотношение пяти выявленных филотипов было примерно одинаковым. Поскольку температуры 37–43°С не являются экстремальными, можно полагать, что доминирование филотипов в этих источниках связано не с температурой, а с другими гидрохимическими параметрами среды обитания.

Проведенные нами исследования (экспедиции 2005–2007 гг.) свидетельствуют, что в гейзерах и газогидротермальных источниках Камчатки прокариотные археи, бактерии и цианобактерии в превалируют и выявлены нами как микроскопически, так и традиционными методами микробиологии и биогеохимии. Установлено, что эти сообщества чрезвычайно бедны в таксономическом плане (методы микроскопии и молекулярной биологии), для них характерна резкая в топографическом плане смена видов, родов и даже царств в зависимости от физико-химических условий, в первую очередь температурных, и они проявляют чрезвычайно высокие скорости роста. Для выяснения степени влияния геохимических факторов на выживаемость микроорганизмов и сукцессию в таких экстремальных экосистемах было исследовано температурное распределение, топография и динамика распределения температур в гейзерит цианобактериальном полях с помощью программируемых термодатчиков (термохронов).

На основании изучения более 30 источников Кальдеры Узон выявлены неизвестные ранее закономерные колебания температурных, гидрохимических и микробных параметров гидротермальных источников, зависящие от погодных суточных условий. Очевидно, что система гидротерм является менее стабильной, чем предполагалось ранее.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно полагать, что температура является основным фактором, ограничивающим уровень разнообразия микробного сообщества в гидротермах с температурой выше 50°С. В низко- и мезотемпературных источниках факторами, ограничивающими разнообразие микробного сообщества, по-видимому, являются другие гидрохимические параметры среды. В экстремальных температурных и гидрохимических условиях микробное сообщество базируется на одном-двух доминирующих видах. Другие малочисленные микроорганизмы существуют как сопутствующие олигодоминантам. Микроскопические подходы позволили в этих сообществах выявить микроорганизмы, не принадлежащие известным таксонам, и, вероятно относящиеся к некультивируемым организмам.

О ВОЗМОЖНОЙ РОЛИ СПУТНИКОВОЙ МИКРОФЛОРЫ В АССОЦИАЦИЯХ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ С. Р. Гарипова Башкирский государственный университет, Уфа, Россия В природной среде жизнедеятельность микроорганизмов является результатом сложных взаимодействий между разными видами. В пробах, взятых в природе, почти никогда не находят микроорганизмов в виде чистых культур. Следуя этой логике и желая ускорить процесс скрининга эффективных клубеньковых бактерий для инокуляции гороха в условиях Южного Урала, мы проводили отбор не только чистых культур ризобий (о них здесь речь идти не будет), но и «неочищенных» ассоциаций бактерий из клубеньков растений, полагая, что клубеньки будут образованы только ризобиями, а так называемый «шум» не окажет существенного влияния.

Отбор ассоциаций, как и чистых культур, осуществлялся по нитрогеназной активности и вирулентности бактерий на растениях гороха и оказался достаточно эффективным: найдены две ассоциации (№12 и №101), обеспечившие в 1,5 раза повышение урожая зерна по сравнению с инокуляцией эталонным штаммом 250а и контролем без обработки в полевых условиях (Кашаева, 1994). Причем в одном случае эффект достигался за счет усиленного клубенькообразования, в другом случае – вероятно, за счет продукции ростстимулирующих веществ, так как симбиотический аппарат был на уровне контроля. Морфологические свойства этих ассоциаций на средах совпадали с морфологическими свойствами изолятов клубеньков, образованных при инокуляции исходными культурами, что указывало на устойчивость ассоциаций. Это привело нас к мысли, что мы работаем со штаммом, а не с ассоциацией. Некоторые хорошо различимые морфолого-культуральные свойства колоний (желтоватый цвет колоний культуры №12 и полусухая консистенция культуры № 101) были взяты нами за основу для идентификации инокуляционных культур в клубеньках растений гороха от аборигенной ризобиальной микрофлоры (Кашаева, 1992).

Хранение в течение двух лет культур на твердой среде без пассирования через растения привело к утрате симбиотических свойств клубеньковых бактерий в ассоциациях и способствовало преимущественному размножению спутника. Об этом свидетельствовали результаты модельного эксперимента по оценки устойчивости гороха, обработанного препаратом Бациспецин (разработан на основе Bacillus sp. 739, активного агента против грибных фитопатогенов пшеницы) в сочетании с указанными ризобиальными ассоциациями (Гарипова, с соавт., 1999). Обработка ассоциациями № 12 и 101 при автономном и совместном внесении с препаратом Бациспецин оказала более значительное воздействие (сравнимое с действием протравителя ТМТД) на подавление развития фузариоза растений гороха, чем автономно внесенный Бациспецин. Интересно отметить, что в вариантах автономной обработки бактериальными ассоциациями № 12 и № 101 на растениях не было клубеньков, но они образовались в варианте обработки совместно с Бациспецином, который каким-то образом индуцировал их развитие.

Присутствие в ризосфере растений бактериальных ассоциаций № 12 и 101 автономно и совместно с Бациспецином привело к существенному увеличению массы растений (на 33 73%).

Эти результаты свидетельствуют о важной роли бактерий, изолированных из клубеньков, как возможных агентов биоконтроля и продуцентов стимуляторов роста растений. Компоненты, которые желательно соединить в многофункциональных микробных препаратах, присутствуют в спонтанных сообществах бактерий, которые мы намеренно удаляем для получения чистых культур ризобий. Проблема в том, как создать условия для поддержания ризобиального компонента в таких ассоциациях. Возможно, это достижимо путем периодического «пропускания» полезной ассоциации через растение.

По нашим данным дальнейшая очистка десяти перспективных ассоциаций ризобий от спутников в половине случаев не изменила симбиотические свойства штаммов, а в половине случаев ухудшила вирулентность чистого клона ризобиум. Эти наблюдения показывают важность учета роли биотических факторов в создаваемых искусственных сообществах микробных биопрепаратов.

ПОИСК АТФаз ТИПА P-1B В ГЕНОМАХ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ ПРОКАРИОТ А. Л. Герасимчук1, Г. А. Стыкон1, Н. В. Пермякова2, Е. В. Дейнеко2, О. В. Карначук Томский государственный университет, Томск, Россия Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия Устойчивость сульфатредуцирующих прокариот (СРП) к ионам тяжелых металлов, в том числе к ионам двухвалентной меди, представляет интерес с точки зрения использования этих организмов в технологиях очистки. Ранее нами получены культуры СРП, устойчивые к высоким концентрациям ионов меди в среде. Результаты ПЦР амплификации с праймерами, специфичными для генов рсоА и рсоR, предполагают, что устойчивые изоляты СРП могли иметь кодируемые на плазмиде детерминанты устойчивости, родственные pco-оперону Escherichia coli (Karnachuk et al. 2003). На сегодняшний день наиболее изученными системами гомеостаза и транспорта меди у аэробных Грамположительных и Грамотрицательных бактерий являются cue-оперон, сорА, сорВ АТФазы и рсо-оперон. Раннее эволюционное происхождение СРП в условиях Архейской Земли и отсутствие сообщений о наличии у СРП белков, содержащих медь в качестве кофактора, позволило нам высказать предположение, что система гомеостаза меди аналогичная сор-оперону аэробных бактерий может отсутствовать у микроорганизмов, использующих сульфат в качестве акцептора электронов (Карначук, 2006). В этом случае устойчивость к меди может обеспечиваться кодируемым плазмидой рсо-опреоном. В то же время показано широкое распространение сор-опреона во всех доменах жизни, включая архей, бактерий и эукариот, а также возможность его распространения через латеральный перенос генов (Coombs, Barkay, 2005). Сор-оперон имеет хромосомную локализацию, механизм его действия наиболее хорошо изучен у E.

coli и Enterococcus hirae (Rensing, Grass, 2003;

Solioz, Stoyanov, 2003). Основные белки сор-оперона, СорА и СорВ, являются медь-транспортирующими АТФазами типа Р-1В.

Целью настоящего исследования явился поиск гипотетических АТФаз типа P-1B в полных аннотированных геномах СРП доступных через базы данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi). Для поиска использовали последовательности консервативных мотивов, характерных для АТФаз типа P-1B (гены сорА E. coli (NC_000913.2) и E. hirae (AAA61835): консервативного домена СХХС, гистидин-богатого района на N-конце, консенсусной последовательности TGE в домене активаторе, консервативного внутримембранного СРХ мотива (CPCALGLA), последовательности DKTGT в домене фосфорилирования, а также консервативного НР мотива и нуклеотидсвязывающего домена GDGINDAP на С-конце молекулы белка (Solioz, Stoyanov, 2003). Анализ геномов осуществляли с помощью программы Vector NTI (Invitrogen Corporation) версия 9. Поиск консервативных аминокислотных последовательностей, транслитерированных в последовательности нуклеотидов проводили в доступных геномах сульфатредуцирующих Bacteria (Desulfotomaculum reducens MI-1, Desulfotalea psychrophila LSv54, Desulfovibrio desulfuricans G20, Desulfovibrio vulgaris Hildenborough и Desulfovibrio vulgaris DP4), а также геноме сульфатредуцирующей археи Archaeoglobus fulgidus DSM4304.

Результаты анализа геномов показали присутствие последовательностей, обладающих разным процентом гомологии (от 80 до 100%) с консервативными мотивами АТФаз типа Р-В1. Гомологичные мотивы были обнаружены в составе генов АТФаз Р типа, транспортирующих тяжелые металлы или катионы. Обнаружилось, что геномы D.

vulgaris DP4 и Hildenborough содержат гены медь-транспортирующей АТФазы Dvul_и 0934 DVU_2324, отличающиеся одной аминокислотой. Наибольшая обнаруженная гомология фрагментов генов этих АТФаз составляет 61% с геном АТФазы тяжелых металлов Dde_1313 D. desulfuricans. По крайней мере, еще две АТФазы тяжелых металлов (DP1471 и Dred_1527), принадлежащие D. psychrophila и D. reducens, предположительно транспортируют ионы меди. Эти АТФазы имеют описанную выше последовательность консервативных участков, характерную именно для АТФаз меди. Однако, следует отметить, что СРХ мотив АТФазы типа Р-В1 Dred_1527 D. reducens имеет полную последовательность CPCALVIS характерную для АТФаз типа Р-В1, транспортирующих кадмий, цинк, свинец или ртуть, обнаруженных у E. coli, Synechocystis и S. aureus. АТФаза DP1471 D. psychrophila содержит мотив CPCAMGLA. Такая же последовательность мотива известна для АТФазы SilP у Salmonella, транспортирующей ионы серебра (Solioz, Stoyanov, 2003). Однако известно, что СорА и СорВ осуществляют сопряженный транспорт ионов меди и серебра (мотивы CPCALGLA и CPHALGLA). Медь транспортирующая АТФаза Dvul_0934 D. vulgaris также содержит мотив CPCAMGLA.

Кроме того, поиск в базе данных NCBI показал, что данный мотив содержат медь транспортирующие АТФазы многих бактерий, например Roseobacter sp. SK209-2-6, Sagittula stellata E-37 и др. Можно предположить, что данные АТФазы Desulfotomaculum и Desulfotalea принимают участие в транспорте нескольких тяжелых металлов.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 



Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.