авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ БИБЛИОТЕКА РОССИИ

КОНФЕРЕНЦИИ, КНИГИ, ПОСОБИЯ, НАУЧНЫЕ ИЗДАНИЯ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ


Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
-- [ Страница 1 ] --

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ИМ. С.Н. ВИНОГРАДСКОГО РАН

НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО МИКРОБИОЛОГИИ РАН

РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

АНО «НАЦИОНАЛЬНЫЙ КОМИТЕТ

ПО НАУКЕ И ПРОМЫШЛЕННОСТИ»

МОО «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО»

III МЕЖДУНАРОДНАЯ МОЛОДЕЖНАЯ ШКОЛА-КОНФЕРЕНЦИЯ

«АКТУАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ СОВРЕМЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ»

ТЕЗИСЫ

22 – 23 НОЯБРЯ 2007 г.

Москва - 2007 Организационный комитет конференции Председатель Гальченко В.Ф., член-корр. РАН, директор Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Заместитель председателя Пименов Н.В., д.б.н., зам. директора Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Члены оргкомитета Иванов М.В., академик РАН, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Заварзин Г.А., академик РАН, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Бухарин О.В., д.м.н., профессор, чл.-корр. РАН, академик РАМН, Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН Ившина И.Б., д.б.н., профессор, чл.-корр. РАН, Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН Пиневич А.В., д.б.н., профессор, Санкт-Петербургский Государственный Университет Дрюккер В.В., д.б.н., профессор, Лимнологический институт СО РАН Головлева Л.А., д.б.н., профессор, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН Мелентьев А.И., д.б.н., профессор, Институт биологии УНЦ РАН Намсараев Б.Б., д.б.н., профессор, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН Турковская О.В., д.б.н., профессор, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Грабович М.Ю., д.б.н., Воронежский Государственный Университет Евдокимова Г.А., д.б.н., профессор, Институт проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра РАН Карначук О.В., д.б.н., Томский государственный университет Коробова Л.Н., к.б.н., Новосибирский Государственный Аграрный Университет Гальченко Н.В. – Ученый секретарь Оргкомитета Адрес оргкомитета: 117312, Москва, Проспект 60-летия Октября, д.7, корп.2. Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Тел.: (499) 135-01-80, Факс: (499) 135-65- E-mail: natgal@inmi.host.ru ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЕ БАКТЕРИИ РОДА RHODOCOCCUS, РАЗЛАГАЮЩИЕ МОНО– И ПОЛИАРОМАТИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ Л. Н. Ананьина, Е. Г. Плотникова Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Предприятия химического комплекса оказывают негативное влияние на природные экосистемы, являясь источниками поступающих в окружающую среду вредных веществ, в том числе трудно разлагаемых ароматических углеводородов. В ряде случаев экосистемы, загрязненные такими соединениями, могут характеризоваться естественной высокой соленостью или сформированной в результате разработки нефтяных месторождений (за счет разливов высокоминерализованных пластовых вод) и работы соледобывающих предприятий, что значительно ограничивает процессы самовосстановления. В настоящее время активно ведется поиск бактерий, сохраняющих деструктивные свойства в присутствии высоких концентраций солей. Известно, что в экотопах заводняемых нефтяных месторождений с высокой минерализацией пластовых вод основными представителями и деструкторами углеводородов нефти являются бактерии рода Rhodococcus, характеризующиеся высокой биологической пластичностью [1].





Цель настоящего исследования – выделение и изучение бактерий рода Rhodococcus, разлагающих моно- и полиароматические углеводороды в присутствии высоких концентраций соли.

Из почв, отобранных на территории соледобывающего предприятия БКРУ- (г.Березники, Пермский край), методом накопительных культур с нафталином были выделены шесть галотолерантных бактериальных штаммов-деструкторов данного соединения [2]. Установлено, что исследуемые штаммы разлагают моно- и полиароматические углеводороды (нафталин, бифенил, бензол, толуол, бензоат, протокатехат, салицилат и гентизат). При изучении влияния солености среды на рост изолятов на нафталине установлено, что четыре штамма B1-4, B2-1, B13 и B14 способны к росту на нафталине в присутствии 6% NaCl, для штамма SMB37 верхним пределом роста на нафталине служит концентрация хлорида натрия 7.5%, а для штамма SMB38 – 9% NaCl.

Проведена идентификация исследуемых бактерий. На полноценной агаризованной среде бактерии формируют округлые, бледно-розовые, выпуклые колонии. В молодых культурах преобладают удлиненные палочки неправильной формы или гифы, распадающиеся с возрастом на короткие палочковидные фрагменты и кокки. В гидролизатах целых клеток штаммов присутствует мезо-диаминопимелиновая кислота. У штаммов выявлены миколовые кислоты, идентичные таковым представителей рода Rhodococcus. На основе вышеперечисленных морфологических и хемотаксономических признаков изоляты отнесены к роду Rhodococcus.

Штаммы SMB37 и SMB38 были изучены более подробно. Методами ДНК типирования с применением BOX-ПЦР и ARDRA показано, что изоляты различаются между собой по ДНК-фингерпринтам. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 16S рДНК штаммов SMB37 и SMB38, составляющих 1272 п.н. и 1400 п.н., соответственно, по банку данных GenBank подтвердил их принадлежность к роду Rhodococcus. Данные филогенетического анализа 16S рДНК штамма SMB показывают, что он имеет высокий уровень сходства (99.6%) с видом Rhodococcus jostii в подкластере Rhodococcus erythropolis. Изолят SMB37 на филогенетическом древе попадает в подкластер Rhodococcus rhodochrous, что подтверждается высокими значениями “bootstrap”-анализа (90%) и уровнем сходства 16S рДНК штамма с видами этой группы (97.8 – 98.4%). В литературе имеется достаточно много данных, свидетельствующих о том, что виды рода Rhodococcus при подобных значениях сходства 16S рДНК и даже намного выше – от 99.0% до 99.5% – имеют уровень ДНК–ДНК гомологии намного ниже 70%, – значения, рекомендованного для выделения бактериального вида [3]. С учетом вышесказанного и наличия существенных отличий по фенотипическим признакам от близкородственных видов (устойчивость к соли, способность использовать нафталин и ряд ароматических углеводородов в качестве единственного источника углерода и энергии, гидролиз крахмала, отсутствие нитратредуктазы и др.), штамм SMB37 представляет новый вид рода Rhodococcus.

Выделенные галотолерантные штаммы рода Rhodococcus, способные разлагать широкий спектр ароматических углеводородов, перспективны для использования при биоремедиации высокоминерализованных экосистем.

Работа поддержана грантами РФФИ-Урал №07-04-96078, №07-04-97625-офи.

1. Милехина Е.И. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий нефтяных месторождений Татарстана / Е.И. Милехина, И.А. Борзенков, И.С.

Звягинцева и др. // Микробиология. – 1998. – Т.67. – С. 208-214.

2. Плотникова Е.Г. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья / Е.Г. Плотникова, Д.О. Рыбкина, Л.Н. Ананьина и др. // Экология. – 2006. – № 4. – С. 1-9.

3. Jones, A.L. Rhodococcus gordoniae sp. nov., an actinomycete isolated from clinical material and phenol-contaminated soil / A.L. Jones, J.M. Brown, V. Mishra et al. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2004. – V.54. – P. 407–411.

РОЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ФОРМИРОВАНИИ АДАПТИВНОЙ РЕАКЦИИ ESCHERICHIA COLI НА ВОЗДЕЙСТВИЕ СУБЛЕТАЛЬНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ АНТИБИОТИКОВ А. В. Ахова Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Известно, что некоторые антибиотики способны вызывать в клетках микроорганизмов окислительный стресс. Ранее нами показано, что внесение в культуру Escherichia coli сублетальных концентраций антибиотиков приводит к накоплению в клетках полиаминов, что является типичной реакцией на окислительный стресс. Одним из наиболее характерных признаков развития окислительного стресса является индукция генов антиоксидантной защиты, которые объединены в soxRS регулон посредством транскрипционного регулятора SoxS. Изучение изменения экспрессии генов данного регулона в ответ на добавку сублетальных концентраций антибиотиков (СЛКА), а также адаптивных механизмов, в которых участвуют генные продукты, явилось целью настоящей работы.

Были исследованы три класса антибиотиков:

-лактамы (цефотаксим, цефазолин, ампициллин), фторхинолоны (левофлоксацин, пефлоксацин) и аминогликозиды (нетилмицин). Сублетальные концентрации антибиотиков подбирались таким образом, чтобы их добавка в среду культивирования приводила приблизительно к 50%-ному подавлению накопления биомассы по значениям OD600.

Результаты исследований показали, что транспортируемые через пориновые каналы -лактамы и фторхинолоны, вызывают существенное возрастание экспрессии soxS (120 150%), наиболее выраженное для цефотаксима (220%). В отличие от этого, нетилмицин, транспортируемый преимущественно через липидный бислой внешней мембраны, не оказывал воздействия на транскрипцию данного гена. Экспрессия гена micF, который также является членом soxRS регулона, в ответ на добавку СЛКА изменялась сходным образом. Это свидетельствует о том, что воздействие аминогликозида на E. coli не сопровождается развитием окислительного стресса.

Недавно в литературе появились данные о том, что в состав soxRS-регулона антиоксидантной защиты входит один из генов (cadA), кодирующих лизиндекрбоксилазу, фермент синтеза полиамина кадаверина.

Нами показано, что активность лизиндекарбоксилазы CadA при внесении антибиотиков разных классов полностью согласуется с уровнями индукции soxS.

Фторхинолоны и -лактамы вызывали повышение активности данного фермента от 90% до 140% для разных антибиотиков, в то время как при внесении нетилмицина существенного ее изменения не наблюдалось.

Повышение активности лизиндекарбоксилазы приводило к накоплению ее продукта – кадаверина, который, как известно, способен снижать проницаемость пориновых каналов E. coli.

При воздействии фторхинолонов, вызывающих значительное повышение внутриклеточной концентрации кадаверина, наблюдалось двукратное подавление пориновой проницаемости.

Регуляция поринового транспорта может осуществляться как за счет изменения состояния проницаемости поринов, так и за счет изменения количества пориновых белков и их соотношения во внешней мембране. Порины E. coli представлены белками OmpC и OmpF. Содержание OmpF, обладающего избирательной транспортной активностью в отношении антибиотиков, отрицательно регулируется за счет образования двуспиральной структуры между мРНК ompF и антисмысловой РНК micF. Нами показано, что в условиях воздействия -лактамных и фторхинолоновых антибиотиков, в отличие от аминогликозидов, происходит индукция гена micF, продукт которого способен снижать пориновую проницаемость путем ограничения количества поринового белка OmpF.

Следовательно, накопление кадаверина с одной стороны и индукцию гена micF с другой можно рассматривать как защитные реакции E. coli, направленные на ограничение проникновения антибиотиков в клетку путем ингибирования пориновой проницаемости.

Таким образом, в ответ на добавку анибиотиков, проникающих в бактериальную клетку посредством поринового транспорта, развивается окислительный стресс, который приводит к запуску SoxS – зависимого адаптивного ответа. Одним из проявлений этого ответа является снижение пориновой проницаемости E. coli за счет индукции лизиндекарбоксилазы CadA, накопления кадаверина и уменьшения содержания OmpF во внешней мембране.

Работа выполнена по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № № 04-04-97501-р_офи;

05-04-48091;

07-04-96003), а также департаментом Пермского края по науке и образованию.

БИОКОНВЕРСИЯ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ ШТАММАМИ SPHINGOMONAS SP. MAR- И MYCOBACTERIUM SP. MAR- М. А. Бабошин, В. Н. Акимов, Б. П. Баскунов, Л. А. Головлева Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, Россия Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) – обширный класс органических соединений, молекулы которых состоят из конденсированных ароматических колец. ПАУ образуются при пиролизе органики в различных процессах, как природных (лесные пожары, вулканическая активность), так и технологических (сжигание топлива, коксование угля). Основным фактором деградации ПАУ является деятельность аэробных бактерий. ПАУ-деградирующие бактерии интенсивно изучают в связи с разработкой технологий детоксикации промышленных отходов и биоремедиации загрязненных почв, донных осадков и грунтовых вод. Особое внимание уделяется исследованию биодеградации так называемых высокомолекулярных ПАУ, молекулы которых содержат больше трех ароматических колец. Высокомолекулярные ПАУ особенно устойчивы к биодеградации и наиболее опасны для здоровья (канцерогены).

Помимо использования в технологиях биоремедиации конверсия ПАУ бактериями может применяться для получения химических соединений, которые трудно синтезировать.

Данная работа посвящена изучению бактериального превращения ПАУ на примере двух филогенетически далеких штаммов, представителей родов Sphingomonas и Mycobacterium;

эти два рода включают большинство известных к настоящему времени бактерий, окисляющих высокомолекулярные ПАУ.

С целью выделения штаммов-деструкторов ПАУ было создано 9 накопительных культур, поддерживаемых в минеральной среде, содержащей экстракт каменноугольного пека;

для засева использованы образцы почв и донных отложений, длительно загрязняемых ПАУ. Из полученных накопительных культур была отобрана накопительная культура, наиболее эффективная в отношении конверсии ПАУ. Из данной накопительной культуры, поддерживаемой далее в минеральной среде с флуорантеном, был выделен штамм-деструктор флуорантена (обозначенный «Mar-33»);

из этой же накопительной культуры, поддерживаемой далее в минеральной среде с пиреном, был выделен штамм деструктор пирена (обозначенный «Mar-59»).

Штамм Mar-33 на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК отнесен к роду Sphingomonas;

объединяется в единый кластер с типовыми штаммами видов S. cloaceae, S. chlorophenolicum, S. herbicidovorans и S. yanoikuyae, имея наибольший уровень сходства нуклеотидных последовательностей с S. cloaceae – 97.0%.

Культура использует в качестве единственного источника углерода и энергии нафталин, аценафтилен, аценафтен, фенантрен, антрацен и флуорантен;

в соокислительных условиях осуществляет конверсию флуорена, пирена, бензо[a]антрацена, хризена и бензо[a]пирена.

Аценафтен и флуорантен подвергаются глубокой деградации с образованием нафталевой и о-гидроксифталевой кислот в качестве интермедиатов. Превращение большинства других ПАУ ограничивается расщеплением лишь одного ароматического кольца: в качестве главного продукта окисления нафталина, антрацена, фенантрена, хризена и бензо[a]пирена идентифицированы салициловая, 3-гидрокси-2-нафтойная, 1-гидрокси-2 нафтойная, гидроксифенантренкарбоновая и гидроксипиренкарбоновая кислоты, соответственно. Фенантрен и антрацен окисляются в соответствующие гидроксинафтойные кислоты количественно;

предложен метод получения данных продуктов путем биоконверсии ПАУ. Главными продуктами окисления флуорена и пирена являются соответственно гидроксифлуоренон (смесь двух изомеров) и пиренол;

предположительно данные соединения образуются при абиотической деструкции соответствующих дигидродиолов. Sphingomonas sp. Mar-33 осуществляет конверсию фенантрена, антрацена, флуорантена и карбазола в составе экстракта каменноугольного пека.

Штамм Mar-59 на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК отнесен к роду Mycobacterium (99% сходства с типовым штаммом M. gilvum).

Штамм использует фенантрен и пирен в качестве единственного источника углерода и энергии, осуществляя полную конверсию данных ПАУ в концентрации до 1 г/л.

Интермедиатами деградации пирена являются фенантрен-4,5-дикарбоновая, фенантрен-4 карбоновая и фталевая кислоты. В соокислительных условиях штамм способен к конверсии флуорена, антрацена, флуорантена и бензо[a]антрацена, причем в присутствии флуорена и флуорантена биоконверсия пирена сильно угнетается. Mycobacterium sp. Mar 59 не способен к окислению пирена в составе экстракта каменноугольного пека.

Таким образом, изученные штаммы обладают широкой субстратной специфичностью в отношении ПАУ. Определенные субстраты подвергаются полной деградации, конверсия других ПАУ сопровождается накоплением продуктов их неполного окисления. В микробных сообществах, вероятно, есть организмы, специализирующиеся на потреблении продуктов неполного окисления ПАУ Работа поддержана грантами Наукоград – РФФИ № 04-04-97266. грантом 1.2.06 по заданию Рособразования и грантом НАТО № 981949.

СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА ПРОЦЕССА АЗОТФИКСАЦИИ В ДОННЫХ ОСАДКАХ ИСТОЧНИКА ГОРЯЧИНСК (ПРИБАЙКАЛЬЕ) Т. Г. Банзаракцаева1, А. П. Шагжина1, А. Л. Степанов Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия Щелочной термальный источник Горячинск расположен в 2-х км от озера Байкал, на юго-восточном побережье. Микробиологические исследования были проведены на станциях источника: Г1 – излив, Г3 – теплый ручей, Г4 – проточный пруд, Г5 – холодный ручей, Г6 – место впадения в озеро Байкал. Максимальная температура воды источника на изливе (51,5°С) зафиксирована зимой, в летнее время температура снижается до 47°С. Вниз по ручью наблюдается постепенное уменьшение температуры воды и подверженность сезонным изменениям. Максимальное значение рН, равное 9,0, было отмечено также на изливе и в течение года ее величина не меняется. Далее в ручье рН снижается до 7,2–6,7.

Максимальное количество аммонийного азота (до 1,77 мг/100 г) в илах источника Горячинск было определено летом на первых 2-х станциях, минимальное – весной (0, мг/100 г). В то же время весной зафиксировано увеличение почти вдвое нитратного азота (0, 125 мг/100 г) по сравнению с осенними показателями. Наименьшее количество нитритного азота было определено летом – 0,03 мг/100 г.

Наибольшее количество азотфиксирующих бактерий 4,3107 кл/мл было обнаружено весной, наименьшие (1,3102 кл/мл) – летом и осенью, что возможно определялось количеством аммонийного азота в илах.

Результаты межсезонных исследований азотфиксирующей активности илов на всех исследуемых станциях источника Горячинск показали увеличение нитрогеназной активности весной до 0,584 нг N2/гч, что коррелировало с сезонной динамикой численности азотфиксирующих бактерий. В осенний период скорость азотфиксации была практически в 2 раза ниже и не превышала 0,273 нг N2/гч.

На станциях, где были определены максимальные величины азотфиксирующей активности, величина соотношения С/N варьировала в пределах 10–12, что является благоприятным условием для процесса азотфиксации.

Потенциальная активность процесса азотфиксации в образцах ила после обогащения глюкозой увеличилась в 2–3 раза, так в весенних пробах активность выросла до 0,893 нг N2/гч.

Таким образом, в щелочной гидротерме Горячинск нитрогеназная активность может проявляться в широком диапазоне температур от 6,5 до 51°С и значениях рН от 6,7 до 9,0.

Работа выполнена при финансовой поддержке интеграционного проекта СО РАН №24, Программы Президиума РАН: «Происхождение и эволюция биосферы …», проекта МО РФ «НОЦ – Байкал», гранта РФФИ Байкал № 05-04- ПРИМЕНЕНИЕ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ЭКОЛОГИИ БАКТЕРИОФАГОВ Е. С. Баринова1, Е. Е. Куликов1, А. А. Маныкин2, А. В. Летаров Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Институт вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, Москва, Россия Электронная микроскопия (ЭМ) бактериофагов в естественных местообитаниях была впервые применена 40 лет назад. В настоящее время отдельные исследователи считают этот метод устаревшим, заменяя ЭМ эпифлюоресцентной микроскопией для общего подсчета фагов, и молекулярными методами (PFGE, DGGE, метагеномика) для получения информации о структуре и организации некультивируемых микробных сообществ.

Однако, возможности ЭМ в данной области являются, на наш взгляд, недооцененными. В естественных сообществах мы можем часто наблюдать много морфотипов фагов, обладающих нетипичной морфологией вириона. Во многих случаях, исследование высококачественных ЭМ-изображений с точными замерами всех структурных элементов вирусной частицы позволяет утверждать о наличии генетической связи между структурно близкими фагами.

Вирусы, которые трудно отличить друг от друга (например, сифовирусы с изометрическими головками около 60 нм в диаметре, и длинными хвостами по 150– нм) могут составлять только небольшую фракцию тотального сообщества. В этом случае, оценки морфологического сообщества, основанные на данных ЭМ, будут близки к оценкам примерного количества одновременно присутствующих генотипов. В то же время, примерное распределение вирусов по размеру геномов также может быть вычислено на основании ЭМ-данных. Кроме этого, становится возможной и оценка вклада минорных морфотипов фагов в популяции – информация, обычно утрачиваемая при метагеномных исследованиях. Выход биологически осмысленной информации в ЭМ исследованиях большого репрезентативного количества фаговых частиц может быть даже выше, чем при метагеномных исследованиях среднего (до 1000 последовательностей) уровня, при несравненно меньших затратах денег и времени.

В микробных сообществах с высокой плотностью активных бактерий (бактериальные маты, микрофлора кишечника животных) становится возможной непосредственная визуализация взаимодействий бактерий и их фагов. Техника ультратонких срезов, практически не применяемая в исследованиях экологии бактерий, позволяет анализ пространственной организации бактерий и ее влияния на их взаимодействия с фагами. Многие бактериальные таксоны могут быть надежно идентифицированы по ультраструктурному критерию. Эта информация, в сочетании с данными по разнообразию бактерий в исследуемой пробе, может быть использована для дифференциального подсчета частот фаговой инфекции избранных групп бактерий (например, цианобактерий).

Физиологическое состояние микробных клеток (например, активно растущих, стационарных, или различных покоящихся форм – цист, цистоподобных клеток, спор и пр.) имеет определяющее значение для их взаимодействия с фагами окружающей среды.

Оценка этих состояний микробов в некультивируемом сообществе также становится возможной на основании ультраструктурного критерия. Для этого необходимо составить базу данных по структурным признакам определенных фаз развития лабораторных культур различных бактерий, дополненную данными рентгеновского микроанализа для лучшей дифференциации физиологических состояний клеток. Мы представляем результаты нашего пилотного исследования морфологического разнообразия некультивируемого вирусного сообщества, технические достижения в области визуализации пространственной структуры микробных систем в природных образцах, и результаты нашей работы по дифференциации физиологических состояний бактерий in situ.

МИКРОБНЫЕ КОМПЛЕКСЫ И ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА В ПОЧВАХ СОСНОВЫХ ЛЕСОВ СРЕДНЕЙ СИБИРИ ПОСЛЕ ПОЖАРОВ РАЗНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ А. В. Богородская Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, Россия Пожары вносят существенный вклад в интенсивность биологического круговорота, цикличность процессов накопления и трансформации органического вещества в лесных экосистемах. Почва, как неотъемлемая составная часть экосистемы, также подвергается сложному и разностороннему пирогенному воздействию, приводящему к изменению ее гидротермических и трофических условий, а, следовательно, и биологических свойств. В свою очередь, функционирование почвенной системы и ее гомеостаз обусловливается в значительной степени деятельностью микроорганизмов. Микробные комплексы являются чувствительными индикаторами нарушения почв, что дает возможность использовать микробиологические характеристики в качестве критериев для оценки состояния почв.

Исследования функциональной активности почвенных микробоценозов после воздействия пожаров проводились в 2000–2006 гг. в среднетаежных (60°38' с.ш. и 89°44' в.д.) и южнотаежных (58°35' с.ш. и 98°55' в.д.) кустарничково–лишайниково– зеленомошных сосняках Средней Сибири. В рамках комплексного российско американского проекта с целью моделирования поведения лесных пожаров разной интенсивности и их влияния на экосистему в 2000–2003 гг. были проведены эксперименты на 12 участках 200200 м, представляющие контролируемые выжигания, при которых горение распространялось фронтальной кромкой по ветру.

Почвы изучаемых сосняков, представленные песчаными подзолами, характеризуются низким содержанием гумуса (до 0.5%) и доступных форм элементов питания, высокой кислотностью (рН подстилки 3.6–4.4;

почвы 4.8–5.2), широким соотношением С:N (от 21 до 34) и высоким содержанием в опаде трудноразлагаемых органических соединений, что отражается в их невысокой биогенности. Среди основных эколого-трофических групп микроорганизмов отмечено низкое содержание целлюлозоразрушающих и утилизирующих органический азот бактерий. Микробные комплексы характеризуются преобладанием олиготрофных форм, слабым развитием актиномицетов и довольно высокой активностью минерализационных процессов.

Выявлено, что пожары высокой и средней интенсивности в первый год оказывают негативное влияние на структуру и функциональную активность микробных комплексов песчаных подзолов: снижается численность и биомасса микроорганизмов азотно углеродного цикла, обедняется качественный состав, уменьшается интенсивность микробного дыхания, повышается ологотрофность почв в отношении азота.

Показано, что интенсивность действия пирогенного фактора на микробоценозы почв определяется погодными условиями года проведения выжиганий. Действие огня любой интенсивности на микробоценозы почв нивелируется высокой влажностью подстилок. Оптимальное сочетание тепла и влаги в совокупности с улучшением трофических условий почв приводят к повышению микробиологической активности после пожаров средней и низкой интенсивности.

В последующие годы после пожаров высокой и средней интенсивности отмечается процесс постепенной стабилизации структуры микробных комплексов почв, активизируются микробиологические процессы минерализации опада, снижается олиготрофность, увеличивается видовое разнообразие микроорганизмов, восстанавливается активность функционирования гетеротрофного комплекса. При этом, скорость послепожарного восстановления структуры и функциональной активности микробных комплексов почв определяется как первоначальной силой воздействия пирогенного фактора, так и особенностями динамики гидротермических и трофических условий почв изучаемых сосняков.

Пожары низкой интенсивности в первый год могут приводить к незначительному снижению численности и биомассы микроорганизмов в подстилке, в то время как в нижележащих горизонтах почвы стимулируют процессы мобилизации азота. Уже через год после низкоинтенсивных пожаров отмечается положительная динамика биогенности и микробиологической активности почв. Усиление минерализации привнесенного органического вещества, в свою очередь, обеспечивает необходимый уровень питания растений и улучшает трофические функции корней. Поэтому вместе с ростом биологической активности и улучшением трофического режима почв при пожарах низкой интенсивности отмечается в целом положительное влияние на лесорастительные условия, что выражается в более активном лесовозобновлении.

Содержание микробной биомассы, интенсивность базального дыхания и изменение микробного метаболического коэффициента адекватно отражают послепожарное состояние микробных комплексов песчаных подзолов. Наибольшие изменения функциональной активности и устойчивости микробных комплексов почв отмечены после пожаров высокой и средней интенсивности, тогда как после низкоинтенсивных пожаров экофизиологическое состояние микробоценозов восстанавливается в течение двух-трех лет.

НОВЫЕ АЭРОБНЫЕ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛ А–СОДЕРЖАЩИЕ БАКТЕРИИ БУРЯТИИ Е. Н. Болдарева, В. М. Горленко Институт микробиологии им С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Первые аэробные бактериохлорофилл а–содержащие (АБС) бактерии были выделены около 30 лет назад из морской воды. С тех пор представители АБС бактерий были обнаружены практически во всех средах, включая реки, гиперсоленые источники, микробные маты богатые азотом, олиготрофные океанические воды, а так же вблизи глубоководных морских гидротермальных выходов. Наши исследования были сосредоточены на изучении щелочных мест обитания, а именно, содовых озер и щелочных гидротерм.

Из пробы воды степного содового озера Шутхулайн-Ехэ-Тором (Восточная Сибирь) был выделен штамм SHET. Общая минерализация воды озера составляет 3.0 г/л, рН 9.24.

На прибрежных камнях имеются отложения соды. Клеточная стенка грамотрицательного типа, бактерии имеют кокковидную форму, деление перетяжкой. Микроорганизм является облигатным аэробом, оптимальный рост при 2 г/л NaCl, рН 8.0–9.5 и температуре 23– 28°С. Пигменты фотосинтеза представлены каротиноидами и бактериолорофиллом а.

Отличительной особенностью штамма SHET, также является не способность бактерией использовать тиосульфат в качестве источника энергии. Бактерии образуют нитрит из нитрата. В качестве источников углерода используют глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, глицерин, рибозу, арабинозу, ацетат, пируват, бутират, малат, цитрат, сукцинат, лактат, формиат, фумарат, пропионат, тартрат, манит, гидролизате козеина, дрожжевой экстракт. Рост отсутствовал на гликоляте, этаноле и метаноле. Основной жирной кислотой штамма SHET является 18:1w7 (66.73%). Клетки содержат 16:0 (7,92 %), 2h18:1 (6,73 %), 16:1w7 (4,29 %), 11Me18:1 (3,23 %), a15 (2,60 %), 18:0 (2,57 %). ГЦ в ДНК составляет 69. мол.%. По данным 16s рРНК изолят принадлежит к -1 подгруппе протеобактерий, близок, но не идентичен Roseococcus thiosulfatophylus. Клетки устойчивы к амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, новобиоцину, стрептомицину. Чувствительны к ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, линкомицину, налидиксовой кислоте, полимиксину, тетрациклину, эритромицину. Новый штамм АБС определен как новый вид Roseococcus suduntuyensis sp.nov..

Оранжево окрашенный штамм АБС был выделен из тонкого мата пурпурных бактерий, развивающегося на поверхности прибрежного нагона степного слабоминерализованного (общая минерализация 1,5 г/л) озера Ножий (штамм Noj-1).

Клеточная стенка бактерии грамотрицательного типа, внутриклеточных мембранных структур не выявлено. Клетки способны к ветвлению, подвижны. Бактерии штамма Noj- имют оптимальный рост при температуре 23°С, рН 7.4, концентрация NaCl 0–0.2%.

Клетки штамма Noj-1 устойчивы амикацину, ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, линкомицину, налидиксовой кислоте, неомицину, новобиоцину, полимиксину, стрептомицину, тетрациклину, эритромицину. Не использует тиосульфат. В качестве единственного источника углерода бактерии используют глюкозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, глутамат, пропионат, гидролизат козеина, дрожжевой экстракт. Содерание ГЦ составляет 64.5 мол.%. Штамм предварительно идентифицирован как известный вид Porphyrobacter donghaensis, несмотря на некоторые фенотипические несоответствия с типовым штаммом, выделенным из прибрежной зоны Южно Карейского моря.

Второй штамм АБС, Se-4, близкий к морскому Porphyrobacter donghaensis выделен с поверхности цианобактериального мата термального источника Сея. По данным ДНК ДНК гибридизации он имеет 95 % уровень сходства с геномом типового штамма этого вида. На поверхности твердой питательной среды бактерии образует округлые колонии с четкими краями оранжевого цвета, которые краснеют по мере роста колонии. Клетки изолята представлены подвижными палочками, способными к ветвлению. Размножение – равномерным делением. Оптимальный рост происходит при концентрации NaCl от 0 до г/л, рН 7.5 и температуре 35–41°С. Пигменты представлены каротиноидами сфероиденовой серии и бактериохлорофилом а. Клетки не используют тиосульфат в качестве источника энергии. Чувствительны к ампициллину, линкомицину, налидиксовой кислоте, неомицину, новобиоцину, полимиксину, рифампицину, стрептомицину. В качестве источников углерода бактерии использовали глюкозу, мальтозу, пируват, глутамат, гидролизат козеина и дрожжевой экстракт. Не потребляли, фруктозу, сахарозу, рибозу, арабинозу, ацетат, бутират, цитрат, сукцинат, лактат, формиат, фумарат, пропионат, бензоат, тартрат, этанол, метанол, глицерин, манит, гликолят. Слабый рост наблюдался на малате. Основные жирные кислоты клеток штамма Se-4 представлены 18:1w7 (61,94%), i18 (15,18), 16:0 (7,44%), 2h14 (6,09%). Содержание ГЦ в ДНК – 65. мол.%.

Таким образом, нами показано, что эробные АФБ широко распространены как в содовых озерах, так и в щелочных гидротермах Бурятии. Описанный нами Roseococcus suduntuyensis является первым алкалофилом, выделенный из слабоминерализованного озера. Выделенные новые штамм Noj-1, штамм Se-4 Porphyrobacter donghaensis расширяют знания об экологии вида, ранее выделенного только из морской воды.

ФАЗОВЫЕ ВАРИАЦИИ В ПОДВИЖНОСТИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE И СОПРОВОЖДАЮЩИЕ ИХ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПЕРЕСТРОЙКИ И. В. Борисов, Л. П. Петрова, Е. И. Кацы Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия A. brasilense Sp245 обладает крупным геномом (более 7000 т.п.н.), сформированным в несколько репликонов. Нас интересует роль перестроек генома (фазовых вариаций - ФВ) азоспирилл во взаимодействии этих бактерий с растениями.

В нашей лаборатории собрана коллекция ФВ азоспирилл по подвижности и поверхностным структурам. В данной работе продемонстрировано влияние корневых экссудатов двухнедельных проростков пшеницы на частоту возникновения вариантов по подвижности. Показаны перестройки в плазмидном профиле штамма A. brasilense Sp при ФВ. Используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и праймеры, соответствующие консервативным мотивам в повторяющихся последовательностях нуклеотидов (REP-ПЦР, BOX-ПЦР, ERIC-ПЦР), продемонстрированы перестройки в геноме A. brasilense Sp245, сопровождающие фазовые изменения характеристик подвижности. Таким образом, впервые показано влияние корневых экссудатов на частоту внутригеномных перестроек A.

brasilense Sp245. Это позволит в дальнейшем создать систему контроля частоты фазовых вариаций и распределения фазовых вариантов внутри корневой системы растений в экспериментах in vivo.

Работа была частично поддержана грантами Президента РФ (НШ-6177.2006.4) и РФФИ (06-04-48204-а).

ПРОДУКЦИЯ ПОЛИГИДРОКСИАЛКАНОАТОВ СВЕТЯЩИМИСЯ БАКТЕРИЯМИ А. Н. Бояндин, Г. С. Калачева, Э. К. Родичева, Т. Г. Волова Институт биофизики СО РАН, Красноярск, Россия Способность к накоплению резервных биополимеров – полигидроксиалканоатов известна для многих микроорганизмов. ПГА разных штаммов бактерий отличаются по мономерному составу и свойствам, что определяет различные возможности их использования. Поэтому необходимо изучение новых групп микроорганизмов на способность к продукции ПГА. Светящиеся бактерии являются уникальной группой прокариот, способных излучать свет. В этой работе они были впервые подвергнуты анализу в качестве потенциального нового продуцента ПГА. Исследованы штаммы, относящиеся к видам Photobacterium leiognathi, Ph. phosphoreum, Vibrio harveyi и V. fischeri из коллекции светящихся бактерий CCIBSO 836 Института биофизики СО РАН.

Микроорганизмы выращивались на агаризованной среде Егоровой (24 часа, 25°C).

Для периодического культивирования (36 часов, 28°C) использовалась минеральная среда, содержащая (г/л) NaCl (30), MgSO4 (0.2), KH2PO4 (1), Na2HPO4 (6), пептон (5) и глицерин (3). Измерялась оптическая плотность, которая пересчитывалась в урожай биомассы (г/л).

Содержание и состав ПГА анализировались метанолизом ПГА с последующей хроматографией метиловых эфиров гидроксикислот.

Культивирование микроорганизмов на плотных средах показало, что исследованные 20 штаммов четырех видов способны к продукции ПГА, при этом представители рода Photobacterium дают наибольшие выходы – до 18.1%, в то время как для Vibrio этот показатель не превышает 4.8% (табл. 1). Максимальное содержание полимера в клетках было у Ph. leiognathi 208. Анализ масс-спектров показал, что полимер, синтезированный большинством штаммов на плотной среде, был гомогенным и состоял из мономера гидроксимасляной кислоты. Наличие в ПГА включения -гидроксивалериановой кислоты отмечено только для двух штаммов (Ph. leiognathi 683, V. harveyi 72).

Наиболее эффективные продуценты были проверены на способность к синтезу ПГА в периодической культуре. Для штаммов Ph. leiognathi №№ 543 и 683 отмечена высокая внутриклеточная концентрация ПГА – 47.1% и 71.0%, соответственно. Некоторые штаммы Ph. leiognathi и V. harveyi 72 синтезировали многокомпонентные полимеры, содержащие, наряду с доминирующим -гидроксибутиратом, минорные включения мономеров -гидроксивалерата и -гидроксигексаноата, что имеет существенное значение для биотехнологии ПГА.

Таблица 1. Синтез ПГА наиболее продуктивными штаммами светящихся бактерий (ГБ – гидроксибутират, ГВ – гидроксивалерат, ГГ – гидроксигексаноат) Штамм Содержание (%) и состав ПГА в Содержание (%) и состав ПГА в биомассе при культивировании на биомассе при периодическом плотных средах культивировании % Состав % Состав Ph. leiognathi 208 18.1 ГБ – 100 22.2 ГБ – 100;

ГВ, ГГ – следы 307 5.0 ГБ – 100 0.2 ГБ – 543 2.8 ГБ – 100 47.1 ГБ – 99.8;

ГВ – 0. 683 10.4 ГБ – 99.13;

ГВ – 0.87 71.0 ГБ – 99.3;

ГВ – 0.5;

ГГ – 0. Ph. phosphoreum 1856 4.0 ГБ – 100 5.1 ГБ – 1883 7.4 ГБ – 100 1.3 ГБ – Vibrio fischeri 1231 0.5 н/д 0.4 ГБ – Vibrio harveyi 72 4.8 ГБ – 99.25;

ГВ – 0.75 12.3 ГБ-99.2;

ГВ – 0.4;

ГГ – 0. Для штамма Ph. leiognathi 208, как наиболее продуктивного, была исследована динамика содержания полимера при периодическом культивировании на минеральной среде с глицерином (3 г/л) и пептоном. Концентрация ПГА к стационарной фазе достигла 42.5% при урожае 230 мг/л (рис.1а) или 22.2% при урожае 920 мг/л (рис.1б), при содержании пептона в среде соответственно 1 г/л и 5 г/л.

Таким образом, в результате работы впервые выделены наиболее продуктивные штаммы и определены условия, обеспечивающие достаточно высокие выходы полимера в периодической культуре. Обнаружена способность представителей Ph. leiognathi и V. harveyi синтезировать двух- и трехкомпонентные полимеры, что позволяет рассматривать данные штаммы в качестве потенциальных продуцентов как полигидроксибутирата, так и многокомпонентных ПГА.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации и Американского фонда гражданских исследований и развития (грант № RUX0-002-KR-06), Фонда содействия отечественной науке и Интеграционного проекта СО РАН № 24.

ГЕОХИМИЧЕСКАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ БАРЬЕРНЫХ ЗОН ОЗЕРА БАЙКАЛ С. П. Бурюхаев Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ, Россия В устьях рек, втекающих в озеро Байкал и прибрежных болотных экосистемах формируются геохимические барьеры, выполняющие роль естественных фильтров. В этой экотоной зоне происходят биогеохимические процессы, связанные с деструкцией и трансформацией веществ.

Основной приток озера Байкал, поставляющий более 50% всего речного стока в озеро, является река Селенга. Дельта р. Селенги является крупнейшей барьерной зоной озера Байкал, где интенсивно протекают биогеохимические процессы с активным участием микроорганизмов различных физиологических групп. Наиболее активно микробные процессы протекают на выходе основных проток дельты в озеро Байкал и в районе Селенгинского мелководья. Скорость темновой ассимиляции углекислоты в водной толще варьирует от 0,49 до 5,53 мкг С дм-3 сут-1. В донных осадках суточная скорость этого процесса составляет 9,22–19647,22 мкг С дм-3 сут-1. Вклад хемосинтеза в темновую фиксацию местами может достигать до 89,9 %. Суточная скорость метаногенеза в донных осадках дельты Селенги и Селенгинского мелководья варьирует от 0,316 до 17,06 мкл СН4 дм-3 сут-1. Содержание метана, одного из конечных продуктов терминального этапа деструкции органического вещества, в донных осадках дельты Селенги составляет 0,004–241,92 мл дм-3. В водной толще и донных осадках Селенгинского мелководья метана содержится 0,58–3,96 мкл дм-3 и 0,02–401,2 мл дм- соответственно. Максимальные концентрации СН4 выявлены в районах выхода основных проток в Байкал. Скорость метанокисления в водной толще и донных осадках дельты Селенги и Селенгинского мелководья достигает до 0,01 мкл и 27,62262 мл СН4 дм-3 сут- соответственно. Наибольшие значения скорости бактериального окисления метана отмечаются в дельте Селенги и на выходе реки в Байкал, минимальная – в районе открытого озера. Количественная оценка распределения углерода метана показала, что от 1 до 43,8 % углерода метана окисляется до СО2.

Экосистемы устьев рек Баргузин и Верхняя Ангара также отличаются высокой активностью микробных сообществ. Суточная скорость темновой ассимиляции СО2 в водной толще этих экосистем составляет 0,06–1,53 мкг С дм-3 сут-1 (Баргузин) и 1, (Верхняя Ангара). Потребление метана метанотрофным сообществом в этих районах в сутки может достигать до 6,69–1792 мкл СН4 дм-3. В процессе метанокисления от 33,7 до 98,5 % углерода метана окисляется до СО2.

В прибрежных болотных экосистемах озера Байкал скорость темновой ассимиляции СО2 составляет 0,0005–4,19 мг С дм-3 сут-1. При этом вклад хемотрофных бактерий в фиксацию углекислоты местами может достигать 95 % от суммарной ассимиляции СО2.

Суточная скорость бактериального восстановления сульфатов составляет 0,00002–120, мкг S дм-3 сут-1. Скорость биогенного образования метана в болотных экосистемах достигает до 305,5 мкл СН4 дм-3 сут-1. Основная часть метана в этих местообитаниях образуется из СО2 и Н2. Бактериальное окисление метана в болотных экосистемах протекает со скоростью 8,29–181,6 мкл СН4 дм-3 сут-1. Количественная оценка распределения углерода метана в процессе его окисления показала, что в СО2 переходит до 82 % углерода метана. На терминальных этапах деструкции органического вещества большая часть Сорг используется на образование биогенного метана – до 1,2 мг С дм-3 сут, на восстановление сульфатов в сутки используется до 90,4 мкг С дм-3.

Таким образом, полученные результаты показывают, что в зонах геохимических барьеров озера Байкал интенсивно протекают биогеохимические процессы круговорота углерода с участием микробных сообществ. В этих экосистемах формируются специфические микробные сообщества, для которых характерна высокая активность гетеротрофных и хемолитотрофных бактерий, бактерий участвующих на терминальном этапе деструкции органического вещества.

Работа выполнена при финансовой поддержке программы президиума РАН «Происхождение и эволюция атмосферы» проект № 18.10, грантов Президиума СО РАН № 24 и 58, Министерства образования и науки РФ «НОЦ-Байкал».

ПЛАЗМИДНЫЙ КОНТРОЛЬ ПРИЗНАКА УТИЛИЗАЦИИ ГЛИЦЕРОЛА У PSEUDOMONAS PUTIDA К. В. Волкова Институт микробиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь В последние годы интенсивно изучаются генетические системы, контролирующие деградацию органических соединений бактериями. Основными направлениями этих исследований являются выяснение механизмов эволюции у бактерий способности к деградации новых синтетических соединений, изучение механизмов распространения этого свойства между бактериями различных таксономических групп и, наконец, изучение возможности практического использования бактерий, обладающих таким свойством, для очистки окружающей среды от загрязнения токсичными органическими соединениями.

Ранее нами был выделен и идентифицирован штамм Pseudomonas putida MK55, способный утилизировать диметиловый эфир орто-фталевой кислоты (ДМФ) токсичный слаборастворимый субстрат, широко применяемый в промышленности как пластификатор, растворитель, репеллент, а также используемый при изготовлении косметики, смазочных материалов, тканей и пр. Было показано, что гены, ответственные за деструкцию ДМФ, расположены на крупной (100 т.п.н.) конъюгативной плазмиде pMK55.

Путем обработки клеток деструктора элиминирующим агентом митомицином С (15мкг/мл) были получены: бесплазмидный вариант MK55/Е, утративший способность деградировать как ДМФ, так и о-фталевую кислоту, а также штамм MK55/PE, который не способен расти на ДМФ, утилизирует о-фталат и сохраняет плазмидную ДНК.

Методом транспозонового мутагенеза с использованием mini-Tn5KmxylE ранее нами была была создана коллекция мутантных вариантов Ps. putida MK55, дефектных по деструкции ДМФ и/или орто-фталата (ОФК). В данной работе использованы 2 типа мутантов: ДМФОФК и ДМФОФК+.

В процессе проверки способности мутантных и элиминантных клонов утилизировать различные источники углерода, было установлено, что у некоторых из них наблюдается нарушение либо полная утрата способности использовать в качестве единственного источника углерода и энергии глицерин.

В последующих экспериментах определялись характер и скорость роста выделенных мутантных и элиминантных клонов. Установлено, что локальные повреждения генов деструкции ДМФ, вызванные встраиванием в них транспозона Tn5, не влияют на эффективность утилизации глицерина клетками Ps. putida MK55 скорость роста мутантов в присутствии данного источника углерода сходна с таковой у клеток дикого типа.

Однако утрата катаболитных генов, связанная с полной либо частичной элиминацией плазмидной ДНК, сопровождается значительными нарушениями способности к росту на глицерине: если клетки штамма MK55/PE, не утилизирующего ДМФ, но растущего на о фталевой кислоте, сохраняют способность к слабому росту на глицерине, то элиминант MK55/Е, не растущий ни на ДМФ, ни на ОФК, полностью утрачивает это свойство.

Электрофоретический анализ использованных в работе мутантных и элиминантных клонов показал, что полная утрата способности к утилизации глицерина сопровождается исчезновением плазмиды биодеградации pMK55.

На основании полученных данных можно предположить, что плазмида биодеградации pMK55, ответственная за деструкцию диметилфталата, несет в своем составе также либо гены, отвечающие за утилизацию глицерина, либо регуляторные гены, нарушение функции которых приводит к нарушению признака glp+.

Ранее было показано, что нарушение способности к росту на глицерине у бактерий может быть вызвано нарушением функционирования фосфоенолпируватзависимой фосфотрансферазной системы (ФТС), катализирующей транспорт и сопряженное с ним фосфорилирование различных углеводов и их производных. В связи с этим нами была также изучена способность мутантных и элиминантных клеток Ps. putida MK55 к росту на основном ФТС-субстрате глюкозе. Установлено, что в присутствии глюкозы в качестве единственного источника углерода и энергии скорость роста клеток всех использованных в работе мутантных и элиминантных клонов такая же, как и у клеток дикого типа, что отчасти свидетельствует о нормальном функционировании ФТС-генов.

На основании полученных данных можно предположить, что гены, ответственные за утилизацию глицерина культурой Ps. putida MK55, расположены на крупной конъюгативной плазмиде биодеградации pMK55. Не исключено, что они являются физически сцепленными с генами, отвечающими за синтез ДМФ-эстеразы. Данное предположение было сделано исходя из того, что частичная элиминация плазмидной ДНК, сопровождающаяся исчезновением эфиргидролизующей активности, была сопряжена с заметным снижением способности утилизировать глицерин, в то время как нарушение функционирования эстеразных генов, вызванное встраиванием в них транспозона Tn5, не влияет на скорость роста клеток в присутствии данного источника углерода.

ЭМИССИЯ МЕТАНА И ЧИСЛЕННОСТЬ МЕТАНОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ В РАЗЛИЧНЫХ ЛОКУСАХ СФАГНОВОГО БОЛОТА: ВЛИЯНИЕ ДОМИНИРУЮЩИХ РАСТИТЕЛЬНЫХ АССОЦИАЦИЙ А. В. Воробьев 1, М. В. Глаголев2, С. Н. Дедыш Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Факультет Почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия vorobievalexey@mail.ru Северные болотные экосистемы являются крупнейшим естественным источником парникового газа метана. Наиболее обширные площади болот расположены в России, причем большая их часть сосредоточена в Западной Сибири. Эмиссия метана из западносибирских болот варьирует в широком диапазоне, от 0.20 до 40 мг С–СH4 ч-1 м- (Паников и др. 1997, Глаголев, Смагин, 2006). Даже в пределах одного и того же болотного массива величины эмиссии СH4 могут существенно отличаться. Одним из ряда факторов, обуславливающих разницу в величинах эмиссии, является неоднородность растительного покрова. В частности, полагают, что присутствие в составе растительного сообщества высших сосудистых растений существенно облегчает выход метана в атмосферу (Whiting, Chanton, 1992). Такой транспорт части метана растениями позволяет избежать его окисления бактериальным метанотрофным «фильтром», развивающимся в приповерхностных аэробных слоях болотного профиля. Исследований же активности и структуры этого «фильтра», формирующегося под различными растительными ассоциациями, до сих пор не проводилось. Целью настоящей работы была сравнительная оценка эмиссии СH4 и активности, а также структуры метанотрофного сообщества в различных локусах сфагнового болота с доминированием или, напротив, минимальным присутствием сосудистых растений.

Исследования были проведены в июле-августе 2005 года на олиго-мезотрофном сфагновом болоте Бакчарское, Томская обл. (5651’N, 8251E). В пределах болота был выделен ряд локусов с доминированием Carex spp. и ряд локусов с доминированием Sphagnum spp., и проведено измерение потоков метана камерным методом. Для последующих исследований были выбраны 3 локуса с преобладанием осоки и 3 локуса с покровом сфагнума без осоки, находящиеся в непосредственной близости друг от друга и имеющие одинаковый уровень стояния воды (3 см) и сходные значения pH (4.4-4.6). Из этих локусов были отобраны образцы торфа до глубины 50 см с интервалом 10 см, часть которых была использована в инкубационном эксперименте для определения потенциальной метанокисляющей активности, а часть – зафиксирована для дальнейшего учета клеток метанотрофных бактерий методом in situ гибридизации с 16S рРНК специфичными флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH).


Величины эмиссии метана в исследованных локусах болота Бакчарское варьировали в диапазоне от 2.26 до 14.23 мг С–СH4 ч-1 м–2, причем наблюдалась четкая положительная зависимость между величиной эмиссии СH4 и процентом присутствия осоки в составе растительной ассоциации. Потенциальная активность окисления метана была максимальна в верхнем, 0–10 см слое торфа как в локусах под сфагнумом, так и в локусах с осокой, и убывала с глубиной. Однако абсолютные значения этой активности были выше в торфе под сфагнумом (3.2±0.3 мг С-СH4 ·дм-3·сут-1 в слое 0-10 см), чем под осокой (2.4±0.02 мг С–СH4 ·дм-3·сут-1). Суммарная активность метанокисляющего «фильтра» в толще торфа 0–50 см также была выше в локусах без осоки.

Общая численность метанотрофных бактерий, выявленных методом FISH в слое 0- см, в локусах под Carex spp. варьировала в диапазоне 0.86–2.91106 клеток г-1 сырого торфа, в то время как в локусах под сфагнумом она была значительно выше–от 4. до 1.39107 клеток г-1 торфа, что хорошо согласовывается с данными определения метанокисляющей активности образцов. Численность метанотрофов I типа (гибридизация с зондами М84 + М705) была незначительной во всех образцах торфа (0.29–6.3105 кл г-1).

Обнаруженные в торфе метанотрофы II типа были представлены двумя группами:

Methylosinus/Methylocystis (детекция зондом М-450) и Methylocella/Methylocapsa (зонды Mcell-1026/Mcaps-1032). Численность клеток представителей Methylocella/Methylocapsa была приблизительно одинакова во всех образцах – 0.86–8.1105 кл г-1, что составляло не более 6% общей численности метанотрофов, в то время как представители группы Methylosinus/Methylocystis явно доминировали в составе сообщества и составляли до 95% всех метанотрофов. Примечательно, что максимальных значений численность группы Methylosinus/Methylocystis достигала в локусах с доминированием Sphagnum spp., где она составляла до 1.3107 клеток г-1 сырого торфа.

Итак, данное исследование показало, что как общая численность метанотрофов, так и потенциальная активность метанотрофного «фильтра» значительно ниже в локусах с доминированием осоки по сравнению с локусами без нее, что, помимо прямого транспорта метана растениями, также обуславливает высокие значения эмиссии СH4 с участков болот, занятых сосудистыми растениями.

1. Паников Н.С. и др. 1997. - Экологическая химия. Т. 6, № 1. С.59-67.

2. Глаголев М.В., Смагин А.В. 2006. - Доклады по экологическому почвоведению. №3.

вып.3. С. 75-114.

3. Whiting GJ, Chanton JP. 1992. - Global Biogeochemical Cycles, 6, 225-231.

БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ФЕНИЛМЕТИЛСУЛЬФИДА (ТИОАНИЗОЛА) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗОВАНЫХ КЛЕТОК РОДОКОККОВ А. Ю. Гаврин1, А. А. Елькин Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Пермский государственный университет, Пермь, Россия Стереоселективное окисление серосодержащих углеводородов в оптически активные сульфоксиды – одно из интенсивно развивающихся направлений современного ферментного катализа. Интерес к данным соединениям обусловлен возможностью их использования в качестве противовоспалительных и антибактериальных препаратов.

Актинобактерии рода Rhodococcus катализируют энантиоселективное окисление фенилметилсульфида (тиоанизола) и его гомологов в соответствующие сульфоксиды с высокой оптической чистотой [1]. В настоящее время для создания высокоэффективных биокатализаторов на основе живых бактериальных клеток широко используются методы иммобилизации микроорганизмов в гелях различной природы. Криогели на основе поливинилового спирта – макропористые, гетерофазные гели, которые образуются при неглубоком замораживании, выдерживании в замороженном состоянии и последующем оттаивании концентрированных растворов данного полимера [2]. В настоящее время криогели поливинилового спирта находят все более широкое биотехнологическое и медицинское применение в качестве носителей иммобилизованных микробных клеток и ферментов.

Цель настоящего исследования – разработка эффективного биокатализатора процесса окислительной трансформации тиоанизола на основе иммобилизованных клеток алканотрофных родококков.

В работе использовали штамм R. rhodochrous ИЭГМ 66 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, http//:www.iegm.ru/iegmcol). Родококки предварительно выращивали в минеральной среде в присутствии н-гексадекана. Для приготовления криогеля использовали поливиниловый спирт (ОАО «Азот», Невинномысск). Иммобилизацию бактериальных клеток проводили путём внесения клеточной суспензии в раствор поливинилового спирта в соотношении 1:2. Формирование гранул осуществляли в микролуночном иммунологическом планшете.

Полученные образцы замораживали при –15°С в течение 12 ч, а затем оттаивали при 4°С на протяжении 5 ч [3]. Окислительную активность свободных и иммобилизованных клеток родококков в отношении тиоанизола исследовали в условиях соокисления с глицерином. Качественный состав продуктов биотрансформации контролировали методом тонкослойной хроматографии. Продукты трансформации тиоанизола анализировали с помощью хромато-масс-спектрометрического метода.

По нашим данным, биотрансформация тиоанизола свободными клетками родококов наиболее эффективно протекает в условиях соокисления с глицерином. Показано, что максимальный уровень биоконверсии сульфида достигается при внесении сульфидного субстрата в среду культивирования через двое суток от начала эксперимента, когда культура находится в логарифмической фазе роста. В этом случае целевой сульфоксид обнаруживается уже через 24 ч, а полное исчезновение исходного субстрата отмечается на 4-е сут, при переходе культуры в раннюю стационарную фазу роста. Именно в этот момент наблюдается наиболее оптимальное соотношение образуемых метаболитов, целевого продукта – сульфоксида и побочного продукта – оптически неактивного сульфона тиоанизола.

При использовании иммобилизованных клеток родококков полная конверсия тиоанизола наблюдается уже через 24 часа после начала инкубирования в неростовых условиях. При этом регистрируется образование 74% сульфоксида и 26% сульфона тиоанизола, в присутствии глицерина обнаруживается снижение содержания побочного сульфона до 7%. Кроме того, использование иммобилизованных клеток родококков позволяет миновать двухдневную подготовительную стадию и достигать полной биоконверсии тиоанизола в течение 24 ч при условии одновременного введения биокатализатора и тиоанизола.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют об эффективности полученного биокатализатора на основе иммобилизованных в криогеле клеток родококков и перспективности его использования в процессах окислительной трансформации тиоанизола.

Авторы выражают глубокую благодарность своим научным руководителям и наставникам чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной и к.х.н. В.В. Гришко за постоянное внимание и неоценимую помощь в работе.

1. Толстиков А.Г., Гришко В.В., Ившина И.Б. Энантиоселективное биокаталитическое окисление органических сульфидов в хиральные сульфоксиды // В кн.:

Современные проблемы асимметрического синтеза. Екатеринбург: УрО РАН.

2003. С. 165-205.

2. Lozinsky V.I. Cryogels on the basis of natural and synthetic polymers: preparation, properties and applications // Rus. Chem. Rev. 2002. № 6. P. 489-511.

3. Kuyukina M.S., Ivshina I.B., Gavrin A.Yu., Podorozhko E.A., Lozinsky V.I., Jeffree C.E., Philp J.C. Immobilization of hydrocarbon-oxidizing bacteria in poly(vinyl alchohol) cryogels hydrophobized using a biosurfactant // J. Microbiol. Methods. 2006. V. 65.

P. 596-603.

МИКРООРГАНИЗМЫ–ДЕСТРУКТОРЫ МОНО– И ДИХЛОРФЕНОЛОВ Е. М. Глушень, А. С. Самсонова Институт микробиологии НАНБ, Минск, Беларусь Выделение микроорганизмов-деструкторов хлорированных фенолов проводили методом накопительных культур с использованием почв, загрязненных ароматическими веществами и активного ила очистных сооружений предприятий органического синтеза.

Из 36 выделенных в чистую культуру микроорганизмов-деструкторов отобрано штаммов, обильно растущих на минеральной среде с изомерными моно- и дихлорфенолами в концентрации 200 мг/л. Наиболее активные микроорганизмы деструкторы монохлофенолов идентифицированы как Rhodococcus opacus, Rhodocoссus erythropolis, Rhodococcus ruber, Pseudomonas fluorescens, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, дихлорфенолов как Bacillus cereus, Bacillus licheniformis. Поиск микроорганизмов-деструкторов хлорированных фенолов, наиболее полно отвечающих требованиям для разработки микробной технологии очистки воды и почвы от данных токсикантов, провели среди культур, обладающих активным ростом на среде, содержащей их в качестве источника питания. Разрушение хлорфенолов полученными бактериальными культурами проводили с учетом характерных особенностей строения молекул токсикантов, а также систематической принадлежности наиболее активных микроорганизмов-деструкторов.

Культура Pseudomonas fluorescens 106B разрушает 2-, 3- и 4-хлорфенол в концентрации 100 мг/л за 48 часов на 17,0;


31,2 и 57,9%, а за 144 часа на 69,6, 95,9 и 98, % соответственно. Штамм Bacillus coagulans 1710 трансформирует 2-ХФ за 48 часов всего на 3,4%, а за 144 часа на 48,2 %. 3-ХФ трансформируется данным штаммом за 48 часов на 9,9%, а эффективность деградации токсиканта за 144 часа составляет 65,2 %. Всего 11,5 % 4-ХФ утилизируется бациллой через 48 часов. 144 часа требуется ей для разрушения 4-ХФ на 69,5 %.

Изученные нами представители рода Rhodococcus наиболее активно разрушают монохлорфенолы. 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ разрушаются R. ruber 88 за 48 часов на 40,6;

22, и 5,9%, и на 95,1;

96,3 и 97,1% за 144 часа соответственно. Активность деструкции монохлорфенолов в концентрации 100 мг/л культурой R. erythropolis 5Д возрастает в ряду 2-,3-, 4-ХФ. Полное разрушение 2-ХФ, 3-ХФ и 4-ХФ осуществляется за 72, 48 и 24 часа соответственно культурой R. opacus 31Д.

Анализ полученных результатов свидетельствует о снижении эффективности трансформации монохлорфенолов микроорганизмами-деструкторами в ряду 4-хлор3 хлор2-хлорфенол.

Изучение трансформации наиболее труднометаболизируемого 2-хлорфенола в концентрации 100 и 200 мг/л исследованными культурами R. ruber 7ХФ, R. erythropolis 3В, Bacillus sp. 96В, B. licheniformis 16ХФ и Pseudomonas fluorescens 106B подтверждает вывод о том, что наиболее высокая деструктивная активность характерна для микроорганизмов-деструкторов рода Rhodococcus. 2-ХФ в концентрации 100 мг/л разрушается на 100 % культурами R. ruber 7ХФ и R. erythropolis 3В за 24 и 48 часов соответственно. Полное разрушение токсиканта в концентрации 200 мг/л отмечается через 144 часа в среде культивирования R. ruber 7ХФ, а культура R. erythropolis 3В трансформирует 2-ХФ за это же время на 90 %. Культура Bacillus sp. 96В разлагает 2-ХФ в концентрации 100 и 200 мг/л за 144 часа на 100 и 98,2 %, а культура B. licheniformis 16ХФ за это же время на 99,8 и 99 % соответственно.

Таким образом, эффективность превращения монохлорфенолов исследованными микроорганизмами зависит от положения хлорзаместителя в ароматическом кольце их молекулы и уменьшается в направлении 4-хлор-, 3-хлор-, 2-хлорфенол. Наиболее высокая эффективность трансформации монохлорфенолов выявлена у Rhodococcus opacus 31Д.

Разрушение изомерных дихлорфенолов в жидкой среде наблюдали при культивировании на них R. erythropolis 70Ф и R. opacus 31Д, наиболее активно растущих в присутствии 2,3- и 3,4-дихлорфенолов на агаризованной среде.

Эффективность деструкции 2,3-ДХФ в концентрации 100 мг/л культурой R. opacus 31Д составляет 7,0 и 33,6% через 24 и 48 часов наблюдения соответственно. 3,4-ДХФ в аналогичных условиях разрушается на 16,0 и 44,0% соответственно. Через 72 часа наблюдения эффективность деградации 2,3-ДХФ культурой R. opacus 31Д составляет 37,0, а 3,4-ДХФ 62,0%. Культура R. opacus 31Д разрушает как 2,3-, так и 3,4-ДХФ в концентрации 100 мг/л за 240 часов на 85,0%. Полное разрушение токсикантов родококком отмечается через 312 часов. Эффективность деструкции 2,3-ДХФ в концентрации 100 мг/л культурой R. opacus 31Д составляет 7,0 и 33,6% через 24 и часов наблюдения соответственно. Наиболее активно исследованные дихлорфенолы разрушает культура R. erythropolis 70Ф во все сроки наблюдения. Культура деградирует 2,3-ДХФ и 3,4-ДХФ на 91,0% за 240 часов наблюдения, а полное разрушение изомерных дихлорфенолов отмечается через 288 часов.

На основании деструктивной активности исследованных микроорганизмов разработаны технологии биоремедиации почвы и очистки сточных вод, загрязненных моно- и дихлорфенолами.

КЛИНИЧЕСКИЙ СЛУЧАЙ ДИСБАКТЕРИОЗА У ЛОШАДИ, ВЫЗВАННОГО АНТИБИОТИКОМ: ВЛИЯНИЕ НА БИОРАЗНООБРАЗИЕ КОЛИФОРМНОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА A. К. Голомидова1, A. С. Исаева1, E. Е. Куликов1, A. А. Маныкин2, А. В. Летаров Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва, Россия Институт вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН, Москва, Россия Кобыла 4 летнего возраста в ходе лечения серьёзной травмы конечности получала перорально энрофлоксацин, антибиотик группы фторхинолонов, (Baytril;

Bayer, Germany) на протяжении 35 дней в феврале – марте 2007 г. Вслед за курсом байтрила был проведён трехдневный курс цефалоспоринового антибиотика цефкином (Cobactan;

Intervet, Nederland). На 14 день приёма энрофлоксацина (проба 1), и на 1, 15, 42 и 45 дни после прекращения антибиотикотерапии были отобраны пробы фекалий. Кроме того в нашей коллекции хранился замороженный образец экстракта фекалий этого же животного отобранный за 3 месяца до травмы (проба 0). Во всех пробах, кроме пробы, мы определили титры фекальных колиформных бактерий, и оценили их биоразнообразие используя разработанную нами систему IS1 геномного фингерпринтинга (Golomidova et al. 2007, in press). Несмотря на приём антибиотиков, титры колиформных бактерий находились в пределах нормы во всех пробах (см. таблицу). Однако, уровень генетического разнообразия их штаммов в пробах 1–3 был крайне низким. Так, в пробах и 2 мы обнаружили только по 2–3 эндогенных аутоштамма колиформных бактерий (АКБ) в каждой, в то время как ожидаемый нормальный уровень разнообразия составляет от нескольких сотен до тысяч (Golomidova et al. 2007, in press). Все штаммы выделенные нами из образцов 1 и 2 были устойчивы к энрофлоксацину, но не к цефкиному. АКБ, устойчивые к цефкиному, появлялись только в пробах 3-5, отобранных более чем через две недели после применения этого антибиотика, и мы не связываем их появление в системе с проведённым лечением. Были также определены титры бактериофагов, активных против E. coli C600 и избранных АКБ из проб 1, 2 и 4. Наши результаты указывают на то, что фаговая инфекция может играть значительную роль в сукцессии доминирующих в исследованной системе штаммов АКБ. Мониторинг популяций АКБ и их фагов, выполненный с лучшим разрешением во времени на живтных с модельным лекарственным дисбактериозом может пролить свет на эффект инфекции колифагами на поддержание штаммового разнообразия колиформных бактерий в сообществе кишечника.

Работа поддержана грантом РФФИ № 06-04- Номер Коли- Устойч. Устойч. Разно- Фаги Фаги Фаги Фаги пробы формы, к Enr, к Cefq, образие С600, АКБ 1- АКБ 1- АКБ 4 КОЕ/г на 30 на 30 АКБ, БОЕ/г 1, БОЕ/г 2, 19, вариант БОЕ/г БОЕ/г ов на 2105 0 – – – 0 0 – Продолжение Таблицы 1 4.510 Все – 2 0 Около 104, очень мутные бляшки 2.5105 2 все 0 1 или 3 Около 10–100, близко- 10, Очень род- очень мелк.

ствен- мутных мутные + 3*102 бляшки ных прозр.

бляшек 2.0106 3 0 17 7 0 0 5.0105 4 0 1 15 0 0 10– 1.2106 5 0 8 (22 – 1.110 0 плохой рост) ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ СУСПЕНЗИЙ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI ПРИ ДЕЙСТВИИ КАНАМИЦИНА О. И. Гулий Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия Тел.: +7(8452)970444, Факс: +7(8452)970383, guliy_olga@mail.ru Изучение адаптации микробов к действию антибиотиков является важной медико биологической проблемой, поскольку появление резистентных форм микроорганизмов приводит к снижению их терапевтических свойств. Действие антибиотиков может быть обусловлено различными факторами, которыми могут являться угнетение синтеза клеточной стенки, ингибирование процессов синтеза белка и/или РНК, репликации ДНК, нарушение функционирования мембран. В результате воздействия антибиотиков на микробные клетки могут происходить изменения морфологии клеток, деструкция клеточной мембраны, изменения цитоплазматической мембраны и последующие нарушения биохимических процессов в этих клеточных структурах. Это, в свою очередь, может приводить к изменению электрофизических (ЭФ) свойств микробных клеток и, соответственно, к изменению электрооптических (ЭО) характеристик клеточных суспензий, регистрируемых в экспериментах с использованием электроориентации клеток в электрическом поле. С нашей точки зрения, перспективным направлением исследований является использование метода ЭО анализа клеточных суспензий при воздействии на них антибиотиков, являющихся ингибиторами белкового синтеза, к которым относятся аминогликозидные антибиотики. Проникая через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, они вытесняет ионы магния, расположенные на наружной поверхности внешней мембраны, что приводит к частичной деструкции мембраны. Считаем, что деструкция мембраны в результате проникновения антибиотиков внутрь клетки должны приводить к изменению ЭФ свойств микробных клеток, что и будет служить показателем чувствительности микробных клеток к исследуемому антибиотику. Целью работы являлось изучение влияния канамицина на ЭО параметры клеточных суспензий некоторых штаммов Escherichia coli, различающихся по устойчивости к действию изучаемого антибиотика. Исследовано влияние канамицина на ЭФ свойства клеток E. coli штаммов К-12 и рММВ33. Показано, что при инкубации клеток чувствительного штамма К-12 с канамицином происходит значительное изменение ориентационных спектров (ОС) клеточных суспензий, в то время как для устойчивого штамма рММВ33 таких изменений не зарегистрировано. Изменения в ОС суспензий клеток чувствительного штамма К-12, инкубированных с различными концентрациями антибиотиков, имели место в интервале частот 10-1000 кГц ориентирующего электрического поля. Показано, что максимальное изменение величины ЭО сигнала происходит при концентрации канамицина 10 миг/мл.

Проведены контрольные эксперименты путем стандартного высева на плотные питательные среды. Установлено, что, изменения ОС суспензий при действии антибиотиков можно использовать в качестве теста устойчивости к данным антибиотикам у исследуемых клеток.

Работа была поддержана грантами «Фонда содействия отечественной науке», Президента РФ для молодых кандидатов наук МК-8599.2006.4, государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации НШ-6177.2006.4 и МНТЦ № 3170 PDG.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ПРИРОДНЫХ И ТРАНСГЕННЫХ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ А. А. Гусев1, Т. В. Каргатова2, Л. Ю. Попова Институт биофизики СО РАН МНЦИЭСО КНЦ СО РАН, 660036, Академгородок, Красноярск, Россия ecomicrob@ksc.krasn.ru Экспрессия биолюминесцентных оперонов – параметр, зависящий от структуры оперона и метаболической активности клетки-хозяина. В свою очередь метаболическая активность клетки определяется условиями среды обитания. Эффективность экспрессии биолюминесценции у морских светящихся бактерий оценивали при действии такого фактора как соленость, а у трансгенных бактерий при действии селективного фактора – ампициллина, устойчивость к которому кодируется генами, сцепленными с lux-опероном, клонированным в плазмидной ДНК. Общим фактором, важным для жизнеспособности клеток природных и трансгенных бактерий, является голод, влияние которого оценивалось на экспрессию природного и клонированного биолюминесцентного оперонов из Photobacterium leiognathi. Количественными критериями эффективности экспрессии биолюминесценции служили: копийность lux-оперона (уровень репликации) на клетку, длительность латентного периода в индукции биолюминесценции (уровень транскрипции), максимальная интенсивность свечения (уровень трансляции). В результате анализа экспериментальных данных показано, что для природных светящихся бактерий фактором, определяющим эффективность экспрессии lux-оперона, является уровень транскрипции, а для трансгенных светящихся бактерий - уровень трансляции. В отсутствии лимитирования роста бактерий питательными веществами природные светящиеся бактерии сохраняют зависимость в экспрессии биолюминесценции от латентного периода. Трансгенные светящиеся бактерии в этих же условиях сохраняют зависимость от уровня трансляции, то есть большое количество плазмидной и-РНК препятствует увеличению интенсивности метаболической активности. Наличие селективного фактора усиливает трансляционную активность в сторону плазмид, содержащих клонированные lux- опероны. Причем у штаммов со сниженной копийностью плазмид (регуляция на уровне репликации в сторону повышения метаболической активности клетки) эффективность экспрессии lux- оперона значительно повышается, приводя практически к остановке роста. Для природных светящихся бактерий фактором, приводящим к усилению эффективности экспрессии lux- оперона и к значительному замедлению роста клеток, является повышение солености среды. Проведены расчеты изменения биолюминесценции природными и трансгенными штаммами в меняющихся условиях окружающей среды. Использованы следующие количественные критерии и коэффициенты: F1 - число копий lux-оперонов на клетку (для природных морских бактерий 1 оперон в хромосоме, для трансгенных светящихся бактерий с рекомбинантными плазмидами показатель варьирует в зависимости от штамма измеряется с помощью программы Scion Image);

F2 – время начала индукции биолюминесценции (при t = 0, F2 = 1, при t 0, F2 = 1/t);

F3 – продукция биолюминесценции (измеряется на биолюминометре и переводится в кванты/сек).

Полученные данные могут позволить оценить экологическую роль биолюминесценции для морских светящихся бактерий как антистрессового для выживаемости клеток фактора. Для трансгенных светящихся бактерий экологическая роль биолюминесценции может играть сходную роль, что может объяснить лучшую выживаемость трансгенного штамма E. coli Z905/pPHL7 по сравнению с бесплазмидным штаммом E. coli K-12 в водных микрокосмах разного уровня сложности.

Работа поддержана грантом РФФИ 04-05- ШТАММ RHODOCOCCUS RUBER Р25 КАК ПЕРСПЕКТИВНЫЙ БИОДЕСТРУКТОР ХЛОРАРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ Д. О. Егорова1, И. П. Соляникова2, Л. А. Головлева2, Е. Г. Плотникова Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия Полихлорированные бифенилы (ПХБ) входят в группу стойких органических загрязнителей и принадлежат к 1 классу опасности химических соединений. ПХБ на протяжении нескольких десятилетий широко использовались в промышленности, поэтому уровень загрязненности окружающей среды данными соединениями очень высок. В связи с этим вопрос об очистке окружающей среды от ПХБ стоит в наше время очень остро.

Основную роль в разложении ПХБ в природе играют микроорганизмы, но биодеструкция ПХБ в большинстве случаев завершается на стадии образования хлорбензойных кислот, химически стабильных и токсичных соединений. Нами выделен штамм Rhodococcus ruber P25, осуществляющий полную утилизацию ряда индивидуальных ПХБ и их смесей.

Исследование ферментативных систем деструкции ПХБ является необходимым этапом в создании эффективных биопрепаратов для ремедиации территорий, загрязненных ПХБ.

Цель данного исследования – изучение ферментативных систем Rhodococcus rubber Р25, ответственных за разложение 4-хлорбензойной кислоты (4-ХБК), промежуточного метаболита пути разложения полихлорированных бифенилов.

Из штамма R. ruber P25 выделен фермент пара-гидроксибензоат-3-гидроксилаза (ПГБГ), осуществляющий окисление пара-гидроксибензойной кислоты (ПГБ), первого продукта бактериального разложения 4-ХБК, до протокатеховой кислоты (ПКК).

Показано, что фермент имеет две субъединицы молекулярной массой 43 кДа и 45кДа.

Установлено, что удельная активность ПГБГР25 составляет 11,67 мкмоль/мин*мг, КmПГБ = 9,85 мкМ, КmNADH = 14,2 мкМ. Удельная активность ПГБГР25 при внесении NAD(P)H составляет 14,25% от удельной активности ПГБГР25 при внесении NADH. Выделенная протокатехат диоксигеназа предположительно осуществляет раскрытие ароматического кольца в положении 4-5. Удельная активность фермента составляет 15 мкмоль/мин*мг белка, КmПКК = 5,26 мкМ, VmaxПКК = 11,91 мкМ. Фермент инактивируется при нагревании в течение 5 мин при 60°С. Таким образом, штамм R. ruber P25 обладает активной ферментативной системой, обеспечивающей разложение 4ХБК через стадии образования ПГБ и ПКК до соединений основного обмена.

Исследования поддержаны грантами РФФИ-Урал №04-04-96042, № 07-04-97625_офи.

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА МЕТИЛОТРОФНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ПОЛИГИДРОКСИБУТИРАТА/ВАЛЕРАТА Б. Ц. Ешинимаев, А. А. Лапин, Д. Л. Хрульков Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Россия Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Аэробные метилотрофы – уникальная группа бактерий, использующих метан (метанотрофы) или его окисленные и замещенные производные (метилобактерии) как источники углерода и энергии. Эти бактерии играют важную роль в глобальном цикле восстановленных С1-соединений, уменьшая их эмиссию и вклад в парниковый эффект, а также осуществляя деградацию токсичных поллютантов. Кроме того, аэробные метилотрофы обладают значительным метаболическим потенциалом для практического использования.

В настоящее время развитие различных отраслей народного хозяйства выдвигает проблему утилизации загрязняющих окружающую среду твердых отходов, среди которых 90% занимают персистентные пластмассы. В связи с этим разработка и производство деградабельных биопластиков – полигидроксибутирата (ПГБ) и полилактона, являются важными задачами микробной биотехнологии. Наибольшее внимание привлекает ПГБ и его сополимер с валератом ПГБ/В, используемые в биомедицине, сельском хозяйстве и нанотехнологии. В настоящее время ПГБ/В получают с использованием высших растений и гетеротрофных бактерий, в том числе генетически модифицированных штаммов E. coli.

Ввиду низкой стоимости и доступности метана и метанола производство ПГБ/В на их основе является перспективным направлением биотехнологии.

Целью нашей работы является конструирование метилотрофных продуцентов ПГБ с высокими выходами и высокой молекулярной массой. Работа проводится по двум направлениям:

1) Изучение физиологических параметров роста и накопления ПГБ и ПГБ/В у метанотрофов и метилобактерий;

2) Получение метаболически модифицированных мутантов и трансформантов метилотрофных бактерий с повышенным уровнем синтеза ПГБ/В и высокой пластичностью биополимера.

Скрининг метилобактерий выявил Methylobacterium extorquens G10 в качестве перспективного продуцента ПГБ и ПГБ/В. Наработаны опытные партии полимеров, которые тестируются на возможность использования в биомедицине и нанотехнологии.

Для создания генетически и метаболически модифицированных метилотрофных бактерий - метанотрофа Methylosinus trichosporium OB3b и метилобактерии M. extorquens G10, нами получены генетические конструкции в плазмидных векторах, в составе которых находятся гены нитрогеназы (nifd и nifh), изоцитратлиазы (aceA), ПГБ-деполимеразы (depA) и ПГБ-синтазы (phaC).

Предположено, что инактивация генов нитрогеназы способствует оттоку НАД(Ф)Н с конкурирующего биохимического пути азотфиксации на биосинтез ПГБ. Инактивацию оперона nifHD проводили путем делетирования 5’- и 3’-концевой части генов nifH и nifD.

Встраиванием в делетированный участок ДНК кассеты устойчивости к гентамицину (плазмиды p34S-Gm) получены мутанты Ms. trichosporium OB3b по генам nifHD. Для снижения экспрессии деполимеразы ген depA инактивировали посредством введения кассеты устойчивости к канамицину (pK18 mob).

Предположено также, что введение гена aceA из E. coli Jm-109 в Ms. trichosporium OB3b и M. extorquens G10, не имеющих изоцитратлиазы (ицл-), т.е. глиоксилатного шунта, изменит их метаболическую организацию, благодаря дополнительному синтезу глиоксилата (глицина) – первичных апкцепторов С1-единиц в сериновом пути, и тем самым усилит биосинтетические процессы в целом, включая синтез ПГБ. С этой целью получен трансформант M. extorquens АМ1, который имеет ген aceA в плазмидном векторе и экспрессирует изоцитратлиазу (ицл+). Методом ВЭЖХ у данного трансформанта выявлено увеличение выхода ПГБ на 6% относительно исходного штамма. Для транскрипции гена aceA в M. extorquens G10 введен промотор гена большой субъединицы метанолдегидрогеназы pmxaF. В дальнейшем планируется использовать эту конструкцию для получения мутанта M. extorquens G10 со встроенным геном aceA.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 



Похожие работы:





 
© 2013 www.libed.ru - «Бесплатная библиотека научно-практических конференций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.